| 【発明の名称】 |
メナキノン−７の製造方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】大森 俊郎
【氏名】高下 秀春
【氏名】林 圭
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| 【要約】 |
【課題】
【解決手段】 |
【特許請求の範囲】
【請求項1】大麦を使用する蒸留酒の製造において副生する蒸留残液を固液分離して、アミノ酸、ポリフェノール、有機酸、及びグリセロールを含有する液体分を得、該液体分に１重量％以上の糖類を添加後、該液体分に含まれる酸を実質的に中和処理して得られる調製液を培地に使用し、Bacillus subtilisに属するメナキノン-7生産菌を培養することを特徴とするメナキノン−7含有物質の製造方法。
【請求項２】アンモニアの生成を抑制して、前記培地中に前記メナキノン−7を高収率で生産する請求項1に記載のメナキノン−7含有物質の製造方法。
【請求項３】前記糖類が、グルコース、フルクトース、マルトース、及びスクロースからなる群から選ばれる一種またはそれ以上の単糖類又は二糖類である請求項1に記載のメナキノン−7含有物質の製造方法。
【請求項４】前記蒸留残液が、大麦を使用する焼酎の製造において副生する蒸留残液である請求項1に記載のメナキノン−7含有物質の製造方法。
【請求項５】前記蒸留残液が、大麦を使用するウイスキーの製造において副生する蒸留残液である請求項1に記載のメナキノン−7含有物質の製造方法。
【請求項６】前記メナキノン−7含有物質を精製して高純度のメナキノン−7含有物質にする工程を包含する請求項１乃至５のいずれかに記載のメナキノン−7含有物質の製造方法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は，大麦を使用する蒸留酒の製造において副生する蒸留残液を固液分離して得られる液体分に糖類を添加したものを主たる構成成分とする培地を使用して、Bacillus subtilisに属するメナキノン−7生産菌を培養することにより、アンモニアの生成を抑制しつつ、メナキノン−7を高収率で製造する方法に関する。特に本発明は、大麦を使用する焼酎の製造において副生する大麦焼酎蒸留残液を固液分離して得られる液体分に糖類を添加したものを主たる構成成分とする培地を使用して、Bacillus subtilisに属するメナキノン−7生産菌を培養することにより、アンモニアの生成を抑制しつつ、メナキノン−7を高収率で製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ビタミンＫは血液の正常な凝固能を維持するのに不可欠な栄養素である。一般にビタミンＫと称されるものには、合成されたものを含めてビタミンＫ１乃至ビタミンＫ7が知られている。これらのうち、ビタミンK1（フィロキノン）及びビタミンK2 （メナキノン）は天然に存在するものである。ビタミンK1は主に植物の葉緑体で合成されることから、緑黄色野菜に多く、他に植物油、豆類、海藻類及び魚介類に比較的多く含まれている。一方、ビタミンＫ2は一般細菌や腸内細菌が生産するもので、納豆等の発酵食品、あおのり、鶏卵、肉類及び乳製品に比較的多く含まれる。ビタミンＫ2はその側鎖構造の違いによってメナキノン−1〜メナキノン−14に類別される。これらのうち特に納豆に多く含まれるビタミンK2は、主としてメナキノン−7（以下、MK−7と略称する）から成るものであり、当該MK−7は納豆菌によって生産されることが知られている。MK-7は血液凝固能の維持に関わるだけでなく、骨芽細胞による骨形成を促進すると同時にカルシウムの骨からの溶出を抑制し、骨のカルシウム量の減少を抑制する作用を有することが知られている。こうしたことからMK-7は骨粗鬆症の治療薬として既に利用されており、その需要は益々高まっている。
【０００３】ところで、MK−7の工業的製造については、以下に述べるように、（１）蒸煮大豆、大豆煮汁または豆腐粕等の大豆由来の材料を培地として使用するか、或いは（２）大豆煮汁または醤油火入れオリ等の大豆由来の材料に特定の物質を混合して培地として使用し、納豆菌を培養することによりMK-7を製造する方法が提案されている。前記（１）の方法については、特開平8−9916号公報、特開平8−19378号公報、特開平8−73396号公報方法、及び特開平11−196820号公報に記載されている。即ち、特開平8−9916号公報には、蒸煮大豆に納豆菌を植菌し、42乃至50℃で24乃至48時間培養して納豆を得ることによりMK−7を製造する方法が記載されている。特開平8−19378号公報には、納豆製造時に副生する大豆煮汁をpH7に調整して滅菌し、これに納豆菌を接種し、培養温度48℃、攪拌数120rpmで4日間振とう培養することによりMK−7を製造する方法が記載されている。また当該公報には、豆腐製造時に副生する豆腐粕を滅菌し、これに納豆菌を接種し、培養温度48℃で、5日間静置培養することによりMK−7を製造する方法が記載されている。特開平8−73396号公報には、納豆製造時に副生する大豆煮汁に納豆菌を接種し培養することによりMK−7を製造する方法が記載されている。特開平11−196820号公報には、豆腐の製造過程で発生した豆腐粕（オカラ）を滅菌し、これに納豆菌Bacillus spTT-52を接種し、ステンレス製金網上に厚さ約1cmの層として載置し、37℃で48時間発酵させ、その後25℃で17時間発酵させて培養することによりMK−7を製造する方法が記載されている。
【０００４】前記（２）の方法については、特開平10-295393号公報、及び特開平11−32787号公報に記載されている。即ち、特開平10-295393号公報には、ブリックス濃度を5乃至10%に調整した大豆煮汁に3乃至10重量%のグリセリン（グリセロール）を添加して滅菌し、これに納豆菌を接種し、培養温度40℃、通気量0.5L/min、攪拌速度500rpmで4日間培養することによりMK−7を製造する方法が記載されている。尚、特開平10-295393号公報には、前記グリセリンに代えてシュクロース（スクロース）5％を前記大豆煮汁に添加し、以下同様にしてMK−7を製造する方法が記載されている。特開平11−32787号公報には、醤油火入れオリ7%(W/V)、グルコース5%(W/V)、K2HPO4 0.25%(W/V)、MgSO4・7H2O 0.05%(W/V)、NaCl 2%(W/V)からなる組成の培地をpH8.0に調整して滅菌し、これにバシルス・ズブチリスに属するMK−7生産菌を接種して、ジャーファーメンターにて、培養温度40℃、攪拌数400rpm、通気量1vvmの条件で、培養液のpH値を2ＮのNaOHで7.0に保ちながら、48時間培養することによりMK−7を製造する方法が記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述した従来のMK−7の製造方法は、いずれの場合においても、得られる培養液中のMK−7濃度が十分に高いとは言えない。即ち、通常の市販納豆に含まれるMK−7含量は約10乃至20ppmである。これに対して、上述した公報に記載の方法では、得られる培養物中のMK−7含量は、最大でも、当該市販納豆中のMK−7含量と大差ないものである。即ち、特開平8−9916号公報に記載の方法では納豆中のMK−7濃度は5.8mg/100g（即ち、58mg/kg）であり、特開平8−73396号公報に記載の方法では培養生産物中のMK−7濃度は17.2mg/kgであり、特開平11−32787号公報に記載の方法では培養生産物中のMK−7濃度は29.8mg/kgである。また、特開平10−295393号公報に記載の方法（グリセリンを添加）では培養生産物中のMK−7濃度は40.6mg/Lである。尚、特開平10−295393号公報に記載の方法（グリセリンに代えてシュクロース（スクロース）を添加）では培養生産物中のMK−7濃度は25mg/Lであり、このMK−7濃度は、グリセリンを添加した場合の前記MK−7濃度（40.6mg/L）より明らかに低い。更に特開平11−196820号公報に記載の方法では培養生産物中のMK−7濃度は、豆腐粕（オカラ）発酵物1g当たり29636ng（即ち29.6mg/kg）である。特開平8-19378号公報の記載には、培養生産物中のMK−7の濃度は11.7mg/100ml（即ち117mg/L）である旨記載されているが、この値は途方もなく高い濃度であり、当該公報に記載された内容の方法で達成できるものとは到底考えられない。因みに、本発明者らが特開平8-19378号公報に記載の方法に従って、後述する比較例3に記載の追試を行った結果、得られた培養液中のMK−7濃度は10.8mg/Lであった。このことから、当該公報に記載の方法ではそこに記載のMK−7濃度117mg/Lは達成できないことが判明した。従って、これらの従来のMK−7の製造方法は、いずれの場合においても得られる培養液中のMK−7濃度が低く、工業的製造方法として十分なものとは言えない。
