| 【発明の名称】 |
診断法 |
| 【発明者】 |
【氏名】ラケシュ・アナンド
【氏名】ジョン・エドワード・ノリス・モーテン
【氏名】ジョン・クレイグ・スミス
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| 【要約】 |
【課題】ヒトプラスタグランジンE2レセプター1(EP1-R)遺伝子における多形性およびそれによりコードされる対応する新規対立性ポリペプチドを提供すること。
【解決手段】ヒトの核酸の、EP1-R遺伝子における特定部位の１個またはそれ以上の位置の配列、またはEP1-Rタンパク質の１２６または１５４位におけるアミノ酸配列の決定；およびEP1-R遺伝子またはタンパク質における多形性を参照したヒトの状態の決定を含む、ヒトにおけるEP1-R遺伝子の多形性の診断法により提供される。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ヒトの核酸の、配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の１個またはそれ以上の位置の配列、またはEP1-Rタンパク質の１２６または１５４位におけるアミノ酸配列の決定；およびEP1-R遺伝子またはタンパク質における多形性を参照したヒトの状態の決定を含む、ヒトにおけるEP1-R遺伝子の多形性の診断法。
【請求項２】 多形性が、配列番号１の位置により定義して、３４４位の多形性がGおよび／またはAの存在、６２１−６２７位の多形性が７個のGの１個またはそれ以上の欠失、７９３−７９９位の多形性が７個のGの１個またはそれ以上の欠失、９０８位の多形性がCおよび／またはTの存在、１１３６位の多形性がGおよび／またはCの存在、１１６０位の多形性がTおよび／またはCの存在、１１８９位の多形性がGおよび／またはAの存在、１４５８位の多形性がAおよび／またはGの存在、１６５６位の多形性がTおよび／またはGの存在、２４４８位の多形性がTおよび／またはCの存在、２５３１位の多形性がGおよび／またはAの存在、３３４８位の多形性がCおよび／またはTの存在、３４３２位の多形性がCおよび／またはGの存在、３６２２位の多形性がGおよび／またはAの存在であるものからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】 一ヌクレオチド多形性の可能性のある核酸領域を配列決定前にポリメラーゼ連鎖反応により増幅する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】 一ヌクレオチド多形性の存在または不存在を、所望により操作した、制限酵素により認識される部位の損失、または獲得を参照して検出する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】 配列をARMS−対立遺伝子特異的増幅、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイおよび制限フラグメント長多形性(RFLP)から選択される方法により決定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】 EP1-Rタンパク質における多形性アミノ酸残基の存在を、酵素結合免疫収着検定(ELISA)のような免疫学的方法により決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】 EP1-R介在疾患に対する個体の素因および／または感受性の評価に使用するための、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】 i)個体からのサンプル核酸の取得、ii)配列番号１の位置により定義したEP1-R遺伝子の３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２の１個またはそれ以上の位置における変異ヌクレオチドンの存在または不存在の検出；およびiii)EP1-R遺伝子の多形性を参照した個体の状態の決定を含む、EP1-R介在疾患の診断法。
【請求項９】 i)個体からのサンプル核酸の取得、ii)１２６位および１５４位のいずれかまたは両方における多形性アミノ酸の存在に基づいた変異EP1-Rポリペプチドの存在または不存在の検出；およびiii)EP1-Rタンパク質の多形性の存在または不存在を参照したヒトの状態の決定を含む、EP1-R介在疾患の診断法。
【請求項１０】 以下の多形性：配列番号１の位置により定義する３４４位にAを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義する６２１−６２６位に６個のGを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義する７９３−７９８位に６個のGを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義する０８位にTを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義する１１３６位にCを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義する１１６０位にCを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義する１１８９位にAを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義する１４５８位にGを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