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【発明の名称】 新規蛋白質、そのＤＮＡおよびその製造法
【発明者】 【氏名】大瀧 徹也

【氏名】新谷 靖

【氏名】寺尾 寧子

【氏名】熊野 聡
【要約】 【課題】Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンド活性を有するペプチドを含む新規蛋白質及びそのペプチドのアミドもしくはそのエステル又はその塩等、並びにそれを含有する医薬品の提供。

【解決手段】それぞれマウス由来又はラット由来の特定のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質又はその塩。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質またはその塩。
【請求項２】 該実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：２で表されるアミノ酸配列である請求項１記載の蛋白質またはその塩。
【請求項３】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３２から１４１番目のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項１記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項４】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２７から１４１番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する請求項３記載の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項５】 配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９０から１４１番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項３記載の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項６】 配列番号：２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９４から１４５番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項１記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項７】 配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１１０から１１９番目のアミノ酸配列を含有することを特徴とする請求項１記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項８】 配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１０５から１１９番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項９】 配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６８から１１９番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項７記載の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項１０】 請求項１記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項１１】 請求項３、６または７記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項１２】 ＤＮＡである請求項１０または１１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】 配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表される塩基配列を有する請求項１０記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】 請求項１０または１１記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１５】 請求項１４記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１６】 請求項１５記載の形質転換体を培養し、請求項１記載の蛋白質または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドを生成・蓄積せしめることを特徴とする請求項１記載の蛋白質もしくはその塩または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドまたはその塩の製造方法。
【請求項１７】 請求項１記載の蛋白質もしくはその塩または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
【請求項１８】 請求項１記載の蛋白質または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドのシグナル伝達を不活性化する中和抗体である請求項１７記載の抗体。
【請求項１９】 請求項１記載の蛋白質もしくはその塩または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、レセプターと請求項１記載の蛋白質もしくはその塩または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２０】 請求項１記載の蛋白質もしくはその塩または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、レセプターと請求項１記載の蛋白質もしくはその塩または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項２１】 レセプターが配列番号：７、配列番号：８または配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする蛋白質またはその塩である請求項１９記載のスクリーニング方法または請求項２０記載のスクリーニング用キット。
【請求項２２】 請求項１９記載のスクリーニング方法または請求項２０記載のスクリーニング用キットを用いて得ることのできる、レセプターと請求項１または請求項３ないし５のいずれか１項記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
【請求項２３】 アゴニストである請求項２２記載の化合物またはその塩。
【請求項２４】 請求項１９記載のスクリーニング方法または請求項２０記載のスクリーニング用キットを用いて得ることのできる、レセプターと請求項１記載の蛋白質もしくはその塩または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬組成物。
【請求項２５】 癌転移抑制剤である請求項２４記載の医薬組成物。
【請求項２６】 請求項１７記載の抗体を用いることを特徴とする、請求項１記載の蛋白質または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドの定量方法。
【請求項２７】 請求項１記載の蛋白質もしくはその塩または請求項３、６もしくは７記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬組成物。
【請求項２８】 癌転移抑制剤である請求項２７記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ラット脳幹周辺部およびヒト脳由来の新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対するリガンド活性を有するペプチドを含む蛋白質およびそのペプチドのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などに関する。
【０００２】
【従来の技術】多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、細胞膜に存在する特異的なレセプター蛋白質を通じて生体の機能を調節している。これらのレセプター蛋白質のうち多くは共役しているguanine nucleotide-binding protein（以下、Ｇ蛋白質と略称する場合がある）の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行ない、また７個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質あるいは７回膜貫通型レセプター蛋白質（７ＴＭＲ）と総称される。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在し、それら細胞や臓器の機能を調節する分子、例えばホルモン、神経伝達物質および生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。レセプターは生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、このシグナルにより細胞の賦活や抑制といった種々の反応が惹起される。各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質、特にはＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
【０００３】例えば、生体の種々の器官では、多くのホルモン、ホルモン様物質、神経伝達物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。特に、生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、それぞれに対応するレセプター蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。生体内には未だ未知のホルモンや神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、それらのレセプター蛋白質の構造に関しても、これまで報告されていないものが多い。さらに、既知のレセプター蛋白質にいてもサブタイプが存在するかどうかについても分かっていないものが多い。生体における複雑な機能を調節する物質と、その特異的レセプター蛋白質との関係を明らかにすることは、医薬品開発に非常に重要な手段である。また、レセプター蛋白質に対するアゴニスト、アンタゴニストを効率よくスクリーニングし、医薬品を開発するためには、生体内で発現しているレセプター蛋白質の遺伝子の機能を解明し、それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。近年、生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、ｃＤＮＡの配列をランダムに解析する研究が活発に行なわれており、このようにして得られたｃＤＮＡの断片配列がExpressed Sequence Tag（ＥＳＴ）としてデータベースに登録され、公開されている。しかし、多くのＥＳＴは配列情報のみであり、その機能を推定することは困難である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来、Ｇ蛋白質共役型レセプターと生理活性物質（即ち、リガンド）との結合を阻害する物質や、結合して生理活性物質（即ち、リガンド）と同様なシグナル伝達を引き起こす物質は、これらレセプターの特異的なアンタゴニストまたはアゴニストとして、生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。従って、このように生体内での生理発現において重要であるばかりでなく、医薬品開発の標的ともなりうるＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質を新規に見出し、その新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質の特異的リガンドを見出すことは、アゴニスト、アンタゴニストを見出す際に、非常に重要な手段となる。さらにその際、レセプターの生理機構を明らかにするため、ヒトレセプター遺伝子あるいはリガンド遺伝子に対する例えば齧歯類（ラット、マウスなど）やチンパンジー、サル等のカウンターパート遺伝子を取得し、その遺伝子産物の蛋白化学的諸性質、生物学的諸活性を検索し、また動物体内での質的、量的動態や生理機構を詳細に調べて、ヒトにおける機能を推定することは、有効な医薬を創製する上でも重要な事柄である。さらに候補となるアゴニスト、アンタゴニストを選択する際に、種差の有無を認識しながら、候補化合物を選定、決定することは、医薬品の創製上欠くべからざる項目となっている。本発明は、上記のように、有用なヒト新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する特異的なヒト由来のリガンドの、ラットおよびマウスホモログリガンド（以下、「本発明のリガンド蛋白質」と称する場合がある）を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、これまでにラット脳幹周辺部およびヒト脳由来のＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に対する細胞内Ｃａイオン濃度上昇活性を有するペプチドを探索した。その結果、ガン転移抑制遺伝子ＫｉＳＳ−１（Genomics, 54巻, 145頁-148頁, 1998年）にコードされる蛋白質のＣ端ペプチドが本レセプターを活性化する作用を有することを明らかにし、ＫｉＳＳ−１中のアミノ酸５４残基からなるペプチド配列さらにそのＣ端部分ペプチドにリガンド活性を有することを確認した（特開２０００−３１２５９０号）。