【０００６】付言するに、上述した特開平11−32787号公報に記載のMK-7の製造方法においては、醤油中に溶存するタンパク質を主たる構成成分とする醤油火入れオリに、グルコース、K2HPO4、MgSO4・7H2O、及びNaCl を栄養成分として添加した培地を必要とする。また、上述した特開平10−295393号公報に記載のMK−7の製造方法においては、ブリックス濃度を5乃至10%に調整した大豆煮汁に1重量%以上のグリセロールを添加した培地を必要とする。このように大豆由来の材料に特定の化学物質を加えて使用することは、製品の製造コストを引き上げてしまう。従って、これらのMK−7の製造方法は、上述したように培養液中のMK−7濃度が低い上に、経済的な面でも問題がある。こうしたことから、容易に入手することができて、比較的安価な材料を培地に使用し、MK−7の高収率での生産を可能にするMK−7の製造方法の早期提供が切望されている。
【０００７】ところで、上述した特開平8−9916号公報には、納豆菌を培養することによりMK−7を製造する場合、MK−7濃度の上昇に伴って培地中のアンモニア濃度が高まる旨記載されている。こうしたことから、従来のMK−7製造方法に従って納豆菌の培養を行った場合には、上述したように、MK−7の生成量が低いにも拘わらずアンモニアの生成量が高い、即ち、得られる培養液については、含有するMK−7の濃度は、上述したように、低いにも拘わらず、含有するアンモニアの濃度は高い、と云う問題がある。従って、 培養中のアンモニアの生成を抑制しつつ、MK−7の高収率での生産を可能にするMK−7の製造方法についても早期提供が切望されている。本発明は，上述した課題に鑑みて、本発明者らが鋭意研究の結果完成に至ったものである。本発明の主たる目的は，従来のMK−7製造方法における上述の問題点を解決し且つ上述の要望を叶える、アンモニアの生成を抑制しつつMK−7の効率的且つ高収率での生産を可能にする方法を提供することにある。 本発明の該方法は、MK−7高含有物質を製造し、該MK−7高含有物質を精製して、高純度のMK−7含有物質を製造する方法を包含する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、多くの場合、廃棄に付される大麦焼酎蒸留残液の使用が、従来のMK−7の製造方法における上述した問題点の解決を図れるのではないかとの推測に立って、実験を介して鋭意研究を行った。すなわち、本発明者らは、大麦を使用する焼酎製造において副生する焼酎蒸留残液を固液分離して、アミノ酸、ポリフェノール、有機酸、及びグリセロールを含有する液体分を得、該液体分のみを培地に用いて、Bacillus subtilisに属するMK−7生産菌である納豆菌の培養を行った。その結果、前記液体分に、他の栄養成分を何ら添加することなくして、従来から納豆菌の培養の際に一般的に用いられてきた大豆煮汁、グリセロールを添加した大豆煮汁、豆腐粕、蒸煮大豆、及び醤油火入れオリを添加した合成培地などを培地に用いた場合と比較して、増殖菌体の量が著しく増加するだけでなく、培養液中において納豆菌が生産するMK−7の濃度も飛躍的に高まることが判明した。
【０００９】そこで、本発明者らは、大麦焼酎と同様に原料に大麦を用いるウイスキーの製造において副生するウイスキー蒸留残液から得た培地においても同様の効果が得られるのではないかと考えて次の実験を行った。すなわち、大麦を使用するウイスキーの製造において副生するウイスキー蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分に含まれる酸を実質的に中和処理して調製液を得、該調製液を滅菌処理することにより得られた培地を用いて、Bacillus subtilisに属するMK−7生産菌である納豆菌の培養を行った。その結果、前記液体分に、他の栄養成分を何ら添加することなくして、従来から納豆菌の培養の際に一般的に用いられてきた大豆煮汁、グリセロールを添加した大豆煮汁、豆腐粕、蒸煮大豆、及び醤油火入れオリを添加した合成培地などを培地に用いた場合と比較して、増殖菌体の量が著しく増加するだけでなく、培養液中において納豆菌が生産するMK−7の濃度も飛躍的に高まることが判明した。
【００１０】以上の結果から，大麦を使用する蒸留酒の製造において副生する蒸留残液を固液分離して、アミノ酸、ポリフェノール、有機酸、及びグリセロールを含有する液体分を得、該液体分に含まれる酸を実質的に中和処理して調製液を得、該調製液を滅菌処理することにより得られた培地を用いて、Bacillus subtilisに属するMK-7生産菌を培養して培養液を得ることにより、該培養液中のMK-7濃度が極めて高いMK-7含有物が得られ，上述の課題が達成できることが判明した。ところで、大麦を使用する焼酎製造において副生する焼酎蒸留残液から得られる前記培地の組成を分析したところ、表1に示すように本発明において用いる大麦を使用する焼酎製造で副生する大麦焼酎蒸留残液は、粗タンパク質(食品のタンパク質量を測定する場合、窒素含量を測定し、その値に窒素−タンパク質換算計数を乗じて算出した量を意味する)が 約4%であり、主なアミノ酸として、プロリン、ロイシン、アルギニン、アラニン、及びグルタミン酸を含有することが判った。更に該大麦焼酎蒸留残液は、焼酎製造における発酵過程において生産されるグリセロール、クエン酸、酢酸、及び乳酸、あるいは大麦に由来するポリフェノールなどの納豆菌の培養に好ましい栄養成分を含有することが判明した。
【００１１】本発明者らは、前記培地に必ずしも十分に含有されているとは言えない炭素源について別途ある種の炭素源を加えることにより、培養液中のMK−7生産量が更に高まるのではないかと考え、上述の特開平10−295393号公報にシュクロース（スクロース）の添加がビタミンK含量の増大にさ程寄与しない旨記載されはいるもののこの点は無視して、前記大麦焼酎蒸留残液の液体分に前記炭素源として少量の糖類（即ち、スクロース）を添加したものを培地に用いて、Bacillus subtilisに属するMK−7生産菌を培養して培養液を得た。その結果、該培養液中のMK−7濃度は、前記焼酎蒸留残液から得られた培地のみを用いて培養することにより得た培養液中のMK−7濃度よりも明らかに高くなっていることが判明した。更に驚くことに、該培養液中のアンモニア濃度を調べたところ、該アンモニア濃度は、焼酎蒸留残液から得られた培地のみを用いて培養した培養液中のアンモニア濃度よりも大幅に低くなっていた。そこで本発明者らは、スクロース以外の糖類についても同様の実験を介して鋭意研究を重ねたところ、本発明において使用する焼酎蒸留残液に1重量％以上の量のグルコース、フルクトース、マルトース、及びスクロースからなる群から選ばれる一種又はそれ以上の単糖類又は二糖類を添加した培地を用いて納豆菌を培養する場合、アンモニアの生成が望ましく抑制されて、培養液中のMK−7濃度が更に高まることが判明した。
【００１２】図１は、本発明者らが、後述する実施例１と同様にして、大麦焼酎蒸留残液にスクロース（少量）を添加した本発明の培地を使用して納豆菌を培養し、また、後述する比較例１と同様にして、従来のMK−7の製造方法において最も一般的に使用する大豆煮汁にスクロース（少量）を添加した培地を使用して納豆菌を培養し、それぞれの場合における培養時間との関係での納豆菌培養液中のMK−7の生成状況（即ち、MK−7の濃度）及びアンモニアの生成状況（即ち、アンモニアの濃度）を調べ、得られた結果をグラフ化して示したものである。図１に示した結果から次のことが判明した。即ち、従来のMK−7の製造方法において最も一般的に使用する大豆煮汁に糖類（スクロース）を添加した培地を使用した場合には、MK−7の生成量（即ち、得られる培養液中のMK−7濃度）が低いのに対して、アンモニアの生成量（即ち、得られる培養液中のアンモニア濃度）はMK−7の生成量よりは遥かに高く、MK−7の生成量の２倍以上に達してしまう。一方、大麦焼酎蒸留残液に糖類（スクロース）を添加した本発明の培地を使用した場合は、MK−7の生成量（即ち、得られる培養液中のMK−7濃度）は極めて高く、これと同様にアンモニアの生成量（即ち、得られる培養液中のアンモニア濃度）も高い。しかしながら、アンモニアの生成は、前者の場合とは明らかに異なり、MK−7の生成と略同様の傾向をたどり、得られる培養液中のアンモニア濃度は、該培養液中のMK−7濃度と略同等か若しくは僅かに高い程度である。このことから、本発明の培地を使用した場合、アンモニアの生成は、上述の大豆煮汁を使用した場合におけるようにMK−7の生成を卓越することはなく、MK−7の生成と略同等か若しくは僅かに高い程度であることが理解される。即ち、糖類を添加した本発明の培地を使用する場合、アンモニアの生成が抑制されて、極めて高い収率でのMK−7の生成が達成できる。