義する１６５６位にGを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義する２４４８位にCを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義する２５３１位にAを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義する３３４８位にTを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義する３４３２位にGを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の３６２２位にAを有する配列番号１の核酸；またはこれらの相補配列またはこれらに対するアンチセンス配列または少なくとも一つの多形性を含む少なくとも１７塩基対のこれらのフラグメントの一つを含む核酸。
【請求項１１】 配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の１個またはそれ以上の位置のEP1-R遺伝子多形性の検出ができる対立遺伝子特異的プライマーまたはプローブ。
【請求項１２】 請求項１０に記載の１個またはそれ以上の診断的プライマーおよび／またはプローブを含む、診断的キット。
【請求項１３】 i)配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の１個またはそれ以上の核酸の配列の決定、およびEP1-R遺伝子の多形性を参照したヒトの状態の決定を含むヒトにおけるRP1-R遺伝子の多形性ノ診断；およびii)有効量のEP1-R医薬の投与を含む、EP1-R医薬での処置を必要とするヒトの処置法。
【請求項１４】 配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の１個またはそれ以上の位置に多形性を有すると診断されたヒトにおけるEP1-R介在疾患を処置するための医薬の製剤における、EP1-R医薬の使用。
【請求項１５】 配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の１個またはそれ以上の位置おける多形性を診断的に試験するための、EP1-R医薬およびヒトに投与するため指示書を含む、医薬パック。
【請求項１６】 EP1-R遺伝子配列の少なくとも１７、好ましくは少なくとも２０連続塩基を含む、核酸配列が貯蔵され、該配列が配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の位置に少なくとも１個の多形性を含むものである、コンピューター読取可能媒体。
【請求項１７】 EP1-R遺伝子配列の少なくとも２０連続塩基対を含み、配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の位置に少なくとも一つの多形性を含む核酸配列のコンピューター読取可能媒体への提供；および該核酸配列と同定された同一性の少なくとも一つの他の核酸配列との比較の段階を含む、配列同定を実施する方法。
【請求項１８】 １２６位にプロリンおよび／または１５４位にスレオニンを有するヒトEP1-Rポリペプチドの対立遺伝子変異体、またはフラグメントが１２６位および／または１５４位に対立遺伝子を含む限り、少なくとも１０アミノ酸を含むそのフラグメント。
【請求項１９】 １２６位にプロリンを有するおよび／または１５４位にスレオニンを有するヒトEP1-Rポリペプチドの対立遺伝子変異体、またはフラグメントが１２６位および／または１５４位に対立遺伝子を含む限り、少なくとも１０アミノ酸を含むそのフラグメントに特異的な抗体。
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【発明の詳細な説明】【０００１】本発明は、ヒトプラスタグランジンE2レセプター1(EP1-R)遺伝子における多形性およびそれによりコードされる対応する新規対立性ポリペプチドに関する。本発明はまたEP1-R遺伝子における対立性変異の分析のための方法および、EP-1R活性の調節が治療的利益である疾患、特に、関節リウマチ、骨関節症および骨粗鬆症のような疼痛が不随する疾患の診断および処置における該多形性の使用に関する。
【０００２】プロスタグランジン(プロスタグランジンD２、E２、F２αおよびI２)およびスロンボキサンA２(TXA2)は、プロスタノイドと名付けられたホルモンのファミリーのメンバーであり、アラキドン酸のシクロオキシゲナーゼによる代謝の間に形成される。プロスタノイドは種々の刺激に応答して多くの組織および細胞により産生でき、広範囲の作用を示し、多くの生理学的機能の調節に関与する。それらは、平滑筋(血管、気管支、子宮、胃腸管を含む)の収縮および弛緩、胃酸分泌の阻害を含む広範囲の生理学的特性を示し、血小板凝集ならびに内分泌および代謝工程に作用する。
【０００３】プロスタノイドの生理学的作用は、特異的G−プロテイン結合細胞表面レセプターを介して媒介される。EP１レセプター(EP1-R)は、プロスタグランジンE３(PGE2)の生理学的活性を介在する、EP１、EP２、EP３およびEP４と名付けられた４つのレセプターサブタイプの一つである(Negishi M et al., J Lipid MediatorsCell Signalling 12, 379-391, 1995)。各レセプターサブタイプは、異なる生理学的役割を有する；各々PGE２に高い親和性で結合するが、種々のPGE２アゴニストおよびアンタゴニストに関する結合親和性に差異を示し、各々その作用を異なる信号伝達経路を介して媒介する(Coleman R et al., Pharmacological Reviews 46, 205-229, 1994)。
