| 【発明の名称】 |
微生物同定法 |
| 【発明者】 |
【氏名】江崎 孝行
【氏名】河村 好章
【氏名】天野 誠
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| 【要約】 |
【課題】迅速且つ簡便に微生物を同定し得る方法及びそれに用いられるキットの提供。
【解決手段】担体面上に固定化された互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来染色体ＤＮＡと、検体中の未知微生物由来染色体ＤＮＡとを反応させ、生じたハイブリダイゼーション複合体を検出することを特徴とする微生物の同定法、及びＧＣ含量の異なる多数の既知微生物由来染色体ＤＮＡが同一面上に固定化された担体を含んでなる、微生物同定用キット。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 担体面上に固定化された互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡと、検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡとを反応させ、生じたハイブリダイゼーション複合体を検出することを特徴とする微生物の同定法。
【請求項２】ＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡを担体上に固定化し、次いで検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡを、これが担体面上に固定化された染色体ＤＮＡの実質上全てと実質上同時に接触するように、担体面上に供給してハイブリダイゼーションを行わしめ、生成されるハイブリダイゼーション複合体を検出することを特徴とする微生物の同定法。
【請求項３】 ＧＣ含量の異なる多数の既知の微生物由来の染色体ＤＮＡが同一面上に固定化された担体を含んでなる、微生物同定用キット。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物の同定方法及びそれに用いられるキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】現在、微生物、特に細菌の同定には、生化学的テストによる同定法が一般に用いられている。
【０００３】この同定法は、微生物固有の生化学的性状に基づいて行われるため、同定対象である微生物の培養、並びに例えば特定酵素や特定物質の産生の有無、特定物質の代謝能等といった種々の生化学的性状についての確認等を行わなければならず、操作が煩雑で同定に長時間を必要とし、また、生化学的性状が未知の微生物については同定不可能であるという問題があった。
【０００４】このような問題を解消するために、近年、極小基板上に夫々の微生物に特異的な塩基配列を有するＤＮＡプローブを固定化させたＤＮＡチップを用いた同定法や一穴に一種類の微生物由来の一本鎖染色体ＤＮＡが固体化されたマイクロプレートを用いて微生物の同定を行うマイクロプレート法〔Takayuki Ezaki, et al., Int. Syst. Bacteriol., 39, 224-229, (1989)〕等が開発されている。
【０００５】しかしながら、これらの同定法に於いては、固定化されたＤＮＡプローブ又は染色体ＤＮＡと、検体中の未知の微生物由来ＤＮＡとをハイブリダイズさせる前に、固定化するＤＮＡを、そのＧＣ含量に応じていくつかのクラスに分け、夫々のクラスについて特定の条件下でハイブリダイズさせなければならなかった。そのため、これらの方法ではＧＣ含量の異なる種々の固定化ＤＮＡを用いて同一条件下で一度に検体中の未知の微生物を同定することは困難であった。
【０００６】更に、ＤＮＡプローブを固定化させたＤＮＡチップを用いる同定法には、検体から直接特定の微生物を検出するには有用ではあるが、未知の微生物を同定するには多数の微生物に特異的なＤＮＡプローブを準備しなければならず、膨大な手間と費用を要するという問題点があり、また、マイクロプレート法には、固定化する染色体ＤＮＡ量が多量に必要であり低コスト化が困難であり、また、一穴に一種類の染色体ＤＮＡしか固定化されていないので、ＤＮＡが固定化されているもの全てに夫々検体を添加しなければならず、操作が煩雑であり多量の検体を必要とするという問題点もあった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、迅速且つ簡便に微生物を同定し得る方法及びそれに用いられるキットを提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解決する目的でなされたものであり、担体面上に固定化された互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡと、検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡとを反応させ、生じたハイブリダイゼーション複合体を検出することを特徴とする微生物の同定法に関する。