【０００６】ＫｉＳＳ−１遺伝子産物から切り出されて生成するペプチドには、その遺伝子がガン転移抑制遺伝子であることから、ガン転移抑制活性を有することが期待される。それ以外にも、本遺伝子が胎盤に多量に発現されていることや該Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質のヒト型レセプターであるｈＯＴ７Ｔ１７５（ｈはヒト由来であることを示す）が胎盤に多量に発現されていることを鑑み、該ペプチドが胎盤で重要な機能を担っていることも予想される。また、ヒトでは膵臓にもレセプターの発現が比較的高く、膵臓においても本ペプチドは何らかの生理機能を現しているものと期待される。また、ラットリガンド、ラット型レセプターであるｒＯＴ７Ｔ１７５（ｒはラット由来であることを示す）はともに盲腸、大腸に高い発現量があり、このような臓器においても本ペプチドは何らかの生理機能を現しているものと期待される。本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、ヒト型ＫｉＳＳ−１遺伝子配列を基に作成したＰＣＲプライマーを用いて、ラット肝臓ｃＤＮＡよりヒト型Ｋｉｓｓ−１遺伝子に相同性の高い配列をコードするｃＤＮＡを単離し、その全塩基配列を解析することに成功した。そして、この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、ヒト型ＫｉＳＳ−１アミノ酸配列と有意に高い相同性を有する蛋白質をコードすることを確認した。一方、マウス胚ｃＤＮＡより同様にヒト型ＫｉＳＳ−１遺伝子に相同性の高い配列をコードするｃＤＮＡを単離し、その配列がヒトおよびラット型ＫｉＳＳ−１アミノ酸配列と有意に高い相同性を有する蛋白質をコードする配列であることを確認した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、（１） 配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とする蛋白質またはその塩、（２） 該実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号：２で表されるアミノ酸配列である上記（１）記載の蛋白質またはその塩、（３） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３２から１４１番目のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（１）記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、（４） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２７から１４１番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する上記（３）記載の部分ペプチドまたはその塩、（５） 配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９０から１４１番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する上記（３）記載の部分ペプチドまたはその塩、（６） 配列番号：２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９４から１４５番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する上記（１）記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、（７） 配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１１０から１１９番目のアミノ酸配列を含有することを特徴とする上記（１）記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、（８） 配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１０５から１１９番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩、（９） 配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６８から１１９番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する上記（７）記載の部分ペプチドまたはその塩、（１０） 上記（１）記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、（１１） 上記（３）、（６）または（７）記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、（１２） ＤＮＡである上記（１０）または（１１）記載のポリヌクレオチド、（１３） 配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６で表される塩基配列を有する上記（１０）記載のポリヌクレオチド、（１４） 上記（１０）または（１１）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、（１５） 上記（１４）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、（１６） 上記（１５）記載の形質転換体を培養し、上記（１）記載の蛋白質または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドを生成・蓄積せしめることを特徴とする上記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまたはその塩の製造方法、（１７） 上記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（１８） 上記（１）記載の蛋白質または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドのシグナル伝達を不活性化する中和抗体である上記（１７）記載の抗体、（１９） 上記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、レセプターと上記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、（２０） 上記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、レセプターと上記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、（２１） レセプターが配列番号：７、配列番号：８または配列番号：２４で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする蛋白質またはその塩である上記（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２０）記載のスクリーニング用キット、（２２） 上記（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２０）記載のスクリーニング用キットを用いて得ることのできる、レセプターと上記（１）または上記（３）ないし（５）のいずれか１項記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、（２３） アゴニストである上記（２２）記載の化合物またはその塩、（２４） 上記（１９）記載のスクリーニング方法または上記（２０）記載のスクリーニング用キットを用いて得ることのできる、レセプターと上記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬組成物、（２５） 癌転移抑制剤である上記（２４）記載の医薬組成物、（２６） 上記（１７）記載の抗体を用いることを特徴とする、上記（１）記載の蛋白質または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドの定量方法、（２７） 上記（１）記載の蛋白質もしくはその塩または上記（３）、（６）もしくは（７）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬組成物、（２８） 癌転移抑制剤である上記（２７）記載の医薬組成物などに関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明の蛋白質は、上記のヒト新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質（ｈＯＴ７Ｔ１７５）に対する特異的なヒト由来のリガンドの、ラットおよびマウスのホモログ、ならびにそれらの成熟形態である。これらの蛋白質は、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、サル、ラット、マウス、 モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）のあらゆる細胞（例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など（特に、脳や脳の各部位）に由来する蛋白質であってもよく、また合成蛋白質であってもよい。
【０００９】本発明の蛋白質は、Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質に特異的に結合する性質を有する。Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質としては、ヒト由来のＯＴ７Ｔ１７５、ラット由来のＯＴ７Ｔ１７５、またはサル、マウス等の哺乳動物のＯＴ７Ｔ１７５ホモログ等が挙げられる。本発明の蛋白質は、具体的には、マウス型１およびマウス型２と称されるマウス由来の蛋白質（それぞれ配列番号：１および配列番号：２に示すアミノ酸配列を含有）、ならびにラット型の蛋白質（配列番号：３に示すアミノ酸配列を含有）、さらにそれらの蛋白質の成熟体ポリペプチドを包含する。マウス型１の成熟体ポリペプチドは配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９０から１４１番目のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、マウス型２の成熟体ポリペプチドは配列番号：２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９４から１４５番目のアミノ酸配列を有する蛋白質であり、ラット型の成熟体ポリペプチドは配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６８から１１９番目のアミノ酸配列を有する蛋白質である。
【００１０】本明細書において、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、（１）対照となるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１個または２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）対照となるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１個または２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）対照となるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１個または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（４）それらを組み合わせたアミノ酸配列を意味する。具体的には、例えば、配列番号：１または３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としてはは、配列番号：１または３で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列等が挙げられる。
【００１１】本発明の蛋白質と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、および実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質は、本発明の蛋白質と実質的に同質の性質を有している。すなわち、これらの蛋白質はＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質に特異的に結合する性質を有する。好ましいレセプターとしては、ヒト由来のＯＴ７Ｔ１７５（配列番号：７に示す）、ラット由来のＯＴ７Ｔ１７５（配列番号：８に示す）およびマウス由来のＯＴ７Ｔ１７５（配列番号：２４に示す）がある。詳細には、かかる性質はＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質への結合活性、シグナル情報伝達作用（活性）等が挙げられ、それらの性質または活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量等の量的要素は異なっていてもよい。これらの活性の測定は、自体公知の方法に準じて行うことができるが、例えば、後述するスクリーニング法に従って測定することもできる。本発明の蛋白質と実質的に同質の性質を有する蛋白質もまた、本発明の蛋白質に包含される。
【００１２】本明細書において本発明の蛋白質を記載する場合、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するリガンド蛋白質をはじめとする、本発明のリガンド蛋白質は、Ｃ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート(−ＣＯＯ−）であるが、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）であってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明のリガンド蛋白質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のリガンド蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明のリガンド蛋白質には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。本発明のリガンド蛋白質の具体例としては、例えば、配列番号：１および２で表わされるアミノ酸配列を含有するマウス由来のリガンド蛋白質（それぞれマウス型１およびマウス型２）または配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するラット由来のリガンド蛋白質（ラット型）などがある。