【００１３】このように本発明の方法により製造されるMK−７含有物質（即ち、高濃度MK−７含有物質）は、比較的高濃度のアンモニアを含有するものであるが、該MK−７含有物質をアルカリ性に保持しながら曝気することにより該MK−７含有物質に含まれる前記アンモニアを容易に除去することができる。これによりアンモニアを含まないMK−７含有物質を得ることができ、そのまま食品或いはビタミン剤として使用することができる。また本発明の方法により製造される該MK−7含有物質は、公知の精製方法によりアンモニアを除去するとともに精製して、アンモニアを全く含まない高純度のMK−7含有物質とすることができる。
【００１４】本発明は、上述の判明した事実に基づいて完成に至ったものである。以下に、本発明の好ましい態様について述べるが，本発明はこれらに限定されるものではない。本発明のMK−7の製造方法は、大麦を使用する蒸留酒の製造において副生する蒸留残液を固液分離して、アミノ酸、ポリフェノール、有機酸、及びグリセロールを含有する液体分を得る第1の工程、該液体分に1重量％以上の糖類を添加する第2の工程、前記糖類を添加後の該液体分に含まれる酸を実質的に中和処理して調製液を得る第3の工程、該調製液を培地に用いてBacillus subtilisに属するMK−7生産菌を培養する第4の工程からなるものである。以下に、本発明のMK−7の製造方法を実施する際に原料として用いる蒸留残液、及び各工程について詳述する。
【００１５】本発明において言う蒸留残液は、（イ）大麦又は精白大麦を原料として大麦麹、及び蒸麦を製造し、得られた大麦麹、及び蒸麦中に含まれるでんぷんを麹、及び／又は酵素剤を使用して糖化し、さらに酵母によるアルコール発酵を行い熟成もろみを得、得られた熟成もろみを減圧蒸留または常圧蒸留等の蒸留装置を用いて蒸留して蒸留酒を製造する際に蒸留残渣として副生するもの、及び（ロ）大麦を原料として麦芽を製造し、得られた麦芽中に含まれるでんぷんを麦芽、及び／又は酵素剤を使用して糖化し、さらに酵母によるアルコール発酵を行い熟成もろみを得、得られた熟成もろみをポットスチルまたはパテントスチル等の蒸留装置を用いて蒸留して蒸留酒を製造する際に蒸留残渣として副生するものを意味する。このような蒸留残液としては、代表的には例えば大麦焼酎あるいはウイスキーの製造における蒸留残液が挙げられる。ウイスキーの製造における蒸留残液の場合は、大麦麦芽だけを原料とするモルトウイスキーはもちろんのこと、未発芽穀類を主原料とするグレインウイスキーにおいても一部に大麦麦芽を使用する場合に副生するウイスキー蒸留残液も本発明において言う蒸留残液に包含される。また焼酎の製造における蒸留残液の場合は、米焼酎、甘藷焼酎、そば焼酎の製造においても、これらの焼酎製造において原料の一部として大麦を使用する場合に副生する焼酎蒸留残液も本発明において言う蒸留残液に包含される。
【００１６】このように本発明のMK−7の製造方法において使用する、蒸留残液から得られる培地は、大麦、大麦麹、麦芽及び酵母に由来する成分を含有するものである。即ち、本発明において使用する蒸留残液から得られる培地は、従来のMK−7の製造に用いられている、大豆煮汁、蒸煮大豆、豆腐粕、及び醤油火入れオリなどの大豆に由来する材料の液体培地または固体培地とは全く異なるものである。この点具体的には、表1に示すように、本発明において用いる大麦を使用する焼酎製造で副生する大麦焼酎蒸留残液は、粗タンパク質(食品のタンパク質量を測定する場合、窒素含量を測定し、その値に窒素-タンパク質換算計数を乗じて算出した量のこと)が 約4%であり、主なアミノ酸として、プロリン、ロイシン、アルギニン、アラニン、及びグルタミン酸を含有する。且つ、該大麦焼酎蒸留残液は、焼酎製造における発酵過程において生産されるグリセロール、クエン酸、酢酸、及び乳酸、あるいは大麦に由来するポリフェノールなどの納豆菌の培養に好ましい栄養成分を含有する。よって本発明のMK−7の製造方法において使用する培地は、従来のMK−7製造方法において使用する培地から客観的に区別される明らかに別異のものである。
【００１７】ところで、上述の特開平10-295393号公報に記載のMK−7の製造方法においては、ブリックス濃度を5乃至10%に調整した大豆煮汁に1重量%以上のグリセロールを添加した培地を用いることにより、培養液中のビタミンＫ（MK−7）含量が高まる旨記載されている。一方、表1から明らかなように、本発明において用いる大麦を使用する焼酎製造で副生する大麦焼酎蒸留残液は、それ自体既に1.3%のグリセロールを含有する。従来のMK-7の製造方法における培地に使用する上述した大豆由来の材料は、こうした化合物は含有しておらず、当該化合物は該大豆由来の材料に別途添加されるものである。よって、本発明においては、MK−7の培地中での生産量を高めるについて、従来技術におけるようにグリセロールを添加する必要は全くない。即ち、本発明においてはグリセロールを別途添加することなくして、MK−7の生産量の向上が達成される。
【００１８】本発明において、蒸留酒の製造における蒸留工程で得られた蒸留残液を固液分離して、アミノ酸、ポリフェノール、有機酸、及びグリセロールを含有する液体分を得る第1の工程は、前記蒸留残液から原料大麦、麹あるいは麦芽由来の水不溶性の発酵残渣を除去し、液体分を得ることを目的として行うものである。この第1の工程においては、一般的にスクリュープレス方式やローラープレス方式、あるいはろ過圧搾式の固液分離機を用いて行うことが出来る。第1の工程で得た該液体分に、1重量％以上の糖類を添加する第2 の工程においては、該糖類として、グルコース、フルクトース、マルトース、及びスクロースからなる群から選ばれる一種又はそれ以上の単糖類又は二糖類を用いることができる。このような糖類を添加することにより、上述したように、培養液中のMK-7濃度を更に高め、且つ該培養液中のアンモニアの生成を抑制する（即ち、該培養液中のアンモニア濃度を低減する）ことが可能となる。第2の工程で得られた前記糖類添加後の該液体分に含まれる酸を実質的に中和処理して調製液を得る第3の工程においては、適当な中和剤を用いて中和処理することができ、こうした中和剤としては，水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を使用することができる。
【００１９】第3の工程で得られた前記調製液を培地に用いて、Bacillus subtilisに属するMK−7生産菌を培養する第4の工程においては、該MK-7生産菌としては、Bacillussubtilisに属するMK-7生産能を有する菌株であればいずれの菌株であっても用いることができる。特に好ましくは、Bacillus subtilisに属する代表的なMK−7生産菌である納豆菌を用いることができ、該納豆菌の具体例としては、市販納豆菌である成瀬菌、宮城野菌、及び高橋菌等を挙げることができる。これらの他に、MK−7生産能の高い納豆菌菌株を用いることもできる。前記培地を用いた該納豆菌の培養は、公知の液体培養法により行うことができるが、好ましくは、ジャーファーメンターなどを用いた通気攪拌培養により、培養温度40℃〜50℃の温度範囲で行うことが望ましい。この際、培養中の培養液のpH値は水酸化ナトリウム等を用いて7.0程度に保持するのが好ましい。
【００２０】本発明においては、前記第4の工程において得られる納豆菌の培養液、即ちMK-7を含有する培養液は、上述したようにアンモニアを含有するものであるが、 該培養液をアルカリ性に保持しながら曝気することにより該MK−７含有物質に含まれる前記アンモニアを容易に除去することができる。これによりアンモニアを含まないMK−７含有物質を得ることができ、そのまま食品或いはビタミン剤として使用することができる。また、公知の精製方法により、該MK−7を含有する培養液からアンモニアを除去するとともにMK−7を抽出してアンモニアを全く含まない高純度のMK−7含有物質を得ることができる。その場合の精製方法としては、例えば特開平8-73396号公報に記載されている、アルコールやエーテルなどの有機溶媒を用いる溶媒抽出法、活性炭を用いた吸着分別法、分子蒸留や水蒸気蒸留等の高真空蒸留を用いる蒸留法、合成吸着剤などを用いたクロマトグラフィー法等を用いることができる。この他、特開平11-32787号公報に記載されている、限外濾過膜や逆浸透膜を用いた分離濃縮法、及び乾燥操作により脱水する方法を用いることができる。この場合、有機溶媒の不存在下で脱水処理することにより、光に対する安定性の優れた高純度のMK−7含有物を得ることができる。
【００２１】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが，本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２２】