【０００４】EP1レセプターは、胃、小腸、腎臓、眼、子宮、気管および筋肉を含む広範囲の組織に位置しており、特に疼痛の誘発(Syriatowicz J et al., Neuroscience94, 587-594, 1999)、熱(Oka K et al.. Am J Physiol 257/6 44-46, 1998)、利尿および浸透圧調節(Breyer et al., Current Opinion in Nephrology and Hypertension 9/1, 23-29, 2000)、分娩の開始(Spaziani et al., Biology of Reproduction 62/1, 23-26, 2000)および大腸発癌(Watanabe et al., Cancer Research 59/20 5093-5096, 1999)に関連している。
【０００５】EP1-R介在応答のレベルを変化させるまたはEP1-Rの生理学的活性を変化させる医薬は、EP1-Rが病態生理学的役割を担う全ての状態の処置に有用である。このような医薬は、疼痛が関連する状態、例えば、関節の状態に関連する疼痛(関節リウマチおよび骨関節症のような)、術後疼痛、出産後疼痛、歯の状態に関連する疼痛(虫歯および歯肉炎のような)、火傷が関連する疼痛(日焼けを含む)、骨疾患の処置(骨粗鬆症、悪性腫瘍およびページェット病の高カルシウム血症の処置)、および運動傷害および捻挫が関連する疼痛の処置に有用である。
【０００６】EP1-R医薬の例は、WO97/00864 Zeneca Ltd.およびWO96/03380 Zeneca Ltd.に記載されている。EP1-RをコードするｃDNAは、Funk et al., J. Biol. Chem. 268, 26767-26772, 1993によりクローン化されている。ｃDNA配列はEMBLデータベースにアクセッションナンバーL22647で提供されている。EP1-R遺伝子の染色体位置は、19p13.1に位置付けされている(Duncan et al., Genomics 25, 740-742, 1995)。
【０００７】ヒトEP1-R遺伝子のゲノムDNA配列はEMBLNEWデータベースに、アクセッションナンバーAC008569で公開されている。このデータベースエントリーは、ヒトEP1-Rの染色体位置を誤って染色体１６に割り当てている。
【０００８】配列番号１の１−３７４、７３２−２２７４および２２７６−３９０８の位置に対応するEP1-RゲノムDNA配列のフラグメントは、EMBLアクセッションナンバーAC008569で公開されている。このデータベースエントリーは、ヒトEP1-R遺伝子の染色体位置を染色体１９上に確認している。
【０００９】我々は、ヒトEP1-R遺伝子の完全長ゲノムDNA配列を毛ss低し、配列番号１に記載し、図１に模式図的に示す。配列番号１のゲノム配列とl22647のｃDNA配列の比較により、我々はEP1-R遺伝子のある構造的特長を同定している。非翻訳第１エクソンが遺伝子の５'にある。配列番号１の１０７４−１１３０位のエクソン１は、EMBLアクセッションナンバーL22647で同定された１−５７位に対応する。配列番号１の１１３１−２０５４位に第１イントロンがあり、続いて配列番号１の２０５５−３０１３位にエクソン２がある。エクソン２の配列は、EMBLアクセッションナンバーL22647で同定された５８−１０１６位に対応する。エクソン２は介しATGコドンを、EMBLアクセッションナンバーL22647で定義された７５−７８位に対応する配列番号１の２０７２−２０７４位に含む。第２イントロンは、配列番号１の３０１４−３５６５位に及ぶ。エクソン３は、EMBLアクセッションナンバーL22647で定義された１０１７−１３５９位に対応する、配列番号１の３５６６−３９０８位に見られる。配列番号１に記載されたイントロン／エクソン境界は、AG／GTコンセンサス配列と一致する。配列番号１に記載の配列とEMBLアクセッションナンバーL22647の比較を、実施例に示す。
【００１０】ヒトEP1-R遺伝子に関する全ての位置は、特記しない限り、または内容から明白でない限り、配列番号１における位置を言及する。
【００１１】DNA多形性は一つの個体と他の間のDNA配列の変異である。DNA多形性はアミノ酸配列に変化を導き得、結果としてタンパク質構造および機能的活性を変える。多形性はまたmRNA合成、成熟、輸送および安定性にも影響し得る。アミノ酸変化をもたらさない(沈黙多形性)または既知のコンセンサス配列を変えない多形性は、それにもかかわらず、例えば、mRNA折りたたみ、安定性、スプライシング、転写速度、翻訳速度、または適合度を変えることにより、生理学的作用を有し得る。最近、アミノ酸変化をもたらさない多形性でさえ、恐らく異なる生物学的機能を有するmRNAの異なった構造的折りたたみをもたらし得ることが報告されている(Shen et al., (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:7871-7876)。
【００１２】WO00/29614(Eurona Medical Labs) − 本出願の優先日後に公開 − はまたEP1-R遺伝子の種々の多形性の同定を記載している。公開されたEP1-R配列を基にして、その分析は８つのEP1-R多形性の存在を予言している。本分析は、全ての個々の分析が、L22647のヌクレオチド２８５、７６３および７６４で異なるため、EP1-Rの本来の公開された配列における同定された推定の誤りを同定している。これは、WO00/29614における２１１、６８９および６９０位の予言される多形性が、真の多形性よりむしろ基の公開されたEP1-Rの配列における誤りの存在を反映していることを示す。