【００１３】本発明のリガンド蛋白質の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）も本発明に包含され、本発明のリガンド蛋白質の部分ペプチドであれば何れのものであってもよいが、上記した性質を有するものであることが必須である。具体的には、配列番号：１、２または３で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質の部分ペプチドとしては、上記したこれらの成熟体が典型例である。さらにそれらの成熟体の部分ペプチドも、上記した性質を有しているかぎり、本発明に包含されることはいうまでもない。すなわち、配列番号：１、２または３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の部分ペプチドとして具体的には、（a）配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９０から１４１番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（b）配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３４から１４１番目のアミノ酸配列を含有し、８ないし５２個のアミノ酸残基からなるポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（c）配列番号：２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から９４から１４５番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（d）配列番号：２で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３８から１４５番目のアミノ酸配列を含有し、８ないし５２個のアミノ酸残基からなるポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（e）配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６８から１１９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（f）配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１１２から１１９番目のアミノ酸配列を含有し、８ないし５２個のアミノ酸残基からなるポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（g）配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３２から１４１番目のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（h）配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２７から１４１番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（i）配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１１０から１１９番目のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、（j）配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１０５から１１９番目のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などが挙げられる。上記（a）〜（j）に記載のポリペプチドはそのＣ末端がアミド体であるものが好ましい。実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらのアミノ酸配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。このうち、好ましくは上記（a）〜（j）に記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩であり、さらに好ましくは、i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１３２から１４１番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１２７から１４１番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、iii）配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１１０から１１９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、iv）配列番号：３で表されるアミノ酸配列のＮ末端から１０５から１１９番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩である。これらのポリペプチドはそのＣ末端がアミド体であるものが好ましい。
【００１４】また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個（１または２個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。また、本発明の部分ペプチドはＣ末端が通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）またはカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、前記した本発明のリガンド蛋白質のごとく、Ｃ末端がアミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）（Ｒは上記と同意義を示す）であってもよい。さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のリガンド蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される塩基もしくは酸との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１５】本発明のリガンド蛋白質またはその塩は、前述したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のリガンド蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、後述する本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述の蛋白質合成法またはこれに準じた方法により製造することもできる。ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１６】本発明のリガンド蛋白質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩またはそれらのアミド体の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（2',4'-ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質またはそれらのアミド体を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt, HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１７】保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１８】原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などである。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl２-Bzl、２−ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、４-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。
【００１９】原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００２０】原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。蛋白質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（蛋白質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質とを製造し、この両蛋白質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質を得ることができる。この粗蛋白質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質のアミド体を得ることができる。蛋白質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、蛋白質のアミド体と同様にして、所望の蛋白質のエステル体を得ることができる。
【００２１】本発明のリガンド蛋白質の部分ペプチドは、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のリガンド蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のリガンド蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の■〜■に記載された方法が挙げられる。■M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)■SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)■泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
■矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)■矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００２２】本発明のリガンド蛋白質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明のリガンド蛋白質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。本発明のリガンド蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」15(7)、1997記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明のリガンド蛋白質のｍＲＮＡを定量することができる。本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。具体的には、本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４〜６の何れかで表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４〜６の何れかで表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のリガンド蛋白質と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。配列番号：４〜６の何れかで表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４〜６の何れかで表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２３】ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook etal., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。また、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。さらに配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。本発明に従えば、本発明のリガンド蛋白質遺伝子の複製又は発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化したあるいは決定された蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、蛋白質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成又は機能を阻害することができるか、あるいはリガンド蛋白質関連ＲＮＡとの相互作用を介してリガンド蛋白質遺伝子の発現を調節・制御することができる。リガンド蛋白質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、及びリガンド蛋白質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内及び生体外でリガンド蛋白質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療又は診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列又は核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列又は核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列又はその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。