【実施例1】1．大麦焼酎蒸留残液からの培地の調製大麦焼酎製造の蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液1キロリットルを信和エンジニアリング（株）製のスクリュープレス方式の固液分離機で固液分離して約0.8キロリットルの液体分を得た。該液体分に1重量%のスクロースを添加した後、該液体分に水酸化ナトリウムを加えてそのpH値を7.0に調整して約0.9キロリットルの調製液を得た。得られた調製液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。
2．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られた液体に水酸化ナトリウム添加してそのpH値を7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。
3．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、上記1で得た培地1Lと上記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これにより、MK−7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産するMK−7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００２３】
【比較例1】本比較例においては、実施例1において使用する大麦焼酎蒸留残液から得られた液体分に代えて、納豆製造時に副生する大豆煮汁廃液を使用する以外は、実施例1と同様にしてMK−7を含有する納豆菌培養液を得た。
１．大豆煮汁廃液からの培地の調整納豆製造時に副生された大豆煮汁廃液に1重量%のスクロースを添加し、得られた液体に水酸化ナトリウムを加えてそのpH値を7.0に調整して調整液を得、得られた調整液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。
２．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。３．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、前記１で得た培地1Lと前記２で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これによりMK−7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産されるMK−7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００２４】
【比較例２】本比較例においては、上述した従来のMK−7製造方法の中で、大豆煮汁廃液にグリセロールを添加することにより、得られた培養液中のMK−7濃度を高めることができる旨記載されている特開平10-295393号公報に記載の方法に従って、納豆菌培養液を得た。即ち、実施例1において使用する大麦焼酎蒸留残液から得られる液体分に代えて大豆煮汁廃液にグリセロールを添加したものを使用する以外は、実施例1と同様にして納豆菌培養液を得た。１．大豆煮汁廃液からの培地の調整ブリックス濃度を10%に調整した大豆煮汁廃液に５重量％のグリセロールと1重量％のスクロースを添加し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整して調整液を得た。得られた調整液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。２．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。３．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、前記１で得た培地1Lと前記２で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これによりMK−7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産されるMK−7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００２５】
【実施例2】上述した従来のMK−7製造方法の中で、最も高いMK−7濃度を達成できる旨述べている特開平8-19378号公報に記載の方法に従って、納豆菌培養液を得た。但し、本実施例においては当該公報に記載の納豆製造時に副生された大豆煮汁廃液の代わりに、本発明において使用する大麦焼酎蒸留残液に糖類を添加することにより得られた培地を用いた。即ち、大麦焼酎製造における蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液1キロリットルを信和エンジニアリング（株）製のスクリュープレス方式の固液分離機で固液分離して約0.8キロリットルの液体分を得、該液体分に1重量%のグルコースを添加し、さらに該液体分に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整して約0.9キロリットルの調製液を得た。該調製液100mlを500ml容の三角フラスコに導入した後、綿栓をし、オートクレーブにて121℃×20minで蒸気加圧滅菌を行い、培地を得た。該培地にO.D.660nmが10.0の納豆菌胞子を無菌的に10μl接種し、48℃において120rpmで4日間振盪培養を行なうことによりMK−7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産されるMK−7は光により分解する恐れがあるため、前記三角フラスコの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００２６】
【比較例３】本比較例では、特開平8-19378号公報に記載の方法に従って納豆菌培養液を得た。但し、実施例2と同様に1重量%のグルコースを添加した培地を用いた。即ち、納豆製造時に副生された大豆煮汁廃液に1重量%のグルコースを添加し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7に調整して調整液を得た。得られた調整液100ml を500ml容の三角フラスコに導入した後、綿栓をし、オートクレーブにて121℃×20minで蒸気加圧滅菌を行い、培地を得た。該培地にO.D.660nmが10.0の納豆菌胞子を無菌的に10μl接種し、48℃において120rpmで4日間振盪培養を行うことによりMK−7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により得られるMK−7は光により分解する恐れがあるため、前記三角フラスコの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００２７】
【実施例3】本実施例では、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分に3重量%のグルコースを添加した培地を用いてMK−7を含有する納豆菌培養液を得た。
1．大麦焼酎蒸留残液からの培地の調製大麦焼酎製造の蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液1キロリットルを信和エンジニアリング（株）製のスクリュープレス方式の固液分離機で固液分離して約0.8キロリットルの液体分を得，該液体分に3重量%のグルコースを添加後、該液体分に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整して約0.9キロリットルの調製液を得た。得られた調製液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。
2．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。
3．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、前記1で得た培地1Lと前記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これによりMK−7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産されるMK−7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００２８】
【実施例4】本実施例では、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分に3重量%のスクロースを添加した培地を用いてMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。