【００１３】多形性の知識は、患者で特定の薬剤での治療が最も適するかを同定することを助けるために使用し得る(これはしばしば“薬理遺伝学”と呼ばれる)。薬理遺伝学はまた薬剤選択過程を助けるための薬学的研究にも使用できる。多形性はヒトゲノムの地図作成に使用し、疾患の遺伝的素因を解明する。読者は、薬理遺伝学および多形性検出の他の使用の詳細のバックグラウンドとして以下の参考文献を指標とする：Linder et al. (1997), Clinical Chemistry, 43, 254; Marshall(1997), Nature Biotechnology, 15, 1249; 国際特許出願WO97/40462, SpectraBiomedical; およびSchafer et al. (1998), Nature Biotechnology, 16, 33。
【００１４】臨床試験は、医薬に対する患者の応答が、しばしば異質であることを示している。したがって、薬剤設計および治療のための改善された試験の必要性がある。本発明は、ヒトEP1-R遺伝子における１４個の多形性の発見に基づく。
【００１５】本発明の第１の態様により、ヒトの核酸の、配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の１個またはそれ以上の位置の配列の決定；およびEP1-R遺伝子における多形性を参照したヒトの状態の決定を含む、ヒトにおけるEP1-R遺伝子の多形性の診断法を提供する。
【００１６】ヒトなる用語は、EP1-R介在疾患に罹患しているまたは罹患していることが疑われるヒト、およびこのような疾患に対する素因または感受性を検査し得る無症状ヒトの両方を含む。各位置で、ヒトは対立遺伝子に関してホモ接合体であり得、またはヒトはヘテロ接合体であり得る。
【００１７】“EP1-R介在疾患”は、EP1-R介在応答のレベルの変化またはEP1-Rの生理学的活性の変化が治療的利点である疾患を意味する。“EP1-R医薬”は、EP1-R介在応答のレベルを変化させるまたはEP1-Rの生理学的活性を変化させる医薬を意味する。例えば、医薬はEP1-Rのリガンドのアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。EP1-Rの活性を阻害する医薬が好ましい。
【００１８】ポリペプチド配列における変異は、以下のように言及される：元のアミノ酸(１または３文字表記を使用する)、位置、新規アミノ酸。(仮説の)例として、“D25K”または“Asp25Lys”は、２５位のアスパラギン酸(D)がリジン(K)に代わったことを意味する。
【００１９】多形性なる用語は、１ヌクレオチド置換、ヌクレオチド挿入およびヌクレオチド欠失を含み、挿入および欠失の場合、遺伝子の一つの位置、および不定の数の反復遺伝子配列における１個またはそれ以上のヌクレオチドの挿入または欠失を含む。
【００２０】本発明の一つの態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の３４４位の多形性が、Gおよび／またはAの存在であるものである。
【００２１】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の６２１−６２７位の多形性が、７個のGの１個またはそれ以上の欠失であるものである。好ましくは、対立遺伝子変異は７個のGの一つの一ヌクレオチド欠失から成る。
【００２２】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の７９３−７９９位の多形性が、７個のGの１個またはそれ以上の欠失であるものである。好ましくは、対立遺伝子変異は７個のGの一つの一ヌクレオチド欠失から成る。
【００２３】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の９０８位の多形性が、Cおよび／またはTの存在であるものである。
【００２４】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の１１３６位の多形性が、Gおよび／またはCの存在であるものである。
【００２５】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の１１６０位の多形性が、Tおよび／またはCの存在であるものである。
【００２６】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の１１８９位の多形性が、Gおよび／またはAの存在であるものである。
【００２７】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の１４５８位の多形性が、Aおよび／またはGの存在であるものである。
【００２８】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の１６５６位の多形性が、Tおよび／またはGの存在であるものである。
【００２９】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の２４４８位の多形性が、Tおよび／またはCの存在であるものである。
【００３０】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の２５３１位の多形性が、Gおよび／またはAの存在であるものである。
【００３１】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の３３４８位の多形性が、Cおよび／またはTの存在であるものである。
