| 【発明の名称】 |
蛍光検出電気泳動用冷却板および蛍光検出電気泳動装置 |
| 【発明者】 |
【氏名】松本 浩幸
【氏名】伊藤 由紀子
【氏名】久田 素
【氏名】石田 雅之
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| 【要約】 |
【課題】蛍光性試料で標識した試料が恒温でゲル内で電気泳動している様子を蛍光検出により高感度に行うことができる蛍光検出電気泳動装置等を提供する【解決手段】 励起光源１３の上に蛍光検出電気泳動用冷却板１１を載置し、蛍光検出電気泳動用冷却板１１の上にゲル保持体２１を載置して、ゲル２２の上に電極１２Ａおよび１２Ｂを互いに平行に所定距離を隔てて配置する。冷却材循環装置１８を作動させ、蛍光検出電気泳動用冷却板１１の内部に冷却材を循環させてゲル２２を恒温に維持する。その後、電気泳動用電源１７により電極１２Ａと電極１２Ｂとの間に高電圧を印加して、蛍光性試料をゲル２２内で電気泳動させる。励起光源１３から出力され蛍光検出電気泳動用冷却板１１およびゲル保持体２１を透過した励起光をゲル２２に照射することで蛍光性試料を励起し、この蛍光性試料から発生した蛍光を蛍光検出器１５により撮像する。
【解決手段】励起光源１３の上に蛍光検出電気泳動用冷却板１１を載置し、蛍光検出電気泳動用冷却板１１の上にゲル保持体２１を載置して、ゲル２２の上に電極１２Ａおよび１２Ｂを互いに平行に所定距離を隔てて配置する。冷却材循環装置１８を作動させ、蛍光検出電気泳動用冷却板１１の内部に冷却材を循環させてゲル２２を恒温に維持する。その後、電気泳動用電源１７により電極１２Ａと電極１２Ｂとの間に高電圧を印加して、蛍光性試料をゲル２２内で電気泳動させる。励起光源１３から出力され蛍光検出電気泳動用冷却板１１およびゲル保持体２１を透過した励起光をゲル２２に照射することで蛍光性試料を励起し、この蛍光性試料から発生した蛍光を蛍光検出器１５により撮像する。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ゲル中で電気泳動する蛍光性試料に励起光を照射して前記蛍光性試料から発生する蛍光を検出する蛍光検出電気泳動装置において前記ゲルを冷却する蛍光検出電気泳動用冷却板であって、前記ゲルを載置する第１の面とは反対側の第２の面の側より入射した前記励起光を前記第１の面の側へ透過させる部材からなり、前記第１の面と前記第２の面との間の空間に冷却材を循環させて前記ゲルを冷却する冷却手段を有することを特徴とする蛍光検出電気泳動用冷却板。
【請求項２】 ゲル中で電気泳動する蛍光性試料に励起光を照射して前記蛍光性試料から発生する蛍光を検出する蛍光検出電気泳動装置であって、前記ゲルを載置する第１の面とは反対側の第２の面の側より入射した前記励起光を前記第１の面の側へ透過させる部材からなり、前記第１の面と前記第２の面との間の空間に冷却材を循環させて前記ゲルを冷却する冷却手段を有する蛍光検出電気泳動用冷却板と、前記ゲル中に電場を形成する１対の電極と、前記蛍光検出電気泳動用冷却板の前記第２の面の側に設けられ、前記蛍光検出電気泳動用冷却板へ前記励起光を照射する励起光源と、前記蛍光検出電気泳動用冷却板の前記第１の面の側に設けられ、前記ゲル中の蛍光性試料から発生した蛍光を撮像する蛍光検出器と、を備えることを特徴とする蛍光検出電気泳動装置。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ゲル中で電気泳動する蛍光性試料に励起光を照射して前記蛍光性試料から発生する蛍光を検出する蛍光検出電気泳動装置、および、この蛍光検出電気泳動装置においてゲルを冷却する蛍光検出電気泳動用冷却板に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】電荷を有する粒子を電解質溶液に浮遊させ、この電解質用溶液に電流を通ずると、荷電の極性と反対の方向に向かって粒子が移動する。この電気泳動現象は、1892年にPicton,H.とLinder,S.E.とによって観察されて以来、物質の分離・分析の手段として用いられるようになり、1837年にTiseliusが電気泳動装置を完成させてからは今日まで急速に応用が拡大されてきている。