1．大麦焼酎蒸留残液からの培地の調製大麦焼酎製造の蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液1キロリットルを信和エンジニアリング（株）製のスクリュープレス方式の固液分離機で固液分離して約0.8キロリットルの液体分を得，該液体分に3重量%のスクロースを添加後、該液体分に水酸化ナトリウムを添加し、そのpH値を7.0に調整して約0.9キロリットルの調製液を得、得られた調製液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。
2．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、水酸化ナトリウムを用いてpHを7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得、該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入し攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。
3．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、前記1で得た培地1Lと前記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これによりMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産されるMK-7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００２９】
【実施例5】本実施例では、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分に3重量%のフルクトースを添加した培地を用いてMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。
1．大麦焼酎蒸留残液からの培地の調製大麦焼酎製造の蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液1キロリットルを信和エンジニアリング（株）製のスクリュープレス方式の固液分離機で固液分離して約0.8キロリットルの液体分を得，該液体分に3重量%のフルクトースを添加後、該液体分に水酸化ナトリウムを添加し、そのpH値を7.0に調整して約0.9キロリットルの調製液を得、得られた調製液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。
2．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得、該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。
3．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、前記1で得た培地1Lと前記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これによりMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産されるMK-7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００３０】
【実施例6】本実施例では、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分に3重量%のマルトースを添加した培地を用いてMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。
1．大麦焼酎蒸留残液からの培地の調製大麦焼酎製造の蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液1キロリットルを信和エンジニアリング（株）製のスクリュープレス方式の固液分離機で固液分離して約0.8キロリットルの液体分を得，該液体分に3重量%のマルトースを添加後、該液体分に水酸化ナトリウムを添加して、そのpH値を7.0に調整して約0.9キロリットルの調製液を得、得られた調製液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。
2．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得、該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。
3．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、前記1で得た培地1Lと前記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これによりMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産されるMK-7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００３１】
【実施例7】本実施例では、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分に1.5重量%のグルコースと1.5重量%のスクロースを添加した培地を用いてMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。
1．大麦焼酎蒸留残液からの培地の調製大麦焼酎製造の蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液1キロリットルを信和エンジニアリング（株）製のスクリュープレス方式の固液分離機で固液分離して約0.8キロリットルの液体分を得，該液体分に1.5重量%のグルコースと1.5重量%のスクロースを添加後、該液体分に水酸化ナトリウムを添加して、そのpH値を7.0に調整して約0.9キロリットルの調製液を得、得られた調製液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。
2．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得、該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。
3．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、前記1で得た培地1Lと前記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これによりMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産されるMK-7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００３２】
【実施例8】本実施例では、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分に1.5重量%のグルコースと1.5重量%のフルクトースを添加した培地を用いてMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。
1．大麦焼酎蒸留残液からの培地の調製大麦焼酎製造の蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液1キロリットルを信和エンジニアリング（株）製のスクリュープレス方式の固液分離機で固液分離して約0.8キロリットルの液体分を得，該液体分に1.5重量%のグルコースと1.5重量%のフルクトースを添加後、該液体分に水酸化ナトリウムを添加して、そのpH値を7.0に調整して約0.9キロリットルの調製液を得、得られた調製液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。
2．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得、該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。
3．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、前記1で得た培地1Lと前記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これによりMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産されるMK-7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００３３】