【００３２】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の３４３２位の多形性が、Cおよび／またはGの存在であるものである。
【００３３】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の３６２２位の多形性が、Gおよび／またはAの存在であるものである。
【００３４】本発明の他の態様において、好ましくは本明細書に記載の診断法は、配列番号１の位置により定義したEP1-R遺伝子の３４４位の多形性がGおよび／またはAの存在、EP1-R遺伝子の６２１−６２７位の多形性が７個のGの１個またはそれ以上の欠失、EP1-R遺伝子の７９３−７９９位の多形性が７個のGの１個またはそれ以上の欠失、EP1-R遺伝子の９０８位の多形性がCおよび／またはTの存在、EP1-R遺伝子の１１３６位の多形性がGおよび／またはCの存在、EP1-R遺伝子の１１６０位の多形性がTおよび／またはCの存在、EP1-R遺伝子の１１８９位の多形性がGおよび／またはAの存在、EP1-R遺伝子の１４５８位の多形性がAおよび／またはGの存在、EP1-R遺伝子の１６５６位の多形性がTおよび／またはGの存在、EP1-R遺伝子の２４４８位の多形性がTおよび／またはCの存在、EP1-R遺伝子の２５３１位の多形性がGおよび／またはAの存在、EP1-R遺伝子の３３４８位の多形性がCおよび／またはTの存在、EP1-R遺伝子の３４３２位の多形性がCおよび／またはGの存在、およびEP1-R遺伝子の３６２２位の多形性がGおよび／またはAの存在であるものからなる群から選択される。
【００３５】当業者には、EP1-R遺伝子におけるヌクレオチド位置の番号付けが、配列番号１により定義される６２１−６２７位および７９３−７９９位の欠失の数により変化することは明白である。例えば、７個のGヌクレオチドを配列番号１の６２１−６２７に含む第１対立遺伝子において、７個のGの直後のヌクレオチド配列は６２８位から始まる。配列番号１の６２１−６２７位のGの一つが欠失した第２の対立遺伝子において、６個のGの直後のヌクレオチド配列は、ここでは６２７から始まる等。
【００３６】診断法は、好ましくは、配列が、増幅不応変異系(ARMS(登録商標)−対立遺伝子特異的増幅)、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(ASH)、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)および制限フラグメント長多形性(RFLP)から選択される方法により決定されるものである。診断のためのアミノ酸配列法は、酵素結合免疫収着検定(ELISA)のような免疫学的方法により決定されるものである。
【００３７】本発明の他の態様において：個体からのサンプルの取得；および以下の多形性部位：配列番号１の位置により定義したEP1-R遺伝子の３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２のいずれか一つを占拠する塩基の決定を含む、核酸の分析法を提供する。
【００３８】本発明の他の態様において、我々は：i)個体からのサンプル核酸の取得、ii)配列番号１の位置により定義したEP1-R遺伝子の３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２の１個またはそれ以上の位置における変異ヌクレオチドンの存在または不存在の検出；およびiii)EP1-R遺伝子の多形性を参照した個体の状態の決定を含む、EP1-R介在疾患の診断法を提供する。
【００３９】EP1-R遺伝子の各位置における、好ましい変異を含む対立遺伝子変異は、本明細書に記載する。
【００４０】個体の状態は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個または全１４個の位置における対立遺伝子変異を参照して、所望により既知である(または既知となる)遺伝子における他の多形性と組合わせて決定し得る。
【００４１】核酸の試験サンプルは、簡便には個体から得た血液、気管支肺胞洗浄液、唾液、尿または他の体液または組織である。試験サンプルが、均一に試験サンプルにおける配列に対応した核酸配列であり得、即ち、サンプル核酸の全体または一部が最初に対立性変化の分析前に、慣用法、例えばPCRを使用して増幅し得ることは認められる。
【００４２】本発明の一つまたはそれ以上の多形性位置における変異ヌクレオチドの存在または不存在の検出に使用し得る多くの分析的方法が存在することは当業者には明白である。一般に、対立性変化の検出は、変異識別法、所望により増幅反応および所望によりシグナル産生システムを必要とする。表１は、多くの変異検出法を挙げ、幾つかはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく。これらは多くのシグナル産生系と組合わせて使用し得、その選択は表２に挙げる。更なる増幅法は表３に挙げる。対立性変化の検出のための多くの現法は、Nollau et al., Clin. Chem.43, 1114-1120, 1997; および標準テキスト、例えば、“Laboratory Protocolsfor Mutation Detection”, Ed. by U. Landegren, Oxford University Press,1996および“PCR”, 2nd Edition by Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997にレビューされている。
【００４３】
【表１】