【０００９】また、本発明は、ＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡを担体上に固定化し、次いで検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡを、これが担体面上に固定化された染色体ＤＮＡの実質上全てと実質上同時に接触するように、担体面上に供給してハイブリダイゼーションを行わしめ、生成されるハイブリダイゼーション複合体を検出することを特徴とする微生物の同定法に関する。
【００１０】更に、本発明は、ＧＣ含量の異なる多数の既知の微生物由来の染色体ＤＮＡが同一面上に固定化された担体を含んでなる、微生物同定用キットに関する。
【００１１】本発明者等は上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＧＣ含量が異なる多数の既知の微生物由来の染色体ＤＮＡが同一面上に固定化された担体と、検体から抽出した未知の微生物由来の染色体ＤＮＡとを、ある特定の条件下で反応させると、夫々のＤＮＡのＧＣ含量の程度に関係なく、目的のＤＮＡが高効率にハイブリダイズされることを見出し、その結果、生じたハイブリダイゼーション複合体を検出することにより、煩雑な操作も不必要で、同定までに長時間を要することもなく、迅速且つ簡便に未知の微生物を同定し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】本発明に於いて用いられる互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡは、細菌類、ウイルス類等の既知微生物に由来する、互いにＧＣ含量が異なる複数の染色体ＤＮＡであればよい。既知微生物としては、分離同定され、その存在が確認されているものであればよく、種属の別に関係なく用いることができる。具体的には、例えば連鎖球菌、肺炎球菌、腸球菌、ヘモフィルス、嫌気性菌（バクテロイデス、ペプトストレプトコッカス、クロストリジウム等）、キャンピロバクタ、ブルセラ、髄膜炎菌、結核菌、リステリア、クリプトコッカス、Mycobacterium属、Staphylococcus属、Streptcoccus属、Pseudomonas属、Alcaligenes属、Achromobacter属、Acinetobacter属、Legionella属、腸内細菌（Escherichia属、Arsenophonus属、Budvicia属、Buttiauxella属、Cedecea属、Citrobacter属、Edwardsiella属、Enterobacter属、Erwinia属、Ewingella属、Hafnia属、Klebsiella属、Kluyvera属、Leclecia属、Leminorella属、Moellerella属、Morganella属、Obesumbacterium属、Pantoea属、Photorhabdus属、Pragia属、Proreus属、Providencia属、Rahnella属、Salmonella属、Serratia属、Tatumella属、Trabulsiella属、Xenorhabdus属、Yersinia属、Yokenella属等）、ヘリコバクター、淋菌、カンジダ、レプトスピラ、放線菌、ジフテリア菌、百日咳菌、アスペルギルス、マイコプラズマ、赤痢菌、ビブリオ、真菌、ボツリヌス菌等の細菌類、アデノウイルス科ヒトアデノウイルス種、パポーバウイルス科ヒトパピローマウイルス、オルトミクソウイルス科インフルエンザウイルス等のウイルス類が挙げられる。ここで、互いにＧＣ含量の異なる複数の染色体ＤＮＡとは、上記した如き既知微生物から由来する染色体ＤＮＡであって、通常この分野に於いて分類されるＧＣ含量約55％以上のいわゆる高ＧＣ含量染色体ＤＮＡ、ＧＣ含量約55〜40%のいわゆる中ＧＣ含量染色体ＤＮＡ、及びＧＣ含量約40%以下のいわゆる低ＧＣ含量染色体ＤＮＡの３種類の分類のうち、少なくとも２種以上の分類に属する２種以上の染色体ＤＮＡからなることを意味する。尚、本発明に於いて、既知微生物由来染色体ＤＮＡは、市販品を用いても、また、市販の微生物或いは常法により分離した微生物から、自体公知の染色体抽出法（例えば、H.Saito,K.Miura, Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963)等に記載の方法等）により抽出したものを用いてもよい。また、これら染色体ＤＮＡは、自体公知の加熱変性やアルカリ変性法により一本鎖ＤＮＡとして用いられる。