リガンド蛋白質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳開始コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、及び３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、リガンド蛋白質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００２４】目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、プリン又はピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー）又は特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（又は非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」及び「核酸」とは、プリン及びピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。こうした修飾物は、メチル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン及びピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００２５】本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al.,Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピッド、コレステロールなど）といった粗水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それらに限定されるものではない。アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のリガンド蛋白質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００２６】本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Reverse TranscriptasePolymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：４〜６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：４〜６で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明のリガンド蛋白質と実質的に同質の活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するリガンド蛋白質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。配列番号：４〜６で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡの典型例としては、本発明のリガンド蛋白質の成熟体をコードするＤＮＡ等が挙げられる。配列番号：４〜６で表わされる塩基配列ハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４〜６で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２７】本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチド（以下、本発明のリガンド蛋白質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のリガンド蛋白質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のリガンド蛋白質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２８】ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化された本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。本発明のリガンド蛋白質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００２９】ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００３０】発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のリガンド蛋白質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。このようにして構築された本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００３１】宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６０巻，１６０(１９６８)〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Research），９巻，３０９(１９８１)〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology）〕，１２０巻，５１７(１９７８)〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９(１９６９)〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Genetics），３９巻，４４０(１９５４)〕などが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５(１９８３)〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），９５巻，８７(１９８４)〕などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。
【００３２】昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveＴＭ 細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００３３】エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），６９巻，２１１０(１９７２)やジーン（Gene），１７巻，１０７(１９８２)などに記載の方法に従って行なうことができる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），１６８巻，１１１(１９７９)などに記載の方法に従って行なうことができる。酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6, 47-55(1988)）などに記載の方法に従って行なうことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），５２巻，４５６(１９７３)に記載の方法に従って行なうことができる。このようにして、本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３４】エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Journal of Experiments in Molecular Genetics），４３１−４３３，Cold Spring Harbor Laboratory, New York１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７７巻，４５０５(１９８０)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００３５】宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C.,ネイチャー（Nature）,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding ofthe Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。以上のようにして、形質転換体の細胞膜に本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチドを生成せしめることができる。
【００３６】上記培養物から本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチドの精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３７】かくして得られる本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチドが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。なお、組換え体が産生する本発明のリガンド蛋白質またはその部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくして生成する本発明のリガンド蛋白質またはその塩、本発明の部分ペプチドもしくはそのエステルもしくはそのアミドまたはその塩の活性は、標識したレセプターとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
【００３８】本発明のリガンド蛋白質またはその塩、その部分ペプチドもしくはそのエステルもしくはそのアミドまたはその塩（以下、本発明のリガンド蛋白質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のリガンド蛋白質を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明のリガンド蛋白質に対する抗体は、本発明のリガンド蛋白質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００３９】〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製本発明のリガンド蛋白質に対するレセプター（以下「レセプタ−」という場合もある）は、哺乳動物に対して投与することにより抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化された本発明のリガンド蛋白質とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００４０】モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、本発明のリガンド蛋白質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した本発明のリガンド蛋白質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４１】（ｂ）モノクローナル抗体の精製モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００４２】〔ポリクローナル抗体の作製〕本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（リガンド蛋白質抗原）とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のリガンド蛋白質またはレセプター蛋白質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０.１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００４３】本発明のリガンド蛋白質またはその塩、その部分ペプチドもしくはそのエステルもしくはそのアミドまたはその塩、およびそれをコードするＤＮＡは、（１）本発明のリガンド蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤、（２）遺伝子診断剤、（３）本発明のリガンド蛋白質に対するレセプターの定量、（４）本発明のリガンド蛋白質とレセプターとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング、（５）本発明のリガンド蛋白質とレセプターとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）を含有する各種疾病の予防および／または治療剤、（６）本発明のリガンド蛋白質の定量、（７）本発明のリガンド蛋白質に対する抗体による中和、（８）本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを有する非ヒト動物の作製などに用いることができる。特に、本発明の組換え型リガンド蛋白質の発現系を用いた、後述のレセプターとの結合アッセイ系を用いることによって、ヒトや哺乳動物に特異的な本発明のリガンド蛋白質に対するレセプターの結合性を変化させる化合物（例、アゴニスト、アンタゴニストなど）をスクリーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタゴニストを後述の各種疾病の予防・治療剤などとして使用することができる。本発明のリガンド蛋白質、およびそれをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）および本発明のリガンド蛋白質に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）等の用途について、以下に具体的に説明する。