【００４４】表１ − 変異検出法一般：DNA配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定スキャンニング：PTT＊、SSCP、DGGE、TGGE、開裂、ヘテロ二本鎖分析、CMC、酵素的ミスマッチ開裂＊注：プロモーター多形性の検出には有用でない。
【００４５】ハイブリダイゼーションベース：固相ハイブリダイゼーション：ドットブロット、MASDA、逆ドットブロット、オリゴヌクレオチドアレイ(DNAチップ)溶液相ハイブリダイゼーション：Taqman(登録商標) − US-5210015 & US-5487972 (Hoffmann-La Roche), Molecular Beacons − Tyagi et al (1996), Nature Biotechnology, 14, 303; WO95/13399 (Public Health Inst., New York)【００４６】伸張ベース：ARMS(登録商標)−対立遺伝子特異的増幅(欧州特許第EP-B-332435および米国特許第5,595,890に記載のような)、ALEX(登録商標) − 欧州特許第332435B1号(Zeneca Limited)、COPS − Gibbs et al (1989), Nucleic Acids Research, 17, 2347。
【００４７】包含ベース：ミニ配列決定、APEX制限酵素ベース：RFLP、制限酵素部位産生PCRライゲーションベース：OLA他：侵入体アッセイ【００４８】表２−シグナル産生または検出システム蛍光：FRET、蛍光停止、蛍光偏光−英国特許第2228998号(Zeneca Limited)他：化学ルミネッセンス、電気化学ルミネッセンス、ラマン、放射活性、比色、ハイブリダイゼーション保護アッセイ、マススペクトル、SERRS − WO97/05280(University of Strathclyde)。
【００４９】表３−更なる増幅法SSR、NASBA、LCR、SDA、b-DNA好ましい変異検出法は、ARMS(登録商標)−対立遺伝子特異的増幅、ALEX(登録商標)、COPS、Taqman、Molecular Beacons、RFLP、OLA、制限部位ベースのPCRおよびFRET法を含む。
【００５０】特に好ましい方法は、ARMS(登録商標)−対立遺伝子特異的増幅、OLAおよびRFLPベースの方法を含む。ARMS(登録商標)−対立遺伝子特異的増幅が特に好ましい方法である。
【００５１】ARMS(登録商標)−対立遺伝子特異的増幅(欧州特許第EP-B-332435号、米国特許第5,595,890号およびNewton et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 17, p.2503; 1989)に記載)は、プライマーおよびその鋳型の３'末端ヌクレオチドの相補性による。プライマーの３'末端ヌクレオチドは、検出する特異的変異、対立遺伝子または多形性に相補的または非相補的である。３'末端ヌクレオチドが、塩基変異、対立遺伝子または多形性に相補的であるプライマーから伸びたプライマーに選択的利点がある。鋳型配列を伴う３'末端ミスマッチを有するこれらのプライマーは、酵素的プライマー伸張を選択的に阻害するか防止する。ポリメラーゼ連鎖反応または一方向プライマー伸張反応は、したがって、プライマーの３'末端ヌクレオチドが鋳型の相補物である場合、生産物増幅をもたらすが、３'末端ヌクレオチドが鋳型のものと相補的でない場合、もたらさないか、少なくとも効率的ではない。
【００５２】更なる態様において、本発明の診断法は、EP1-R介在疾患、特に関節リウマチ、骨関節症および骨粗鬆症のような疼痛が不随する疾患状態の処置における治療化合物の効果の評価に使用する。
【００５３】アッセイ、例えば、レセプターベースのアッセイを、１個またはそれ以上の上記の多形性が、転写レベルおよび／またはメッセージ安定性に影響するか否かの検出のために考案し得る。
【００５４】イントロン領域またはプロモーター領域で起こる本発明で同定した多形性は、EP1-Rレセプターのアミノ酸配列を変えることは予期されないが、配列の転写および／またはメッセージ安定性を変え得、したがって細胞内のレセプターのレベルに影響する。
【００５５】本発明の二つの多形性は、翻訳タンパク質におけるアミノ酸配列の変化をもたらし得る、配列番号１により定義される２４４８位の多形性は、翻訳タンパク質の対応する１２６位におけるロイシンからプロリンへのアミノ酸変化をもたらす(Leu126Pro)。配列番号１により定義される２５３１位の多形性は、翻訳タンパク質の対応する１５４位におけるアラニンからスレオニンへのアミノ酸変化をもたらす(Ala154Thr)。タンパク質配列の変化は、１個またはそれ以上のアミノ酸が異なるペプチド領域の識別ができる特異的抗体を用いた免疫アッセイ法のような当業者に既知の標準法を使用して検出し得る。アミノ酸変化多形性の検出はまた本発明の一部である。
【００５６】このように、本発明の更なる態様により、EP1-Rタンパク質のアミノ酸１２６位および１５４位の一方または両方に存在するアミノ酸の決定；および検出したアミノ酸を参照した個体の状態の決定を含む、ヒトにおけるEP1-Rタンパク質の多形性の存在の検出法を提供する。
【００５７】本発明の他の態様において：i)個体からのサンプル核酸の取得、ii)１２６位および１５４位のいずれかまたは両方における多形性アミノ酸の存在に基づいた変異EP1-Rポリペプチドの存在または不存在の検出；およびiii)EP1-Rタンパク質の多形性の存在または不存在を参照したヒトの状態の決定を含む、EP1-R介在疾患の診断法を提供する。
【００５８】好ましい態様において、１２６位の多形性アミノ酸がプロリンの存在であり、１５４位がスレオニンの存在である。