【実施例9】本実施例では、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分に1.5重量%のグルコースと1.5重量%のマルトースを添加した培地を用いてMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。
1．大麦焼酎蒸留残液からの培地の調製大麦焼酎製造の蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液1キロリットルを信和エンジニアリング（株）製のスクリュープレス方式の固液分離機で固液分離して約0.8キロリットルの液体分を得，該液体分に1.5重量%のグルコースと1.5重量%のマルトースを添加後、該液体分に水酸化ナトリウムを添加して、そのpH値を7.0に調整して約0.9キロリットルの調製液を得、得られた調製液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。
2．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得、該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。
3．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、前記1で得た培地1Lと前記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これによりMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産されるMK-7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００３４】
【実施例10】本実施例では、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分に1重量%のグルコース、1重量%のマルトース、及び1重量%のフルクトースを添加した培地を用いてMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。
1．大麦焼酎蒸留残液からの培地の調製大麦焼酎製造の蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液1キロリットルを信和エンジニアリング（株）製のスクリュープレス方式の固液分離機で固液分離して約0.8キロリットルの液体分を得，該液体分に1重量%のグルコース、1重量%のマルトース、及び1重量%のフルクトースを添加後、該液体分に水酸化ナトリウムを添加して、そのpH値を7.0に調整して約0.9キロリットルの調製液を得、得られた調製液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。
2．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得、該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入して攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。
3．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、前記1で得た培地1Lと前記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これによりMK-7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産されるMK-7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００３５】
【比較例４】本比較例では、糖（グルコース）を大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分に添加しなかった以外は、実施例3と同様にしてMK−7を含有する納豆菌培養液を得た。
1．大麦焼酎蒸留残液からの培地の調製大麦焼酎製造における蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液1キロリットルを信和エンジニアリング（株）製のスクリュープレス方式の固液分離機で固液分離して約0.8キロリットルの液体分を得，該液体分に水酸化ナトリウムを加えてそのpH値を7.0に調整して約0.9キロリットルの調製液を得た。得られた調製液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。
2．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加してそのpH値を7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入て攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。
3．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、前記1で得た培地1Lと前記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これによりMK−7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産されるMK−7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００３６】
【実施例11】本実施例では、実施例１において使用する大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分に代えて、モルトウイスキー製造の蒸留工程で得られたウイスキー蒸留残液を固液分離して得られた液体分を使用する以外は、実施例１と同様にしてMK−7を含有する納豆菌培養液を得た。
1．ウイスキー蒸留残液からの培地の調製モルトウイスキー製造の蒸留工程で得られたウイスキー蒸留残液を固液分離して液体分を得た。該液体分に1重量%のグルコースを添加後、水酸化ナトリウムを添加して、そのpH値を7.0に調整することにより調製液を得た。得られた調製液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。
2．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加して、そのpH値を7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入て攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。
3．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、上記1で得た培地1Lと上記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これにより、MK−7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産するMK−7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００３７】
【比較例５】本比較例においては、実施例11において使用するウイスキー蒸留残液から得られた液体分に代えて、大豆煮汁廃液を使用した以外は、実施例11と同様にしてMK−7を含有する納豆菌培養液を得た。
1．大豆煮汁廃液からの培地の調製納豆製造時に副生された大豆煮汁廃液に1重量%のグルコースを添加し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加して、そのpH値を7.0に調整して調製液を得、得られた調製液を滅菌処理して納豆菌培養用の培地を得た。
2．納豆菌の前培養肉エキス10gとペプトン10gを蒸留水1Lに溶解し、得られた液体に水酸化ナトリウムを添加して、そのpH値を7.0に調整後、121℃、15分間の条件で滅菌処理を行い肉エキス培地を得た。該肉エキス培地5mlと市販納豆菌の宮城野菌1白金耳を試験管に導入て攪拌し、42℃で15時間振とう培養して納豆菌前培養液を得た。
3．納豆菌の本培養2L容ジャーファーメンターに、前記１で得た培地1Lと上記2で得た納豆菌前培養液5mlを導入し、通気量0.2vvm、攪拌速度300rpm、培養温度42℃の条件で、14日間培養を行った。これにより、MK-7を含有する納豆菌培養液を得た。なお、培養により生産するMK-7は光により分解する恐れがあるため、前記ジャーファーメンターの周囲を予めアルミホイルで覆って培養を行った。
【００３８】