【０００３】1960年代初めに、ガラス管の内部にアクリルアミドを重合させてゲルを作り、そのゲル内でタンパク質の電気泳動を行う手法が開発された。これはポリアクリルアミドゲル電気泳動を称される。現在では、ポリアクリルアミドゲルとアガロース（寒天の主成分）のゲルとが電気泳動の媒体として主に用いられている。このゲル中での電気泳動は、電解質溶液では問題であった対流の発生がゲルの内部では発生することがなく、外界からの振動の影響も受けにくい等、多くの利点がある。
【０００４】一般の電気泳動が或る特定のｐＨにおける荷電状態の差を利用しているのに対して、1966年にVesterberg,0.とSvensson,H.とが合成両性電解質であるアンフォラインを開発してからは、それぞれの両性電解質が或る値のｐＨにおいて、その実効電荷がゼロになり、泳動しなくなる現象を利用した等電点電気泳動法が確立された。ここで、実効電荷がゼロとなるようなｐＨの値をその物質の等電点という。等電点電気泳動では、試料は、泳動用担体に形成されたｐＨ勾配において、その等電点に等しい位置に濃縮されて静止する。このように、等電点電気泳動法は、試料が焦点的に濃縮されて分離されるので、非常に高い分解能を有する電気泳動法として、物質の分離・分析に知用されている。
【０００５】ゲルを用いた電気泳動を行う際には専用の電気泳動装置が必要となる。通常、ゲルの両端が電極液に触れるよう、２枚のガラス板等に挟まれたゲルを電極液の入った泳動槽内に垂直に立て、泳動槽にある電極に通電することで電気泳動が行われる。
【０００６】また、最近では、ゲルを水平にして電気泳動を行う水平型電気泳動装置が用いられている。この水平型電気泳動装置は、恒温水を循環させて温度を恒温に保つ冷却板を有しており、この冷却板上に載置したゲル内で電気泳動を行うことで、通電に因るゲルの温度上昇に基づく分離される試料のバンドの歪み（スマイリング）を防ぐことができる。特に高電圧を印加するゲル等電点電気泳動においては、ゲルを冷却する機能を有する水平型電気泳動装置が最も一般的に用いられている。
【０００７】ゲル電気泳動において、ゲル内に分離された試料のバンドを検出する際には、通電を停止した後にゲルを電気泳動装置から除いて行っていた。このバンドを検出する方法として、ゲルを染色液に浸漬する方法、銀染色法および蛍光検出法等がある。
【０００８】ゲルを染色液に浸漬することでゲル内に分離された試料のバンドを染色して検出する方法は、最も一般的に用いられている。染色に用いる色素としては、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０が最も一般的である。しかし、この方法は検出感度が低いという問題点がある。これに対して、銀染色法は検出感度が高い。しかし、銀染色法は、操作が煩雑であり、爆発性の廃棄物が生じることから特別な処理が必要となる等も問題点がある。
【０００９】蛍光検出法は、検出感度が高く、操作が煩雑ではない。蛍光検出法は、予め分析試料を蛍光性試料で標識しておき、分離された試料に励起光を照射して、これから発せられる蛍光を検出するものである。分析試料を蛍光性試料で標識するにあたっては、分析試料がタンパク質である場合、タンパク質のアミノ基と蛍光性試料とを化学的に結合させる方法が一般的である。例えば、アミノ基に結合させる蛍光性試料として、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate, FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC）等が知られている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら何れの検出法も、通電を停止した後にゲルを電気泳動装置から除いてバンドを検出するものである。特にゲル等電点電気泳動において、等電点に一旦収束した試料は、通電を停止した後に直ちに拡散を始めてしまうことから、ゲル内に分離された試料のバンドを正確に検出することができない。