【００５９】EP1-R遺伝子の特定の対立性変異体を担持する個体は、したがって、異なる生理学的条件下でタンパク質生合成を調節する能力に差異が存在し得、異なる疾患に対する応答に対して変わった能力を示す。加えて、対立遺伝子変異の結果もたらされるタンパク質調節における差異は、医薬治療に対する個体の応答に直接作用を有し得る。本発明の診断法は、このような薬剤に対する臨床的応答の予測のためおよび治療量の決定のための両方に使用し得る。
【００６０】更なる態様において、本発明の診断法は、EP1-Rにより介在される疾患に対する個体の素因の評価に使用する。これは、EP1-Rにより介在される疼痛の発症および疾患に特に関連し得る。本発明は、これらの状態を発症する危険のある個体の認識に使用し得る。
【００６１】低頻度多形性は、下記のように、特にハプロタイピングに有用である。単模式種は、一つの(父系または母系)染色体上の結合した多形の部位(遺伝子内のような)として見つけられる対立遺伝子のセットである。遺伝子内の組換えが無作為である場合、２n(式中、２は各SNPにおける対立遺伝子の数およびnはSNPの数)程多い単模式種が存在する。臨床的応答に関連する変異または多形性の同定のための一つの試みは、目的の集団で同定できる全ての単模式種を使用した関連実験で行われる。各単模式種の頻度は、その最も稀な対立遺伝子の頻度により制限され、低い頻度の対立遺伝子のSNPは、低い頻度の単模式種のマーカーとして特に有用である。有害なまたは異常な事象のような特定の臨床的性質と関連する特定の変異または多形性が集団内の低い頻度である可能性のため、低頻度SNPは特にこれらの変異の同定に有用であり得る(例えば：De Stefano V et al., Ann Hum Genet (1998) 62:481-90; およびKeightley AM et al., Blood (1999) 93:4277-83参照)。
【００６２】更なる態様において、本発明の診断法は、EP1-R遺伝子の１個またはそれ以上の対立変異体を選択的に標的とする新規医薬治療の開発に使用する。標的とする新規医薬治療の開発に使用する。特定の対立遺伝子変異と疾患の発症に対する予測または医薬治療に対する応答の間のリンクの同定は、新規医薬の設計に著しい衝撃を与え得る。医薬は、疾患過程に含まれる変異体の生理学的活性を調節するが、他の変異における効果を最小にするために設計し得る。
【００６３】本発明の更なる診断的態様において、変異ヌクレオチドの存在または不存在は、所望により操作された、制限酵素により認識される部位の損失または獲得を参照して検出する。
【００６４】本発明の他の態様により、以下の多形性：配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の３４４位にAを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の６２１−６２６位に６個のGを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の７９３−７９８位に６個のGを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の９０８位にTを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の１１３６位にCを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の１１６０位にCを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の１１８９位にAを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の１４５８位にGを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の１６５６位にGを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の２４４８位にCを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の２５３１位にAを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の３３４８位にTを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の３４３２位にGを有する配列番号１の核酸；配列番号１の位置により定義するEP1-R遺伝子の３６２２位にAを有する配列番号１の核酸；またはこれらの相補配列またはこれらに対するアンチセンス配列または少なくとも一つの多形性を含む少なくとも１７塩基対のこれらのフラグメントの一つを含む核酸が提供される。
【００６５】フラグメントは少なくとも１７塩基対、より好ましくは少なくとも２０塩基対、より好ましくは少なくとも３０塩基対である。