【００４４】（１）本発明のリガンド蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤本発明のリガンド蛋白質または該リガンド蛋白質をコードするＤＮＡを、本発明のリガンド蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤などの医薬として使用することができる。例えば、生体内において本発明のリガンド蛋白質が減少しているためにレセプターの生理作用が期待できない（該リガンド蛋白質の欠乏症）患者がいる場合に、■本発明のリガンド蛋白質を該患者に投与し該リガンド蛋白質の量を補充したり、■（イ）本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを該患者に投与し発現させることによって、あるいは（ロ）対象となる細胞に本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを挿入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内における本発明のリガンド蛋白質の量を増加させ、それに対するレセプターの作用を充分に発揮させることができる。したがって、本発明のリガンド蛋白質および本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡは、安全で低毒性な本発明のリガンド蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤などの医薬として有用である。本発明のリガンド蛋白質よび本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡは、癌転移抑制活性を有するため、あらゆる癌（例えば、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、乳癌等）の予防または治療薬に有用である。また、レセプター蛋白質に対するアゴニストは、胎盤機能調節作用を有するため、絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常または分娩誘発の予防または治療薬に有用である。本発明のリガンド蛋白質を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。一方、本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）を上記予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。例えば、■本発明のリガンド蛋白質または■該リガンド蛋白質をコードするＤＮＡは、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、■本発明のリガンド蛋白質または■該リガンド蛋白質をコードするＤＮＡを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００４５】錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００４６】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。本発明のリガンド蛋白質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４７】（２）遺伝子診断剤本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡまたはレセプター蛋白質をコードするＤＮＡは、プローブとして使用することにより、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）における本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Genomics），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
【００４８】（３）本発明のリガンド蛋白質に対するレセプターの定量法レセプター蛋白質は、本発明のリガンド蛋白質に対して結合性を有しているので、生体内におけるレセプター濃度を感度良く定量することができる。本発明の定量法は、例えば、競合法と組み合わせることによって用いることができる。すなわち、被検体を本発明のリガンド蛋白質と接触させることによって被検体中のレセプター濃度を測定することができる。具体的には、例えば、以下の■または■などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いることができる。
■入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）
■入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）
【００４９】（４）本発明のリガンド蛋白質またはその塩とレセプターとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニストなど）のスクリーニング方法本発明のリガンド蛋白質に対するレセプター蛋白質またはその塩を用いるか、または組換え型レセプター蛋白質の発現系を構築し、該発現系を用いたレセプター結合アッセイ系を用いることによって、本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。ここで使用するレセプターとしては、性質等が十分に知られているもの、例えばＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質、特にヒト、マウスまたはラットのＯＴ７Ｔ１７５等が好ましい。このような化合物には、（イ）例えば、Ｇ蛋白質共役型レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を有する化合物（いわゆる、レセプター蛋白質に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、レセプター蛋白質に対するアンタゴニスト）、あるいは（ハ）本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合力を減少させる化合物などが含まれる。すなわち、本発明は、（ｉ）本発明のリガンド蛋白質と本発明のレセプター蛋白質とを接触させた場合と（ii）本発明のリガンド蛋白質および試験化合物とレセプター蛋白質とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法においては、（ｉ）と（ii）の場合における、例えば、本発明のリガンド蛋白質に対するレセプターの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
【００５０】より具体的には、本発明は、■標識した本発明のリガンド蛋白質を、レセプター蛋白質に接触させた場合と、標識した本発明のリガンド蛋白質および試験化合物をレセプター蛋白質に接触させた場合における、標識した本発明のリガンド蛋白質の該レセプター蛋白質に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法（この場合、リガンドではなくレセプターを標識してもよい）、■標識した本発明のリガンド蛋白質を、レセプター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識した本発明のリガンド蛋白質および試験化合物をレセプター蛋白質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した本発明のリガンド蛋白質の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、■標識した本発明のリガンド蛋白質を、本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプター蛋白質に接触させた場合と、標識した本発明のリガンド蛋白質および試験化合物を本発明のＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプター蛋白質に接触させた場合における、標識した本発明のリガンド蛋白質の該レセプター蛋白質等に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、【００５１】■本発明のリガンド蛋白質をレセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のリガンド蛋白質をおよび試験化合物をレセプター蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、レセプターを介した細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のリガンド蛋白質と本発明のレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および■本発明のリガンド蛋白質をレセプターＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプター蛋白質に接触させた場合と、本発明のリガンド蛋白質および試験化合物をレセプターＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプター蛋白質に接触させた場合における、レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を測定し、比較することを特徴とする本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提供する。
【００５２】上記■〜■いずれかの方法を用いることによって、リガンドとＧ蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合を阻害する化合物を効率良くスクリーニングすることができる。さらに、スクリーニングされた化合物がアゴニストかアンタゴニストかを簡便に評価することができる。本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。まず、本発明のスクリーニング方法に用いるレセプター蛋白質としては、前記したレセプター蛋白質を含有するものであれば何れのものであってもよいが、レセプター蛋白質を含有する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、スクリーニングに用いる大量のレセプター蛋白質を得るには、組換え体を用いて大量発現させたレセプター蛋白質などが適している。
【００５３】レセプター蛋白質を製造するには、前述の方法が用いられるが、そのＤＮＡを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするＤＮＡ断片には相補ＤＮＡが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成ＤＮＡを用いてもよい。レセプター蛋白質をコードするＤＮＡ断片を宿主動物細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該ＤＮＡ断片を昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス（nuclear polyhedrosis virus；ＮＰＶ）のポリヘドリンプロモーター、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。例えば、文献〔Nambi，P．ら、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）,267巻,19555〜19559頁,1992年〕に記載の方法に従って行なうことができる。したがって、本発明のスクリーニング方法において、レセプター蛋白質を含有するものとしては、それ自体公知の方法に従って精製したレセプター蛋白質であってもよいし、該レセプター蛋白質を含有する細胞を用いてもよく、また該レセプター蛋白質を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
【００５４】本発明のスクリーニング方法において、レセプター蛋白質を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。レセプター蛋白質を含有する細胞としては、該レセプター蛋白質を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが好ましい。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したレセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。該レセプター蛋白質を含有する細胞や膜画分中のレセプター蛋白質の量は、１細胞当たり１０３〜１０８分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００５５】本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の■〜■を実施するためには、例えば、適当なレセプター蛋白質画分と、標識したリガンドが必要である。レセプター蛋白質画分としては、天然型のレセプター蛋白質画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型レセプター蛋白質画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などを示す。標識したリガンドとしては、標識したリガンド、標識したリガンドアナログ化合物などが用いられる。例えば〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識されたリガンド（本発明のリガンド蛋白質）などが用いられる。具体的には、本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まずレセプター蛋白質を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター蛋白質標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドとレセプター蛋白質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターや本発明のリガンド蛋白質の分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のリガンド蛋白質を添加し、同時に１０−４Ｍ〜１０−１０Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のリガンド蛋白質を加えた反応チューブも用意する。