【００１３】本発明に於いて用いられる担体としては、同一面上に多数の微生物由来の染色体ＤＮＡを固定化し得るものであればよく、その表面に凹凸を有するものでもよいが、好ましくは多数の微生物由来の染色体ＤＮＡを固定化し得る平面を有するものであり、例えば板状物、シート状物、膜状物、ディスク状物、円盤状物等が挙げられ、これらには天然、半合成又は合成等の素材を常法により成型することにより得られるもの等が含まれる。これらの素材としては、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、アクリル樹脂、ポリメチルメタクリレート、ガラス、金属、シリコンラバー等、例えばニトロセルロース、硝酸セルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、紙、レーヨン、綿、絹、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリウレタン等が挙げられる。尚、これら担体に、更にカチオン性化合物やアニオン性化合物等をコート等したものや、アミノ基、カルボキシル基等の官能基を導入したもの等も本発明の担体に包含されるが、特にpoly-L-リジン等により表面がコートされた担体が好ましい。また、当該担体の形状は、特に限定されないが、矩形乃至方形や円形乃至楕円形が一般的である。また、本発明に於いて使用される担体の大きさは、通常100cm2以下、好ましくは50cm2以下、より好ましくは25cm2以下である。具体的には、例えばスライドガラス等が実用的である。
【００１４】本発明に於いて、上記した如き担体に既知微生物由来染色体ＤＮＡを固定化する方法としては、通常この分野で用いられる方法であればよく、例えば物理的吸着による固定化方法、担体中の官能基を利用して化学的に固定化する方法、或いは市販のスタンピング装置を用いる固定化方法（例えば、日本レーザー電子（株）等から販売されているスタンピング装置を用いる方法等）等が挙げられる。尚、染色体ＤＮＡを担体に固定するにあたっては、これら既知微生物由来染色体ＤＮＡが固定化されている位置が夫々明らかになるように、担体上に適当な表示（例えば番号を付す等）をしておくことが好ましい。
【００１５】本発明の同定法は、上記した如き、担体面上に固定化された互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡと、検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡとを、特定の条件下で反応させることにより、夫々のＤＮＡのＧＣ含量の程度に関係なく、ＧＣ含量の異なる種々の固定化ＤＮＡと検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を、同一条件下で一度に行うことができる。
【００１６】本発明の同定法は、例えば50％ホルムアミドを含有するハイブリダイゼーション溶液を用いる場合には、担体面上に固定化された互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡが、高ＧＣ含量の染色体ＤＮＡ（以下、High GCと略記する場合がある）及び低ＧＣ含量の染色体ＤＮＡ（以下、Low GCと略記する場合がある）を含む場合は通常25〜46℃、好ましくは25〜44℃、より好ましくは40〜44℃、High GC及び中ＧＣ含量染色体ＤＮＡ（以下、Middle GCと略記する場合がある）を含む場合は通常25〜60℃、好ましくは30〜55℃、より好ましくは40〜50℃、Middle GC及びLow GC両方を含む場合は通常15〜46℃、好ましくは15〜44℃、より好ましくは25〜44℃、High GC、Middle GC及びLow GC全てを含む場合は通常25〜46℃、好ましくは25〜44℃、より好ましくは40〜44℃の条件下で、通常10分〜24時間、好ましくは30分〜12時間、担体面上に固定化された互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡと、検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡとをハイブリダイゼーション反応に供すればよく、これ以外は自体公知の方法に準じて実施すればよく、使用される試薬類やその使用濃度もこれら自体公知の方法に準じて適宜選択すればよい。即ち、例えばＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡを担体上に固定化し、次いで検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡを、これが担体面上に固定化された染色体ＤＮＡの実質上全てと実質上同時に接触するように、担体面上に供給して上記した如き条件でハイブリダイゼーションを行わしめ、生成されるハイブリダイゼーション複合体を検出することにより未知微生物の同定を行えばよい。
【００１７】本発明に於いて、同定される微生物を含む検体としては、例えば半導体用洗浄水、例えば血液、血清、血漿、髄液、胃液、胆汁等の体液、尿、糞便、喀たん、膿、皮膚由来物、水道水、工場廃液、食品、飲料、医療器具等を洗浄した後の洗浄液等が挙げられる。