【００１１】ところで、もし、ゲル電気泳動において、電気泳動中にゲル内で分離される試料の分離状態を観察することができれば、電場における試料の挙動等の知見を得る上で有用である。とくに、ゲル等電点電気泳動においては、試料が収束する過程を観察することができれば、ゲルに形成されたｐＨ勾配中での試料の荷電情報等の貴重な情報を得る上で重要である。このように、予め蛍光性試料で標識した試料を用いてゲル電気泳動を行い、通電を停止することなく、また、ゲルを電気泳動装置から除くこともなく、ゲル内で分離される試料の分離状態を観察することができれば、極めて高感度に様々な情報を得ることができる。
【００１２】予め蛍光性試料で標識した試料をゲル内で電気泳動させて観察する蛍光検出電気泳動装置は、例えば特開平７−１５１６８７号公報に開示されている。この公報に開示された蛍光検出電気泳動装置は、励起光を照射した側と同一の側で蛍光を検出するものである。この公報にはゲルの冷却については何ら記載されてはいない。また、特開平８−３５９４９号公報に開示された電気泳動装置は、恒温で電気泳動を行うことができるが、蛍光検出を行うものではない。
【００１３】本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、蛍光性試料で標識した試料が恒温でゲル内で電気泳動している様子を蛍光検出により高感度に行うことができる蛍光検出電気泳動装置、および、この蛍光検出電気泳動装置においてゲルを冷却する蛍光検出電気泳動用冷却板を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明に係る蛍光検出電気泳動用冷却板は、ゲル中で電気泳動する蛍光性試料に励起光を照射して蛍光性試料から発生する蛍光を検出する蛍光検出電気泳動装置においてゲルを冷却する蛍光検出電気泳動用冷却板であって、ゲルを載置する第１の面とは反対側の第２の面の側より入射した励起光を第１の面の側へ透過させる部材からなり、第１の面と第２の面との間の空間に冷却材を循環させてゲルを冷却する冷却手段を有することを特徴とする。
【００１５】本発明に係る蛍光検出電気泳動装置は、ゲル中で電気泳動する蛍光性試料に励起光を照射して蛍光性試料から発生する蛍光を検出する蛍光検出電気泳動装置であって、(1) ゲルを載置する第１の面とは反対側の第２の面の側より入射した励起光を第１の面の側へ透過させる部材からなり、第１の面と第２の面との間の空間に冷却材を循環させてゲルを冷却する冷却手段を有する蛍光検出電気泳動用冷却板と、(2) ゲル中に電場を形成する１対の電極と、(3) 蛍光検出電気泳動用冷却板の第２の面の側に設けられ、蛍光検出電気泳動用冷却板へ励起光を照射する励起光源と、(4) 蛍光検出電気泳動用冷却板の第１の面の側に設けられ、ゲル中の蛍光性試料から発生した蛍光を撮像する蛍光検出器と、を備えることを特徴とする。
【００１６】この蛍光検出電気泳動用冷却板および蛍光検出電気泳動装置によれば、蛍光性試料で標識された試料を含ませたゲルが蛍光検出電気泳動用冷却板の第１の面の上に載置され、１対の電極がゲルの上に互いに所定距離を隔てて配置される。蛍光検出電気泳動用冷却板の内部に冷却材が循環されて、ゲルが恒温に維持される。その後、１対の電極の間に高電圧が印加されて、ゲル内で蛍光性試料が電気泳動する。このとき、蛍光検出電気泳動用冷却板の第２の面の側に配された励起光源から出力された励起光は、蛍光検出電気泳動用冷却板を透過してゲルに照射され、蛍光性試料から蛍光が発生する。この蛍光性試料から発生した蛍光は、蛍光検出電気泳動用冷却板の第１の面の側に配された蛍光検出器により撮像される。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１８】図１は、本実施形態に係る蛍光検出電気泳動装置１の構成図である。この蛍光検出電気泳動装置１は、蛍光検出電気泳動用冷却板１１、１対の電極１２Ａおよび１２Ｂ、励起光源１３、フィルタ１４、蛍光検出器１５、暗箱１６、電気泳動用電源１７、冷却材循環装置１８ならびに解析部１９を備える。