反応は約０℃から５０℃、望ましくは約４℃から３７℃で、約２０分から２４時間、望ましくは約３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ０）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ０−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が、例えば、５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００５６】本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物スクリーニングする前記の■〜■の方法を実施するためには、例えば、レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、レセプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当なレセプター蛋白質を発現した細胞が必要である。レセプター蛋白質を発現した細胞としては、天然型のレセプター蛋白質を有する細胞株、前述の組換え型レセプター蛋白質を発現した細胞株などが望ましい。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【００５７】本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、レセプター蛋白質、レセプター蛋白質を含有する細胞、またはレセプター蛋白質を含有する細胞の膜画分を含有するものなどである。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬■測定用緩衝液および洗浄用緩衝液Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、０.０５％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。孔径０.４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
■Ｇ蛋白質共役型レセプター標品レセプター蛋白質を発現させたＣＨＯ細胞を、１２穴プレートに５×１０５個／穴で継代し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％ａｉｒで２日間培養したもの。
■標識リガンド市販の〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などで標識した本発明のリガンド蛋白質水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて１μＭに希釈する。
■リガンド標準液本発明のリガンド蛋白質を０.１％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＰＢＳで１ｍＭとなるように溶解し、−２０℃で保存する。
【００５８】２．測定法■１２穴組織培養用プレートにて培養したレセプター蛋白質発現ＣＨＯ細胞を、測定用緩衝液１ｍｌで２回洗浄した後、４９０μｌの測定用緩衝液を各穴に加える。
■１０−３〜１０−１０Ｍの試験化合物溶液を５μｌ加えた後、標識リガンドを５μｌ加え、室温にて１時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに１０−３Ｍのリガンドを５μｌ加えておく。
■反応液を除去し、１ｍｌの洗浄用緩衝液で３回洗浄する。細胞に結合した標識リガンドを０.２Ｎ ＮａＯＨ−１％ＳＤＳで溶解し、４ｍｌの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
■液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（ＰＭＢ）を次の式〔数１〕で求める。
【００５９】〔数１〕
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ０−ＮＳＢ）］×１００ＰＭＢ：Percent Maximum BindingＢ ：検体を加えた時の値ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ０ ：最大結合量【００６０】本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩は、本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（イ）Ｇ蛋白質共役型レセプターを介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を有する化合物（いわゆる、レセプター蛋白質に対するアゴニスト）、（ロ）該細胞刺激活性を有しない化合物（いわゆる、レセプター蛋白質に対するアンタゴニスト）、あるいは（ハ）本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合力を減少させる化合物である。該化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。レセプター蛋白質に対するアゴニストは、レセプター蛋白質に対する本発明のリガンド蛋白質が有する生理活性と同様の作用を有しているので、該リガンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。具体的には、レセプター蛋白質に対するアゴニストは癌転移抑制活性を有するため、あらゆる癌（例えば、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、乳癌等）の予防または治療薬に有用である。また、レセプター蛋白質に対するアゴニストは、胎盤機能調節作用を有するため、絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常または分娩誘発の予防または治療薬に有用である。レセプター蛋白質に対するアンタゴニストは、レセプター蛋白質に対する本発明のリガンド蛋白質が有する生理活性を抑制することができるので、該リガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。本発明のリガンド蛋白質とレセプター蛋白質との結合力を減少させる化合物は、レセプター蛋白質に対する本発明のリガンド蛋白質が有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
【００６１】本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩を上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のＤＮＡを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。該化合物またはその塩（アゴニストの場合）の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６２】（５）本発明のリガンド蛋白質とレセプターとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）を含有する各種疾病の予防および／または治療剤本発明のリガンド蛋白質は前述のとおり、癌転移抑制活性を有するため、あらゆる癌（例えば、肺癌、胃癌、肝癌、膵癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、乳癌等）の予防または治療薬に有用である。また、レセプター蛋白質に対するアゴニストは、胎盤機能調節作用を有するため、絨毛癌、胞状奇胎、侵入奇胎、流産、胎児の発育不全、糖代謝異常、脂質代謝異常または分娩誘発の予防または治療薬に有用である。従って、本発明のリガンド蛋白質とレセプターとの結合性を変化させる化合物（アゴニスト、アンタゴニスト）は、本発明のリガンド蛋白質の機能不全または不足もしくは過剰に関連する疾患の予防および／または治療剤として用いることができる。該化合物を本発明のリガンド蛋白質の機能不全または不足もしくは過剰に関連する疾患の予防および／または治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該化合物は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物を生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００６３】錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【００６４】また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６５】（６）本発明のリガンド蛋白質の定量本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体は、本発明のリガンド蛋白質またはレセプターを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のリガンド蛋白質またはレセプターの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、（ｉ）本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体と、被検液および標識化リガンド蛋白質またはレセプターとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化リガンド蛋白質またはレセプターの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のリガンド蛋白質またはレセプターの定量法、（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体および標識化された本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のリガンド蛋白質またはレセプターの定量法を提供する。上記（ii）においては、一方の抗体が本発明のリガンド蛋白質またはレセプターのＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のリガンド蛋白質またはレセプターＣ端部に反応する抗体であることが好ましい。
【００６６】本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のリガンド蛋白質またはレセプターの測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、リガンド蛋白質量またはレセプター）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００６７】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常、蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のリガンド蛋白質量またはレセプターを定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明のサンドイッチ法によるリガンド蛋白質またはレセプターの測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はリガンド蛋白質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、リガンド蛋白質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００６８】本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対するモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００６９】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のリガンド蛋白質またはレセプターの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「メソッズ・イン・エンジモノジー（Methods in ENZYMOLOGY）」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodiesand General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。以上のように、本発明の抗体を用いることによって、本発明のリガンド蛋白質またはレセプターを感度良く定量することができる。さらに、本発明の抗体を用いて、生体内での本発明のリガンド蛋白質またはレセプターを定量することによって、本発明のリガンド蛋白質の機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。また、本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のリガンド蛋白質またはレセプターを特異的に検出するために使用することができる。また、本発明のリガンド蛋白質またはレセプターを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のリガンド蛋白質の検出、被検細胞内における本発明のリガンド蛋白質またはレセプターの挙動の分析などのために使用することができる。
【００７０】（７）本発明のリガンド蛋白質に対する抗体による中和本発明のリガンド蛋白質またはレセプターに対する抗体の、それらリガンド蛋白質または該レセプターに対する中和活性とは、即ち、該リガンド蛋白質または該レセプターの関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。従って、該抗体が中和活性を有する場合は、該リガンド蛋白質または該レセプターの関与するシグナル伝達、例えば、該リガンド蛋白質を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性など）を不活性化することができる。従って、該リガンド蛋白質または該レセプターの過剰発現などに起因する疾患の予防および／または治療に用いることができる。