【００１８】本発明の方法に於いて、担体面上に固定化された互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡと、検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡとを反応させるには、同定しようとする未知微生物を含む上記した如き検体から当該微生物及び当該微生物由来の染色体ＤＮＡを抽出する必要がある。検体から当該微生物及び当該微生物由来染色体ＤＮＡを抽出する方法としては、例えば、H.Saito,K.Miura, Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963)等に記載の自体公知の方法に準じてこれを行えばよい。また、これら染色体ＤＮＡは、自体公知の加熱変性やアルカリ変性法等により一本鎖ＤＮＡとして用いられる。このようにして得られた未知微生物由来ＤＮＡは、通常ハイブリダイゼーション反応に適した溶液状態として本発明の方法に供される。当該溶液状態とするには、自体公知のハイブリダイゼーション法に用いられる緩衝液、例えばハイブリダイゼーション溶液等に未知微生物由来染色体ＤＮＡを溶解することにより行われる。尚、使用されるハイブリダイゼーション溶液等を調製するために用いられる試薬類や、ハイブリダイゼーション溶液中のこれら試薬類の濃度は、自体公知のハイブリダイゼーション法に於いて用いられるハイブリダイゼーション溶液に準じて適宜選択すればよい。
【００１９】検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡを、これが担体面上に固定化された染色体ＤＮＡの実質上全てと実質上同時に接触させるには、例えば上記した如き未知微生物由来染色体ＤＮＡを含む溶液を、担体上に滴下等して一挙に供給することにより、固定化されている実質的に全ての染色体ＤＮＡと実質的に同時乃至は一挙に接触させればよい。
【００２０】本発明に於いて、担体面上に固定化された互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡと、検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡとを反応させることにより生成されるハイブリダイゼーション複合体を検出するには、例えば予め検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡを、例えば酵素類、放射性同位元素、蛍光性物質、発光性物質、紫外部に吸収を有する物質、スピンラベル化剤としての性質を有する物質等の通常この分野で用いられる標識物質により標識し、得られた標識未知微生物由来染色体ＤＮＡと、担体面上に固定化された互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡとを反応させて、生じたハイブリダイゼーション複合体中の標識物質を検出する方法等によりこれを行えばよい。上記した如き標識物質としては、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、マイクロパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース-6-リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ等の酵素類、例えば32Ｐ、35Ｓ、99ｍＴｃ、131Ｉ、125Ｉ、14Ｃ、3Ｈ等の放射性同位元素、例えばフルオレセイン、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ナフチルアミン、これらの誘導体、ユウロピウム等の蛍光性物質、例えばルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビス（2,4,6-トリフロロフェニル）オキザレーロ等の発光性物質、例えばフェノール、ナフトール、アントラセン、これらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル、3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル、2,6-ジ-t-ブチル-α-（3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン）-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