【MK−7の定量】実施例1乃至実施例11、及び比較例1乃至比較例5で得られたそれぞれの納豆菌培養液中のMK−7濃度を以下の方法により定量した。即ち、実施例1乃至実施例11、及び比較例1乃至比較例5で得られたそれぞれの納豆菌培養液について、その1.5mlに、1.5mlのイソプロピルアルコールと5mlのヘキサンを加え、振とう後、1710g×10minの条件で遠心分離を行い、有機層と水層を得、該有機層4mlを回収し、該有機層4ml中に含まれるヘキサンをエバポレーターを用いて完全に除いた後、残った黄褐色の油を97%エタノール500μlに溶解し、以下に示す条件の高速液体クロマトグラフィーを用いてMK−7濃度を定量した。即ち、カラムにInertsil ODS 4.6×250mm（GLサイエンス社製）、ポストカラムに白金-アルミナ触媒（ビーズ）カラム4.6×50mm（白金-アルミナビーズは和光純薬工業株式会社製）を用い、97%エタノールを溶離液として、流速0.7ml/min、カラム温度40℃、サンプル注入量10μlとし、蛍光検出器（励起320nm、蛍光430nm）を用いて分析を行った。なお、MK−7の検量線作成のために、100ppmのMK−7標準試料を用いた。得られたMK−7の定量結果を、表2乃至表4に示す。
【００３９】
【アンモニアの定量】実施例1乃至実施例11、及び比較例1乃至比較例5で得られたそれぞれの納豆菌培養液中のアンモニア濃度を以下の方法により定量した。即ち、実施例1乃至実施例11、及び比較例1乃至比較例5で得られたそれぞれの納豆菌培養液について、マイクロフィルター(0.45μm)を通した該納豆菌培養液に等量の5%TCAを添加後、遠心分離して上清を得、得られた上清を0.02N HClで25倍希釈したものをサンプルとして、（株）日立製作所製L-8500型高速アミノ酸分析計を用いて測定した。得られたアンモニアの定量結果を、表2乃至表4に示す。
【００４０】
【評価1】前記MK−7の定量において得られた、実施例1、比較例1及び比較例2で得られた培養液中のMK−7の定量結果を表2に示す。表2に示した結果から明らかなように、実施例1で得られた培養液中のMK−7濃度が87.3mg/Lであったのに対して、比較例1で得られた培養液中のMK−7濃度は12.8mg/L、比較例2で得られた培養液中のMK−7濃度は35.5mg/L、であった。即ち、本発明の実施例1で得られた培養液中のMK−7濃度は、比較例 1で得られた培養液中のMK−7濃度の約6.8倍であり、比較例2で得られた培養液中のMK−7濃度の約2.5倍であることが判った。前記アンモニアの定量において得られた、実施例1、比較例1及び比較例2で得られた培養液中のアンモニアの定量結果を表2に示す。一般に、培養液中のアンモニア濃度は、MK-7濃度に比例して増加することが知られている。即ち、培地中のMK-7濃度が2倍になると、アンモニア濃度も約2倍に増加することが知られている。ところが、表2に示した結果から明らかなように、実施例1で得られた培養液中のアンモニア濃度が92.2 mg/Lであったのに対して、比較例1で得られた培養液中のアンモニア濃度は31.4mg/L、比較例2で得られた培養液中のアンモニア濃度は88.6mg/Lであった。即ち、比較例 1で得られた培養液中のアンモニア濃度は、該培養液中のMK−7濃度の約2.5倍であり、比較例2で得られた培養液中のアンモニア濃度は、該培養液中のMK−7濃度の約2.5倍である。これに対し、本発明の実施例1で得られた培養液中のアンモニア濃度は、該培養液中のMK−7濃度の約1.1倍（該MK−7濃度と略同程度）である。このことから本発明のMK−7の製造方法によれば、アンモニアの生成を抑制しつつ、MK−7を高収率で得られることが判った。そして、大麦焼酎製造における蒸留工程において副生する焼酎蒸留残液にスクロースを添加することにより得られる培地を用いた場合には、納豆製造時に副生された大豆煮汁廃液にスクロースを添加することにより得られる培地、或いは大豆煮汁廃液にグリセロールとスクロースを添加することにより得られる培地を用いた場合に比べて、アンモニアの生成を抑制しつつ、 MK-7を高収率で製造できることが判明した。
【００４１】
【評価2】上記MK−7の定量において得られた、実施例2及び比較例3で得られた培養液中のMK−7の定量結果を表3に示す。表3に示した結果から明らかなように、実施例2の大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する大麦製焼酎蒸留残液に1重量 %のグルコースを添加した培地を用いることにより得た培養液中のMK−7濃度が23.4mg/Lであったのに対して、比較例2の特開平8-19378号公報に記載の培地に1重量%のグルコースを添加することにより得られた培養液中のMK−7濃度は10.8mg/Lであった。すなわち、特開平8-19378号公報に記載の方法によれば、培養生産物中のMK−7の濃度は11.7mg/100ml（すなわち117mg/L）である旨記載されているが、この値は途方もなく高い濃度であり、斯かる高濃度を当該公報に記載の方法により達成することは全く不可能であることが明らかになった。そして、大麦焼酎製造における蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液に1重量%のグルコースを添加した培地を用いた場合には、納豆製造時に副生された大豆煮汁廃液に1重量 %のグルコースを添加した培地を用いた場合に比べて、得られる培養液中のMK−7濃度が、顕著に高まることが判明した。上記アンモニアの定量において得られた、実施例2及び比較例3で得られた培養液中のMK−7の定量結果を表3に示す。表3に示した結果から明らかなように、実施例2の大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する大麦製焼酎蒸留残液に1重量 %のグルコースを添加した培地を用いることにより得た培養液中のアンモニア濃度が24.5mg/Lであったのに対して、比較例3の特開平8-19378号公報に記載の培地に1重量%のグルコースを添加することにより得られた培養液中のアンモニア濃度は26.3mg/Lであった。即ち、比較例 3で得られた培養液中のアンモニア濃度は、該培養液中のMK−7濃度の約2.4倍であったのに対して、本発明の実施例2で得られた培養液中のアンモニア濃度は、該培養液中のMK−7濃度とほぼ同じであり、本発明のMK−7の製造方法においては、アンモニアの生成を抑制しつつ、MK−7を高収率で得られることがわかった。即ち、大麦焼酎製造における蒸留工程において副生する焼酎蒸留残液にグルコースを添加することにより得られる培地を用いた場合には、納豆製造時に副生された大豆煮汁廃液にグルコースを添加することにより得られる培地を用いた場合に比べて、アンモニアの生成を抑制しつつ、 MK-7を高収率で製造できることが判明した。
【００４２】
【評価3】大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分に他の糖類を添加することによっても、同様の効果が得られるかどうかを検討した。上記MK-7の定量において得られた、実施例3乃至実施例10、及び比較例4で得られた培養液中のMK-7の定量結果を表4に示す。表4に示した結果から明らかなように、実施例3乃至実施例10において、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分にグルコース、フルクトース、マルトース、及びスクロースからなる群から選ばれる一種又はそれ以上の単糖類又は二糖類を添加した培地を用いることにより得た培養液中のMK-7濃度は、比較例4の大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液のみの培地を用いることにより得た培養液中のMK-7濃度よりもいずれも高い値を示した。即ち、焼酎蒸留残液の液体分にグルコース、フルクトース、マルトース、及びスクロースからなる群から選ばれる一種又はそれ以上の単糖類又は二糖類を添加することにより、MK-7濃度がさらに高まることが明らかになった。上記アンモニアの定量において得られた、実施例3乃至実施例10、及び比較例4で得られた培養液中のMK-7の定量結果を表4に示す。表4に示した結果から明らかなように、実施例3乃至実施例10において、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分にグルコース、フルクトース、マルトース、及びスクロースからなる群から選ばれる一種又はそれ以上の単糖類又は二糖類を添加した培地を用いることにより得たそれぞれの培養液中のアンモニア濃度は、いずれにおいてもそれぞれの培養液中のMK-7濃度の約1.1倍であったのに対して、比較例4において大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する焼酎蒸留残液の液体分を培地に用いることにより得た培養液中のアンモニア濃度は、該培養液中のMK-7濃度の約2.8倍であった。即ち、焼酎蒸留残液の液体分にグルコース、フルクトース、マルトース、及びスクロースからなる群から選ばれる一種又はそれ以上の単糖類又は二糖類を添加することを特徴とする本発明のMK−7の製造方法においては、アンモニアの生成を抑制しつつ、MK−7を高収率で得られることが判った。以上述べた結果から明らかなように、本発明の大麦焼酎製造における蒸留工程で得られた焼酎蒸留残液の液体分に糖類を添加することにより得られる培地を用いることを特徴とするMK−7高含有物質の製造方法によれば、従来のMK−7製造方法に比べて、アンモニアの生成を抑制しつつ、MK-7を高収率で製造できることが判明した。