（８）本発明のリガンド蛋白質をコードするＤＮＡを有する動物の作製本発明のＤＮＡを用いて、本発明のリガンド蛋白質を発現するトランスジェニック動物を作製することができる。動物としては、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）などが挙げられるが、特に、マウス、ウサギなどが好適である。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、マウス由来の本発明のＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い動物由来の本発明のＤＮＡを動物細胞で発現させうる各種プロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトを、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のレセプター蛋白質を高産生するＤＮＡ転移動物を作出できる。このプロモーターとしては、例えば、ウイルス由来プロモーター、メタロチオネイン等のユビキアスな発現プロモーターも使用しうるが、好ましくは脳で特異的に発現するＮＧＦ遺伝子プロモーターやエノラーゼ遺伝子プロモーターなどが用いられる。
【００７１】受精卵細胞段階における本発明のＤＮＡの転移は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明のリガンド蛋白質が存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明のリガンド蛋白質を有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明のリガンド蛋白質を有する。本発明のＤＮＡ転移動物は、交配により遺伝子を安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。さらに、目的ＤＮＡを保有する雌雄の動物を交配することにより、導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。本発明のＤＮＡが転移された動物は、本発明のリガンド蛋白質が高発現させられているので、本発明のリガンド蛋白質に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用の動物などとして有用である。本発明のＤＮＡ転移動物を、組織培養のための細胞源として使用することもできる。例えば、本発明のＤＮＡ転移マウスの組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、あるいは遺伝子により発現された本発明のリガンド蛋白質が存在する組織を分析することにより、本発明のリガンド蛋白質について分析することができる。本発明のリガンド蛋白質を有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、例えば、脳や末梢組織由来のような一般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。また、その細胞を用いることにより、例えば、各種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能である。また、高発現細胞株があれば、そこから、本発明のリガンド蛋白質を単離精製することも可能である。
【００７２】本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム【００７３】
Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸 Ｍｅ ：メチル基 Ｅｔ ：エチル基 Ｂｕ ：ブチル基 Ｐｈ ：フェニル基 ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基【００７４】また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル ＣＨＯ ：ホルミル Ｂｚｌ ：ベンジル Cl２Bzl ：２，６−ジクロロベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル ＤＮＰ ：ジニトロフェノール Ｔｒｔ ：トリチル Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ− １,２,３−ベンゾトリアジン ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド ＤＣＣ ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド ＢＨＡ ：ベンツヒドリルアミン ＭｅＢｚｌ ：４−メチルベンジル ＯｃＨｅｘ ：シクロヘキシルエステル ＮＭＰ ：Ｎ−メチルピロリドン ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸【００７５】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕本発明のマウス由来新規リガンド蛋白質KiSS-1（マウス型１）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕本発明のマウス由来新規リガンド蛋白質KiSS-1（マウス型２）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕本発明のラット由来新規リガンド蛋白質KiSS-1（ラット型）のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕本発明のマウス由来新規リガンド蛋白質KiSS-1（マウス型１）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕本発明のマウス由来新規リガンド蛋白質KiSS-1（マウス型２）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕本発明のラット由来新規リガンド蛋白質KiSS-1（ラット型）をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕ヒト由来新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｈＯＴ７Ｔ１７５のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕ラット由来新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｒＯＴ７Ｔ１７５のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：９〕本発明のマウス由来KiSS-1をクローニングするために使用したプローブＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕本発明のマウス由来KiSS-1をクローニングするために使用したプライマーＢの塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕本発明のマウス由来KiSS-1をクローニングするために使用したプライマーＣの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕本発明のマウス由来KiSS-1をクローニングするために使用したプライマーＤの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕本発明のマウス由来KiSS-1をクローニングするために使用したプライマーＥの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕本発明のラット型リガンド（１−５４）［ラットKiSS-1］をコードするｃＤＮＡをクローニングするために使用したデジェネレートプライマー13-3F38の塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕本発明のラット型リガンド（１−５４）［ラットKiSS-1］をコードするｃＤＮＡをクローニングするために使用したデジェネレートプライマーKiSS357Rの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕ラットKiSS-1の部分ペプチドをコードする配列を有するＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコードするＤＮＡ断片を得るためのプライマー288-41Fの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコードするＤＮＡ断片を得るためのプライマー288-10Fの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコードするＤＮＡ断片を得るためのプライマー288-254Rの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコードするＤＮＡ断片を得るためのプライマー288-44Rの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコードするＤＮＡ断片を得るためのプライマーrKiSS364Fの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコードするＤＮＡ断片を得るためのプライマーrKiSS859Rの塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕ラットKiSS-1全長ペプチドをコードする３９３塩基対のＤＮＡ断片の塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕マウス由来新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｍＯＴ７Ｔ１７５のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２５〕マウス由来新規Ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質ｍＯＴ７Ｔ１７５をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕後述の実施例３で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕後述の実施例３で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
【００７６】後述の実施例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ１０Ｂ／ｐＣＭＶ−ｍＫｉＳＳ−１は、平成１２（２０００）年１月２４日から茨城県つくば市東１−１−３の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７００３として、平成１１（１９９９）年１２月１６日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６３４８として寄託されている。後述の実施例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli)ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｍＫｉＳＳ−１．４Ａは、平成１２年３月６日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−７０７３として、平成１２年２月１６日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６３６０として寄託されている。後述の実施例２で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＴＯＰ１０／ｐＲＫＩＳＳ４は、平成１２年３月１６日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７０９３として、平成１２年２月２日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６３６２として寄託されている。後述の実施例３で得られた大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍＯＴ７Ｔ１７５は、２００１年１月１１日から茨城県つくば市東１−１−３の経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７４２８として、２０００年１２月２２日から大阪府大阪市淀川区十三本町２−１７−８５の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ １６５２３として寄託されている。
【００７７】
【実施例】以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュラー・クローニング（Molecular cloning）に記載されている方法に従った。