【００２１】また、例えば臭化エチジウム、二ヨウ化プロピジウム等のハイブリダイゼーション複合体の分子内、特に水素結合で結合した鎖間に特異的に取り込まれる物質を、当該ハイブリダイゼーション複合体と反応させて、当該複合体を直接検出する方法によっても、又は上記した如き標識物質により標識された、例えば抗体、抗原、蛋白質結合配位子、ハプテン等のハイブリダイゼーション複合体に特異的に結合する物質を、当該ハイブリダイゼーション複合体と反応させて、生じたハイブリダイゼーション複合体と標識特異的結合物質との複合体中の標識物質を検出する方法、或いはハイブリダイゼーション複合体に、未標識のハイブリダイゼーション複合体特異的結合物質を反応させ、更に標識物質で標識された当該結合物質に対する二次抗体を反応させて、生じたハイブリダイゼーション複合体と特異的結合物質と標識二次抗体との複合体中の標識物質を検出する方法等によっても、担体面上に固定化された互いにＧＣ含量の異なる複数の既知微生物由来の染色体ＤＮＡと、検体中の未知微生物由来の染色体ＤＮＡとを反応させることにより生成されるハイブリダイゼーション複合体を検出することができる。
【００２２】未知微生物由来の染色体ＤＮＡ、ハイブリダイゼーション複合体に特異的に結合する物質、或いは二次抗体を、標識物質により標識する方法としては、通常この分野で用いられる常法、例えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或いはＦＩＡ等に於いて一般的に行われている自体公知の標識方法〔医学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第３版、医学書院、1987等〕や、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法等が挙げられる。また、市販の標識キットを用いることもできる。
【００２３】また、標識物質を検出するには、通常この分野で用いられる常法、例えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或いはＦＩＡ等に於いて一般的に行われている自体公知の標識方法〔医学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第３版、医学書院、1987等〕等に準じて、標識物質の性質に応じてこれを検出すればよい。
【００２４】本発明の同定法は、更に具体的には、例えば以下のようにして行うことができる。先ず、上記した如き抽出・変性して得られた、夫々互いにＧＣ含量が異なる既知微生物由来の一本鎖染色体ＤＮＡを複数、5種類以上10000種類未満、好ましくは25〜6000種類、さらに好ましくは50〜500種類、上記した如き通常100cm2以下、好ましくは50cm2以下、より好ましくは25cm2以下の担体上に固定化し、ＤＮＡ固定化担体を調製する。一方、同定しようとする未知微生物を含んだ検体から、そこに含まれている微生物に由来する染色体ＤＮＡを、上記した如き方法により抽出・変性し、一本鎖ＤＮＡとする。得られたＤＮＡを上記した如き標識物質で標識し、これを上記した如きハイブリダイゼーション反応を行うのに適した溶液に溶解して溶液状態とする。次いで、この溶液を担体の面上に固定化されている既知微生物由来染色体ＤＮＡ上に一挙に供給し、固定化されている実質的に全ての染色体ＤＮＡと実質的に同時に乃至は一挙に接触させ、上記した如き条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。かくして、両染色体ＤＮＡ間でのハイブリダイゼーション反応が進行し、未知微生物由来の染色体ＤＮＡと相同性を有する標識された既知微生物由来染色体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション複合体が担体面上に形成される。次いで、かくして形成された複合体中の標識物質を上記した方法により検出することによって、未知微生物が同定される。
【００２５】尚、本発明の同定法は、染色体ＤＮＡを用いているため、複数の相同性の高い微生物由来染色体ＤＮＡと、検体中の未知微生物由来染色体ＤＮＡとがクロスハイブリダイズする場合があるが、この場合は、クロスハイブリダイゼーションの度合いを比較することにより、未知微生物の同定が可能である。言い換えれば、本発明の方法により属間のみならず、種間の同定が可能となる。
【００２６】本発明のキットは、上記した如き検体中の未知の微生物を同定するために使用されるものであり、上記した如きＧＣ含量の異なる多数の既知の微生物由来の染色体ＤＮＡが同一面上に固定化された担体を含んでなる以外は、通常この分野で使用される試薬類、例えば緩衝液、洗浄液等の溶液、例えば標識物質が酵素である場合には、その酵素を測定するための基質、酵素反応を停止するための反応停止剤等の試薬類を、含んでいてもよい。尚、このような試薬類に含まれる各成分の使用濃度は、この分野で通常使用される濃度範囲から適宜選択すればよい。
【００２７】以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【００２８】
【実施例】実施例１．