【００１９】蛍光検出電気泳動用冷却板１１は、ゲル２２が付着したゲル保持体２１を上面に載置し、励起光源１３より出力され下面側より入射した励起光を上面側へ透過させる部材からなる。また、ゲル保持体２１も、励起光を透過させる部材からなる。蛍光検出電気泳動用冷却板１１は、上面と下面との間の空間に冷却材（例えば恒温水）を循環させ、ゲル２２を冷却して恒温に維持する冷却手段を有する。
【００２０】電極１２Ａおよび１２Ｂそれぞれは、ゲル２２中に電場を形成するものであり、棒状であって、ゲル２２上に互いに平行に所定距離を隔てて配置される。励起光源１３は、蛍光検出電気泳動用冷却板１１の下面側に配され、ゲル２２中を電気泳動する蛍光性試料を励起し得る波長（例えば紫外領域の或る波長）の励起光を上方に向けて出力する。
【００２１】フィルタ１４および蛍光検出器１５は、蛍光検出電気泳動用冷却板１１の上面側に配されている。フィルタ１４は、ゲル２２より到達した光のうち、励起光成分を遮断し、蛍光成分を透過させる。蛍光検出器１５は、フィルタ１４を透過した蛍光を撮像する。
【００２２】暗箱１６は、その内部に蛍光検出電気泳動用冷却板１１、１対の電極１２Ａおよび１２Ｂ、励起光源１３、フィルタ１４を有する。また、暗箱１６は、蛍光を撮像する為に蛍光検出器１５の撮像部を内部に有する。この暗箱１６は、外乱光が蛍光検出器１５に入らないようにする為のものである。
【００２３】電気泳動用電源１７は、ゲル２２上に配置された電極１２Ａと電極１２Ｂとの間に高電圧を印加するものである。冷却材循環装置１８は、蛍光検出電気泳動用冷却板１１の上面と下面との間の空間に冷却材を循環させるものである。解析部１９は、蛍光検出器１５により撮像された蛍光像を入力して、この蛍光像を解析し記憶する。
【００２４】図２は、本実施形態に係る蛍光検出電気泳動用冷却板１１の構成図である。この蛍光検出電気泳動用冷却板１１は、箱構造部材１１１、天板部材１１２、冷却材入口１１３、冷却材出口１１４Ａおよび冷却材出口１１４Ｂを有している。箱構造部材１１１の少なくとも底部および天板部材１１２それぞれは、励起光源１３から出力される励起光の波長において透明であり、この励起光を下面側から上面側へ透過させる。箱構造部材１１１は例えば紫外線透過性のアクリル樹脂からなり、天板部材１１２は例えば石英ガラスからなる。また、蛍光検出電気泳動用冷却板１１は、箱構造部材１１１の１側面に冷却材入口１１３、冷却材出口１１４Ａおよび冷却材出口１１４Ｂが設けられており、冷却材循環装置１８より冷却材入口１１３を経て供給された冷却材を、箱構造部材１１１と天板部材１１２との間の空間に入れて循環させ、冷却材出口１１４Ａおよび冷却材出口１１４Ｂから排出する。
【００２５】次に、本実施形態に係る蛍光検出電気泳動装置１の動作について説明する。ゲル保持体２１の上面にゲル２２を付着させ、予め蛍光性試料で標識した試料をゲル２２に含ませる。励起光源１３の上に蛍光検出電気泳動用冷却板１１を載置し、この蛍光検出電気泳動用冷却板１１の上にゲル保持体２１を載置して、ゲル２２の上に電極１２Ａおよび１２Ｂそれぞれを互いに平行に所定距離を隔てて配置する。
【００２６】冷却材循環装置１８を作動させ、蛍光検出電気泳動用冷却板１１の内部に冷却材を循環させてゲル２２を恒温に維持する。その後、電気泳動用電源１７により電極１２Ａと電極１２Ｂとの間に高電圧を印加して、蛍光性試料で標識した試料をゲル２２内で電気泳動させる。また、励起光源１３から出力され蛍光検出電気泳動用冷却板１１およびゲル保持体２１を透過した励起光をゲル２２に照射することで蛍光性試料を励起し、この蛍光性試料から発生した蛍光を蛍光検出器１５により撮像し解析部１９によりモニタし解析する。
【００２７】図３は、本実施形態に係る蛍光検出電気泳動用冷却板１１上に載置されたゲル２２における温度分布を示すグラフである。冷却材循環装置１８における冷却材の温度を２２℃に設定し、１対の電極１２Ａおよび１２Ｂのうちの陰極からの距離を横軸とし、各点におけるゲルの表面温度を測定した結果を示す。このグラフから判るように、ゲル２２上の位置によらず温度２２℃で略一定である。