【００７８】実施例１マウス型KiSS−１の取得ｃDNAのクローニングは、GENE TRAPPER （ Life Technologies社 ）の処方に従って行った。プローブA（ 配列番号：９）をビオチン化したのち、一本鎖にしたマウス胚cDNAライブラリー（ スーパースクリプトcDNAライブラリー、 Life Technologies社 ）とハイブリダイゼーションさせ、得られた一本鎖遺伝子を、プライマーB（ 配列番号：１０）を用いて二本鎖とした。この遺伝子を大腸菌DH10Bにエレクトロポレーションし、アンピシリン耐性を指標として形質転換体を得た。エレクトロポレーションは、E coli Pulser （ BIO RAD社 ）を用い、電圧1.8kVで行った。得られた形質転換体を、プライマー B（ 配列番号：１０）とプライマーC（ 配列番号：１１）を用いたコロニーPCRによって選択、形質転換体：大腸菌（ Escherichia coli ）DH10B / pCMV-mKiSS-1を得た。このcDNAクローンの塩基配列よりＯＲＦ（open reading frame）を推定（配列番号：４）、導き出されるアミノ酸配列（ 配列番号：１）を有する新規分泌性蛋白をmKiSS-1（マウス型１）と命名した。コロニーPCRは、Advantage2 cDNA polymerase Mix（ CLONTECH社 ）1/50量、プライマーB（ 配列番号：１０）及びプライマーC（ 配列番号：１１）を各0.2μM、dNTPs 200μM、DMSO 1/25量及び酵素に添付のバッファーを加え、10μlの液量とした。PCR反応は、■94℃・10分の後、■94℃・10秒、60℃・10秒、68℃・1分のサイクルを25回繰り返し行った。さらに、上記の pCMV-mKiSS-１にコードされた塩基配列より、ORFの外側にプライマーD（ 配列番号：１２）およびプライマー E（配列番号：１３）を作製、mouse embryo Marathon Ready cDNA （ CLONTECH社 ）を鋳型にPCRを行った。PCRは、 Advantage2 cDNA polymerase Mix（ CLONTECH社 ）1/50量、プライマーD（ 配列番号：１２）及びプライマーE（ 配列番号：１３）を各0.2μM、dNTPs 200μM、DMSO 1/25量及び酵素に添付のバッファーを加え、25μｌの液量で、■94℃・2分の後、■94℃・10秒、68℃・1分30秒 のサイクルを3回、■94℃・10秒、64℃・10秒、68℃・1分のサイクルを3回、■94℃・10秒、60℃・10秒、68℃・1分のサイクルを30回繰り返し、■最後に68℃、8分の伸長反応を行った。該PCR反応後の反応産物を、TOPO-TA cloning Kit（ Invirtogen社 ）の処方に従いプラスミドベクターpCR2.1-TOPO（ Invitrogen社 ）へサブクローニングした。これを大腸菌DH5αに導入し、cDNAを持つクローンを、アンピシリンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析したところ、■上記mKiSS-1の塩基配列（配列番号：４）と完全一致するものの他に、■上記mKiSS-1の塩基配列（配列番号：４）の途中に12塩基の挿入、および、ORFから402番目に一塩基変異（アミノ酸不変）があるもの（配列番号：５）、の2種類が得られた。■についても、12塩基の挿入は4アミノ酸に翻訳でき、また、ヒト、ラット型KiSS-1ではともにこの4アミノ酸に相当するアミノ酸配列が存在することから、マウスには2通りのmKiSS-1が存在するとみなし、新たに得られた塩基配列（核酸配列番号：５より推定されるアミノ酸配列（ 配列番号：２）を有する新規分泌性蛋白をmKiSS-1・4A（マウス型２）とした。この塩基配列を有するクローンを大腸菌に導入して形質転換体：大腸菌（Escherichia coli）ＤＨ５α／ｐＣＲ２．１−ｍＫｉＳＳ−１．４Ａを得た。得られた核酸配列から推定されたマウス型１およびマウス型２のＫｉＳＳ−１蛋白質のアミノ酸配列（それぞれ配列番号：４および５）は既知のヒトホモログに対して高い相同性を有していた（図１参照）。
プローブA5'−tat ggg gag ccg ctg gca aaa gtg−3'プライマーB5'−tag acc tgc ccc ttc ctc cca ga−3'プライマーC5'−ctg ctg gcc tgt gga tcc agg ctt−3'プライマーD5'−tgc agg aga gtg aag att aaa tcc cca−3'プライマーE５’−gag gac ctg tcc cat ctc gca gga gtc a−3'【００７９】実施例２ラット型リガンド（１−５４）[ラットKiSS-1]をコードするcDNAのクローニングラット胎盤からTRIZOL reagent（Gibco BRL社）を用い、添付されたマニュアルに記載された方法に従ってtotal RNAを抽出した。次いでオリゴdTセルロースカラム（MessageMaker reagent assembly, Gibco BRL社）を用い、添付されたマニュアルに記載された方法に従って該total RNAからpoly(A)+ RNAを調製した。さらに、SuperScript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis(Gibco BRL社)を用い、添付されたマニュアルに記載された方法に従って、該Poly (A)+ RNAから first strand cDNA を合成した。また、マウスKiSS-1配列を基にデザインした次のデジェネレートプライマー(degenerate primer)を合成した。
13-3F38: 5'-TTCTTGGCAGCTRCTGCTTYTCCTCTGTG-3' （配列番号：１４）
KiSS357R: 5'-GAAGCGCAGGCCGAAGGAGTTCCA-3' （配列番号：１５）
前述の first strand cDNA を鋳型として用い、13-3F38およびKiSS357Rをプライマーとして用いてデジェネレートPCR（Degenerative PCR）反応を実施した。該PCR反応における反応液は、Taq polymerase（宝酒造社）を1 μl、それぞれ添付の10x PCR buffer(500 mM KCl-100 mM Tris・HCl, pH 8.3)を10 μl、25 mM MgCl2を6 μl、2.5 mM dNTP mixtureを8 μl、25 % DMSO溶液を4 μl、プライマー13-3F38およびプライマーKiSS357R（ともに20 μM）を各2 μl、および該鋳型cDNA（前述の first strand cDNA）を2 μl、蒸留水を65 μlを混合して作製した。該PCRとして、１）初期変性（94℃・5分間）、２）サイクル反応（94℃・20秒間-72℃・50秒間）３）サイクル反応（94℃・20秒間-71.5℃・20秒間-72℃・30秒間）４）サイクル反応（94℃・20秒間-71℃・20秒間-72℃・30秒間）、５）サイクル反応（94℃・20秒間-70.5℃・20秒間-72℃・30秒間）、６）サイクル反応（94℃・20秒間-70℃・20秒間-72℃・30秒間）、７）サイクル反応（94℃・20秒間-69.5℃・20秒間-72℃・30秒間）、８）サイクル反応（94℃・20秒間-69℃・20秒間-72℃・30秒間）、９）サイクル反応（94℃・20秒間-68.5℃・20秒間-72℃・30秒間）、１０）サイクル反応（94℃・20秒間-68℃・20秒間-72℃・30秒間）、１１）30回のサイクル反応（94℃・20秒間-61.8℃・20秒間-72℃・30秒間）の後１２）最終伸長反応（72℃・7分間）を行いPCR産物を得た。さらにPCR 産物を1.5 %アガロースゲル電気泳動を行い、サイバーグリーン染色される約300 bpのバンドを含むゲル片を剃刀で切り出した。該ゲル片より Gene Clean DNA 抽出キット（BIO 101社）を用いてPCR 産物であるDNA断片を回収した。該DNA断片の塩基配列決定のための反応は、Dye Terminator Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems、パーキンエルマー社）を用いて行い、蛍光式自動シークエンサー（DNA sequencer Prism 377：Applied Biosystems、パーキンエルマー社）を用いてPCR 産物の塩基配列を解読した。その結果、ラットKiSS-1の部分ペプチドをコードする配列を有するDNA断片を得ることができた。以下にデジェネレートプライマー部分を含まない288 bpの塩基配列（配列番号：１６）pCR288bpを示す。
pCR288bp：TGGCCTCTTT TGGGGAGCCA CTGGCAAAAA TGGCACCTGT GGTGAACCCT GAACCCACAG 60GCCAACAGTC CGGACCCCAG GAACTCGTTA ATGCCTGGCA AAAGGGCCCG CGGTATGCAG 120AGAGCAAGCC TGGGGCTGCA GGACTGCGCG CTCGCCGAAC ATCGCCATGC CCGCCGGTGG 180AGAACCCCAC GGGGCACCAG CGGCCCCCGT GTGCCACCCG CAGTCGCCTG ATCCCTGCGC 240CCCGCGGATC GGTGCTGGTG CAGCGCGAGA AGGACATGTC AGCCTACA 288（配列番号：１６）
得られた配列よりプライマー 288-41F（配列番号：１７）、288-10F（配列番号：１８）、288-254R（配列番号：１９）、288-44R（配列番号：２０）を作成し、以下に記した5'-RACE及び3'-RACE実験に用いた。
288-41F: 5'-GGTGAACCCTGAACCCACAGGCCAACAG-3' （配列番号：１７）
288-10F: 5'-TTGGGGAGCCACTGGCAAAAATGGCACC-3' （配列番号：１８）
288-254R: 5'-TGACATGTCCTTCTCGCGCTGCACCAGC-3' （配列番号：１９）
288-44R: 5'-GGACTGTTGGCCTGTGGGTTCAGGGTTC-3' （配列番号：２０）
ラット肝臓cDNAを鋳型として5'-RACE及び3'-RACE反応を実施した。5'-RACE及び3'-RACEのPCR反応液はTaq polymerase(宝酒造社)を0.5 μl、添付の10x PCR buffer(500 mM KCl-25 mM MgCl2-100 mM Tris・HCl, pH 8.3)を5 μl、2.5 mM dNTP mixtureを4 μl、25 mM MgCl2 を3 μl、25 % DMSO溶液を2 μl(3'-RACEの場合)、10 μMプライマー288-10F(3'-RACEの場合)あるいは10 μMプライマー288-254R(5'-RACEの場合)を 1 μl、10 μMプライマーAP1（プライマーAP1はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに添付のもの）を1 μl、鋳型ラット肝臓cDNA（CLONTECH社、Marathon-Ready cDNA Kit、rat liver）を5 μl、及び蒸留水を28.5μl(3'-RACEの場合)あるいは30.5μl(5'-RACEの場合)を混合して作製した。反応条件は94℃・60秒の初期変性後、94℃・30秒-72℃・120秒のサイクル反応を5回、94℃・30秒-70℃・120秒のサイクル反応を5回、94℃・20秒-68℃・120秒のサイクル反応を25回、および68℃・10分の最終伸長反応とした。続いて、該PCR反応の反応液を鋳型としてnested PCRを実施した。反応液はTaqpolymerase(宝酒造社)を0.5 μl、添付の10x PCR buffer(500 mM KCl-25 mM MgCl2-100 mM Tris・HCl, pH 8.3)を5 μl、2.5 mM dNTP mixtureを4 μl、25 mMMgCl2 を3 μl、25 % DMSO溶液を2 μl(3'-RACEの場合)、10 μMプライマー288-41F(3'-RACEの場合)あるいは10 μMプライマー288-44R(5'-RACEの場合)を 1 μl、10 μMプライマーAP2（プライマーAP2はCLONTECH社のMarathon-Ready cDNA Kitに添付のもの）を1 μl、鋳型DNA（該PCR反応液50倍希釈液）を5 μl、及び蒸留水を28.5 μl(3'-RACEの場合)あるいは30.5μl(5'-RACEの場合)を混合して作製した。反応条件は94℃・60秒の初期変性後、94℃・30秒-72℃・120秒のサイクル反応を5回、94℃・30秒-70℃・120秒のサイクル反応を5回、94℃・20秒-68℃・120秒のサイクル反応を25回、および68℃・10分の最終伸長反応とした。さらにnested PCR 産物から前述の方法によりDNA断片を回収した。該DNA断片をTOPO-TA Cloning Kit (Invitrogen社）を用いて、添付のマニュアルに記載された方法に従ってプラスミドベクターpCR2.1に連結し、大腸菌TOP10をトランスフォームさせた。単一コロニーより大腸菌をピックアップし、LB培地中にて液体培養終了後、集菌してプラスミド精製キット（QIAGEN社、QIAwell 8 Ultra plasmid purification kit）を用いてプラスミドを精製した。該プラスミド中の PCR産物の塩基配列を前述の方法により解読し、5'端、3'端の配列情報を得た。この配列情報よりプライマーrKiSS364F、rKiSS859Rを作成した。
rKiSS364F: 5'-CGTCTCAGCCTCTGGACACCCTGTGGATCTGCC-3' (配列番号
：２１) rKiSS859R: 5'-TGGCGACAGCATTGCTTTTATTGCACAAGTCTA-3' (配列番号
：２２)ラット肝臓cDNAを鋳型としてプライマーrKiSS364FとrKiSS859Rを用いてPCRを実施した。PCR反応液はPfu DNA polymerase(Stratagene社)を1 μl、添付の10xPCR buffer(500 mM KCl-25 mM MgCl2-100 mM Tris・HCl, pH 8.3)を5 μl、2.5mM dNTP mixtureを4 μl、25 % DMSO溶液を2 μl、10 μMプライマーrKiSS364F及びrKiSS859Rを各1 μl 、鋳型ラット肝臓cDNA（CLONTECH社、Marathon-ReadycDNA Kit、rat liver）を5 μl、及び蒸留水を31 μlを混合して作製した。反応条件は94℃・60秒の初期変性後、94℃・20秒-72℃・120秒のサイクル反応を3回、94℃・20秒-70℃・120秒のサイクル反応を3回、94℃・20秒-68℃・120秒のサイクル反応を3回、94℃・20秒-63℃・30秒-68℃・120秒のサイクル反応を30回、および68℃・10分の最終伸長反応とした。得られたDNA断片をpPCR-BluntII-TOPO vector (Stratagene社)を用いて添付のマニュアルに記載された方法に従ってクローニングした。クローニングされたDNA配列を前述の方法により解読し、ラットKiSS-1全長ペプチドをコードする393 bpのDNA断片(配列番号２５)を有するpRKISS4を得ることができた。該プラスミドによりトランスフォームさせた大腸菌TOP10を、TOP10/pRKISS4と命名した。得られた核酸配列から推定されたラット型ＫｉＳＳ−１蛋白質のアミノ酸配列