（１）染色体ＤＮＡの固相化表１に記載の各種細菌からH.Saito,K.Miura, Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963)の方法に従い染色体ＤＮＡを抽出し、ＴＥ緩衝液〔１mMＥＤＴＡ含有10mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ8.0）〕で１mg/mlとなるように希釈した後、100℃５分間の加熱後、氷中で急冷する事により１本鎖染色体ＤＮＡ含有溶液を調製した。この溶液に６×SSC溶液（即ち、0.15M ＮａＣｌ−0.015M クエン酸三ナトリウム溶液の６倍濃度溶液）を等量加え、各種細菌の染色体ＤＮＡ溶液（最終ＤＮＡ濃度が0.5mg／mlの0.45M ＮａＣｌ−0.045M クエン酸三ナトリウム溶液）32種を調製した。日本レーザー電子製ＧＴ−ＭＡＳＳスタンピングマシーンを用いて、これらＤＮＡ溶液をMastunami社製 Poly-L-lysine coat slide glass上に順次スポッティングした。
【００２９】
【表１】
【００３０】（２）プレハイブリダイゼーション（ブロッキング処理）
上記（１）で得た染色体ＤＮＡ固定化スライドグラスに第１ハイブリダイゼーション溶液［50％ホルムアミド、0.02％ウシ血清アルブミン、0.02％ポリビニルピロリドン（分子量３×103〜４×104）、0.02％フィコール（分子量４×105）及び0.1mg／ml 変性ニシン精巣ＤＮＡ を含有する２×SSC溶液］15μlを添加し、カバーガラスを気泡が入らないようにかぶせたのち、プラスチック製のハイブリダイゼーション容器に入れ37℃２時間以上プレハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーション終了後、カバーガラスを取り除き、ＳＳＣ溶液で染色体ＤＮＡ固定化スライドグラスを２回洗浄後、遠心分離によりスライドガラス表面上のＳＳＣ溶液を除去した。
【００３１】（３）標識染色体ＤＮＡの作成表１に記載の細菌のうち、No.１、No.６、No.７、No.10、No.11、No.14、No.20、No.22、No.26、No.28についてH.Saito,K.Miura, Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963)の方法に従い染色体ＤＮＡを抽出し、ＴＥ緩衝液で１mg／mlとなるように希釈した後、Mirus社製Label IT Cy3 Nucleic Acid Labeling Kitを用いMirus社推奨の方法で染色体ＤＮＡの標識を行ったのちエタノール沈殿により、未反応のCy3と標識染色体ＤＮＡの分離を行った。得られた標識染色体ＤＮＡを最終濃度が10μg／mlになるように第２ハイブリダイゼーション溶液［50％ホルムアミド、0.02％ウシ血清アルブミン、0.02％ポリビニルピロリドン（分子量３×103〜４×104）、0.02％フィコール（分子量４×105）、0.1mg／ml 変性ニシン精巣ＤＮＡ 及び2.5％デキストラン硫酸ナトリウムを含有する２×ＳＳＣ溶液］で希釈し、各種細菌由来の標識染色体ＤＮＡ溶液10種を得た。
【００３２】（４）ハイブリダイゼーション反応上記（２）で調製した染色体ＤＮＡ固定化スライドグラスに、上記（３）で調製した所定の標識染色体ＤＮＡ溶液15μlを添加し、カバーガラスを気泡が入らないようにかぶせたのち、プラスチック製のハイブリダイゼーション容器に入れ40℃４時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション終了後、カバーガラスを取り除き、ＳＳＣ溶液で染色体ＤＮＡ固定化スライドグラスを３回洗浄後、遠心分離によりスライドガラス表面上のＳＳＣ溶液を除去した。
【００３３】（５）ハイブリダイゼーションおよびハイブリッド形成の度合の定量GSI Lumonics社製の共焦点レーザースキャナーでCy3標識ＤＮＡの量を測定した。
【００３４】結果を図１〜１０にそれぞれ示す。尚、図１は、 Mycobacterium avium［No.1（表１記載の微生物No.を表す。以下、同じ。）：High GC］由来の染色体ＤＮＡを標識染色体ＤＮＡとして用いた場合のハイブリダイゼーションの結果を、図２はStaphylococcus epidermidis（No.6:Low GC）由来の染色体ＤＮＡを、図３はStaphylococcus hominis（No.7:Low GC）由来の染色体ＤＮＡを図４は Streptococcus anginosus（No.10:Low GC）由来の染色体ＤＮＡを、図５はStreptococcuspyogenes（No.11:Low GC）由来の染色体ＤＮＡを、図６はPseudomonas aeruginosa（No.14:High GC）由来の染色体ＤＮＡを、図７はAcinetobacter calcoaceticus Acinetobacter calcoaceticus（No.20:Low GC）由来の染色体ＤＮＡを、図８はLegionella pneumophilla（No.22:Low GC）由来の染色体ＤＮＡを、図９は Legionella anisa（No.26:Low GC）由来の染色体ＤＮＡを、図１０は Escherichiacoli（No.28:Middle GC）由来の染色体ＤＮＡを、夫々用いた場合のハイブリダイゼーションの結果を示す。また、図１〜１０に於いて、図中の１〜32及びＢは、夫々表１記載の同番号の細菌由来の染色体ＤＮＡが固定化されている位置を示す。これらの結果から、一度のハイブリダイゼーション操作でHigh GCからLow GCまでの細菌の同定が可能であること、言い換えればすべての細菌の同定が可能となることが判る。また、図２と図３の結果の比較、図４と図５の結果の比較、並びに図８と図９の結果の比較から、本発明の方法によれば、属間のみならず種間でも微生物の同定が可能となることも判る。