【００４３】
【評価4】実施例11及び比較例5で得られた培養液について上述したMK−7の定量法によりMK−7濃度の測定を行った。その結果、実施例11で得られた培養液のMK−7濃度は、比較例5で得られた培養液のMK−7濃度よりも顕著に高いことが判った。また、実施例11及び比較例5で得られた培養液について上述したアンモニアの定量法によりアンモニア濃度の測定を行った。その結果、実施例11で得られた培養液のアンモニア濃度は、比較例4で得られた培養液のアンモニア濃度よりも遥かに低いことが判った。即ち、ウイスキー製造の蒸留工程で副生するウイスキー蒸留残液に糖類を添加することにより得られた培地を用いた場合には、納豆製造時に副生する大豆煮汁廃液に糖類を添加することにより得られた培地を用いた場合に比べて、得られる培養液中のMK−7濃度は顕著に高く、且つ該培養液のアンモニア濃度は著しく低くなることが判明した。
【００４４】以上の結果から、本発明の大麦を使用する蒸留酒の製造において副生する蒸留残液に糖類を添加することにより得られる培地を用いることを特徴とするMK−7高含有物質の製造方法によれば、従来のMK-7製造方法に比べて、アンモニアの生成を抑制しつつ、MK−7濃度が飛躍的に高いMK−7高含有物を効率的に製造できることが判明した。
【００４５】
【実施例12】実施例1乃至実施例10の各実施例で得られた納豆菌培養液からMK-7を含有する油状物質を抽出した。即ち、実施例1乃至実施例10の各実施例で得られた納豆菌培養液に、該納豆菌培養液と同量のイソプロピルアルコールを導入し、次に該納豆菌培養液の３倍量のヘキサンを導入し、振とう後、1710g×10minの条件で遠心分離を行い、有機層と水層を得、該有機層を回収後、該有機層に含まれるヘキサンをエバポレーターを用いて完全に除くことにより、アンモニアを全く含まない黄褐色の油状物質を得た。
【００４６】
【比較例6】比較例1乃至比較例4の各比較例で得られた納豆菌培養液からMK-7を含有する油状物質を抽出した。即ち、比較例1乃至比較例4の各比較例で得られた納豆菌培養液に、該納豆菌培養液と同量のイソプロピルアルコールを導入し、次に該納豆菌培養液の３倍量のヘキサンを導入し、振とう後、1710g×10minの条件で遠心分離を行い、有機層と水層を得、該有機層を回収後、該有機層に含まれるヘキサンをエバポレーターを用いて完全に除くことにより、アンモニアを全く含まない黄褐色の油状物質を得た。
【００４７】
【評価5】実施例１２及び比較例６で得た、実施例1乃至実施例10及び比較例1乃至比較例4の夫々において得た納豆菌培養液から抽出したそれぞれの油状物質について、重量を測定し、更に該油状物質中のMK-7濃度を、上述したMK-7の定量法により測定した。得られた測定を結果を表5に示す。表5に示した結果から以下の事実が判明した。
（１）実施例1の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度は、20302ppmであったのに対して、比較例1の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度は1293ppm、比較例2の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度は3585ppmであった。即ち、実施例1の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度は、比較例1の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度の約15.7倍であり、比較例2の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度の約5.7倍であることが判明した。このことから、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する蒸留残液を固液分離して得られる液体分に糖類を添加したものを主たる構成成分とする培地を使用した場合には、大豆煮汁廃液に糖類を添加した培地、或いは大豆煮汁廃液にグリセロールと糖類を添加した培地を用いる場合に比べて、卓越したMK-7濃度の油状物質が得られることが判明した。
（２）実施例2の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度は5571ppmであったのに対して、比較例3の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度は1102ppmであった。即ち、実施例2の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度は、比較例3の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度の約5.1倍であることが判明した。このことから、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する蒸留残液を固液分離して得られる液体分に糖類を添加したものを主たる構成成分とする培地を使用した場合には、大豆煮汁廃液に糖類を添加した培地を用いる場合に比べて、卓越したMK-7濃度の油状物質が得られることが判明した。
（3）実施例3乃至実施例10の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度は、実施例3が26439ppm、実施例4が24333ppm、実施例5が23952ppm、実施例6が26048ppm、実施例7が24441ppm、実施例8が25902ppm、実施例9が23590ppm、実施例10が24762ppmであったのに対して、比較例4の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度は19488ppmであった。即ち、実施例3乃至実施例10の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度は、比較例4の培養液から得た油状物質中のMK-7濃度の1.2乃至1.4倍であることが判明した。このことから、大麦焼酎製造における蒸留工程で副生する蒸留残液を固液分離して得られる液体分に糖類を添加したものを主たる構成成分とする培地を使用した場合には、前記蒸留残液を固液分離して得られる液体分のみの培地を用いる場合に比べて、卓越したMK-7濃度の油状物質が得られることが判明した。
【００４８】
【表１】
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】
【表４】
【００５２】
【表５】
【００５３】
【発明の効果】以上詳述したように、本発明によれば、以下述べるような顕著な効果が奏される。即ち、大麦を使用する蒸留酒の製造において副生する蒸留残液を固液分離して液体分を得、該液体分に1重量％以上の糖類を添加後、該液体分に含まれる酸を実質的に中和して調製液を得、該調製液を滅菌処理することにより得られた培地を用いて、Bacillus subtilisに属するMK-7生産菌（即ち、納豆菌）を培養することにより、アンモニアの生成を抑制して、MK−7濃度が極めて高いMK-7含有物を効率的に安定して得ることができる。
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| 【出願人】 |
【識別番号】０００１７７５０８
【氏名又は名称】三和酒類株式会社
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| 【出願日】 |
平成１２年５月２６日（２０００．５．２６） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００９１１４４
【弁理士】
【氏名又は名称】荻上 豊規
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| 【公開番号】 |
特開２００１−３３３７９１（Ｐ２００１−３３３７９１Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１３年１２月４日（２００１．１２．４） |
| 【出願番号】 |
特願２０００−１５５７２７（Ｐ２０００−１５５７２７） |
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