【００２８】図４は、本実施形態に係る蛍光検出電気泳動装置１の蛍光検出器１５により撮像される蛍光像の１例を説明する模式図である。この図では、互いに同一の等電点位置に収束するが収束速度が互いに異なる２種類の試料について示している。図中の左側の蛍光像Ａは、既に等電点位置に収束した試料から発生した蛍光の像である、このように、電極１３Ａと電極１３Ｂとの間に電圧を印加したまま蛍光像を撮像することで、既に収束した試料が拡散することなく、シャープな蛍光像が得られる。また、図中の左側の蛍光像Ｂ１およびＢ２は、電極１３Ａおよび電極１３Ｂそれぞれの近傍から、蛍光像Ａと同一の等電点位置へ向かって収束しつつある途中の試料から発生した蛍光の像である。
【００２９】このように、本実施形態に係る蛍光検出電気泳動装置１を用いれば、冷却材を循環させてゲル温度を恒温に保つ蛍光検出電気泳動用冷却板１１上で、予め蛍光性試料で標識した試料をゲル２２内で電気泳動させることで、スマイリングを防止することができる。また、電気泳動用電源１７による通電を停止することなく、且つ、ゲル２２を蛍光検出電気泳動装置１から除くこともなく、ゲル２２内で分離される試料の分離状態を観察することができる。したがって、この蛍光検出電気泳動装置１を用いることで、ゲル２２内で電気泳動する試料について様々な情報を極めて高感度に得ることができる。
【００３０】
【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり、本発明によれば、蛍光性試料で標識された試料を含ませたゲルが蛍光検出電気泳動用冷却板の第１の面の上に載置され、１対の電極がゲルの上に互いに所定距離を隔てて配置される。蛍光検出電気泳動用冷却板の内部に冷却材が循環されて、ゲルが恒温に維持される。その後、１対の電極の間に高電圧が印加されて、ゲル内で蛍光性試料が電気泳動する。このとき、蛍光検出電気泳動用冷却板の第２の面の側に配された励起光源から出力された励起光は、蛍光検出電気泳動用冷却板を透過してゲルに照射され、蛍光性試料から蛍光が発生する。この蛍光性試料から発生した蛍光は、蛍光検出電気泳動用冷却板の第１の面の側に配された蛍光検出器により撮像される。
【００３１】このように、本発明によれば、冷却材を循環させてゲル温度を恒温に保つ蛍光検出電気泳動用冷却板上で、蛍光性試料で標識した試料をゲル内で電気泳動させることで、スマイリングを防止することができる。また、一対の電極への通電を停止することなく、且つ、ゲルを蛍光検出電気泳動装置から除くこともなく、ゲル内で分離される試料の分離状態を観察することができる。したがって、この蛍光検出電気泳動装置を用いることで、ゲル内で電気泳動する試料について様々な情報を極めて高感度に得ることができる。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５９５０４７３８５
【氏名又は名称】株式会社分子バイオホトニクス研究所
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| 【出願日】 |
平成１２年１月１２日（２０００．１．１２） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００８８１５５
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹 （外２名）
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| 【公開番号】 |
特開２００１−１９４３３８（Ｐ２００１−１９４３３８Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１３年７月１９日（２００１．７．１９） |
| 【出願番号】 |
特願２０００−３７８８（Ｐ２０００−３７８８） |
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