【００３５】実施例２表１に記載の細菌のうちNo.１（High GC）、No.10（Low GC）、No.28（MiddleGC）について、ハイブリダイゼーション時の温度を変えた以外は実施例１と同様の染色体ＤＮＡ固定化スライドグラスを用いた方法で標識ＤＮＡの量を測定した。尚、反応時の温度は１５℃、２０℃、２５℃、４４℃、４６℃、４８℃及び５０℃として、夫々の標識ＤＮＡ量を測定した。結果を図１１〜２６、及び表２にそれぞれ示す。尚、図１１〜１６は Mycobacterium avium（No.１:High GC）由来の染色体ＤＮＡを標識染色体ＤＮＡとして用いた場合の所定の温度におけるハイブリダイゼーションの結果を、図１７〜２０は Streptococcus anginosus（No.10：Low GC）由来の染色体ＤＮＡを標識染色体ＤＮＡとして用いた場合の所定の温度におけるハイブリダイゼーションの結果を、図２１〜２６は Escherichia coli（No.28：Middle GC）由来の染色体ＤＮＡを標識染色体ＤＮＡとして用いた場合の所定の温度におけるハイブリダイゼーションの結果を夫々表す。また、図１１〜２６に於いて、図中の１〜32及びＢは、夫々表１記載の同番号の細菌由来の染色体ＤＮＡが固定化されている位置を示す。表２は、図１１〜２６の結果から求めた、ハイブリダイゼーションによる相対類似度(%)を表したものである。尚、表２中の−は相対類似度が３０％未満のものを表す。
【００３６】
【表２】
【００３７】表２の結果から、No.1： Mycobacterium aviumのＤＮＡ染色体（表２中ではHighとしても表示）を用いた場合、15℃、20℃におけるハイブリダイゼーションでは、No.1以外に近縁種へのハイブリダイゼーション（No.3、No.4、No.14等）が見られ、定量解析による同定は不可能であることがわかった。また、No.10： Streptococcus anginosusのＤＮＡ染色体（表２中ではLowとしても表示）を用いた場合、近縁種へのハイブリダイゼーションはあまり見られなかったが、46℃以上ではハイブリダイゼーションによる検出が不可能であった。更に、No.28： Escherichia coliのＤＮＡ染色体（表２中ではMidとしても表示）を用いた場合、15〜50℃の所定の温度全てにおいてハイブリダイゼーションによる検出、同定が可能であることがわかった。即ち、上記の結果においては、High GC（No.１）では２５℃以上５０℃以下で、Low GC（No.10）では１５℃以上４４℃以下で、Middle GC（No.28）では１５℃以上５０℃以下の温度で、ハイブリダイゼーションによる検出が可能であることが判明した。したがって、全てのＤＮＡ染色体（HighGC、Middle GC及びLow GC）を検出するためにはハイブリダイゼーション時の温度を２５℃以上４４℃以下にすることが好ましいことが判った。
【００３８】
【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、迅速且つ簡便に微生物を同定し得る方法及びそれに用いられるキットを提供するものであり、本発明によれば、煩雑な操作も不必要で、同定までに長時間を要することもなく、迅速且つ簡便に未知の微生物を同定し得る。
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| 【出願人】 |
【識別番号】０００２５２３００
【氏名又は名称】和光純薬工業株式会社
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| 【出願日】 |
平成１３年２月１６日（２００１．２．１６） |
| 【代理人】 |
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| 【公開番号】 |
特開２００１−２９９３９６（Ｐ２００１−２９９３９６Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１３年１０月３０日（２００１．１０．３０） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−４０１７５（Ｐ２００１−４０１７５） |
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