【００６６】本明細書に記載の新規配列は、アンチセンス構築物の使用により、細胞内の遺伝子の発現の調節に使用し得る。哺乳類細胞中の本発明の遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法を可能にするために、例示アンチセンス発現構築物は、例えば、pREP10ベクター(Invitrogen Corporation)を使用して容易に構築できる。転写物は、このタイプの構築物でトランスフェクトした細胞中の遺伝子の翻訳を阻害すると予期される。アンチセンス転写物は、元の遺伝子転写物の本薬の阻害に有効であり、本明細書に記載の作用(例えば、組織生理学の調節)を誘導できる。本明細書に記載の新規遺伝子mRNAの任意の部分と相補的なおよびハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドは、治療的使用が考えられる。インビボ活性を示すオリゴヌクレオチドの同定法が完全に記載されてる、米国特許第5,639,595号、“Identificaiton of Novel Drugs and Reagents”、１９９７年６月１７日公開を、引用して本明細書に包含させる。先に記載のポリヌクレオチド由来の無作為オリゴヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、細胞内に形質転換する。次いで、細胞をオリゴヌクレオチドの所望の活性から得られる表現型に関してアッセイする。所望の表現型を有する細胞が同定されたら、所望の活性を有するオリゴヌクレオチドの配列を同定できる。同定は、ベクターの回収により、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によりおよび挿入核酸材料を含む領域の配列決定により達成し得る。アンチセンス分子は、アンチセンス治療のために合成できる。これらのアンチセンス分子はDNA、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのようなDNAの安定誘導体、RNA、２'−O−アルキルRNAのようなRNAの安定誘導体、または他のオリゴヌクレオチド模倣物であり得る。生理学的に安定なアンチセンスの合成および作用を記載した米国特許第５,６５２,３５５号、“Inverted Chimeric and Hybrid Oligonucleotides”、１９９７年７月２９日公開を、引用して包含させる。アンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソームカプセル封入により、またはアンチセンス配列を保持するベクターからの発現により細胞に挿入し得る。
【００６７】本発明は、本発明の多形性を検出できるヌクレオチドプライマーを更に提供する。
【００６８】本発明の他の態様により、配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の１個またはそれ以上の位置のEP1-R遺伝子多形性の検出ができる対立遺伝子特異的プライマーを提供する。
【００６９】対立遺伝子特異的プライマーは、一般に、一定のプライマーと共に、例えば、ARMS(登録商標)アッセイに使用するものとして、特定の配列位置における一つの対立遺伝子の選択的増幅を介した対立遺伝子の間の区別を提供するPCR反応のような増幅反応において使用する。対立遺伝子特異的プライマーは、好ましくは１７−５０ヌクレオチド、より好ましくは約１７−３５ヌクレオチド、より好ましくは約１７−３０ヌクレオチドである。
【００７０】対立遺伝子特異的プライマーは、正確に検出する対立遺伝子に対応するが、３'末端のヌクレオチドの約６−８個が検出する対立遺伝子に対応し、１０個まで、例えば、８個、６個、４個、２個または１個までの残りのヌクレオチドをプライマーの性質に明白な影響をすることなく変え得る、その誘導体も考慮する。
【００７１】プライマーは、合成の慣用法を使用して製造し得る。このような方法の例は、標準テキスト、例えば、“Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties”, Methods in Molecular Biology Series; Volume 20; Ed. Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7; 1993; 1st Editionに見ることができる。必要ならば、プライマーを検出を容易にするために標識し得る。
【００７２】本発明の他の態様により、配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の１個またはそれ以上の位置のEP1-R遺伝子多形性を検出できる対立遺伝子特異的プローブが提供される。
【００７３】対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは好ましくは１７−５０ヌクレオチド、より好ましくは約１７−３５ヌクレオチド、より好ましくは約１７−３０ヌクレオチドである。
【００７４】このようなプローブの設計は、通常技術の分子生物学者には明白である。このようなプローブは、簡便には５０塩基まで、４０塩基まで、より簡便には３０塩基までの長さであり、例えば、８−２５塩基または８−１５塩基長である。一般に、このようなプローブは遺伝子の対応する野生型または変異体位置座位に完全に相補的な塩基配列を含む。しかし、必要な場合、１個またはそれ以上のミスマッチを挿入し得るが、ただしオリゴヌクレオチドプローブの差異的力は不当に影響されない。本発明のプローブは、１個またはそれ以上の標識を担持し得、検出を容易にする。
【００７５】オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーは、一般に、多形性塩基とハイブリダイズできる塩基の位置が異なる。このように、プローブでは、多形性を補えるヌクレオチドがある位置に位置し、一方、(増幅反応に使用する)プライマーでは、多形性を補うヌクレオチドが、好ましくはプライマーの３'末端に位置する。
【００７６】本発明の他の態様により、本発明の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブおよび／または本発明の対立遺伝子特異的プライマーを含む、診断的キットが提供される。
【００７７】診断的キットは、適当な包装および本発明の方法に使用するための指示書を含み得る。このようなキットは、更に適当な緩衝剤、ヌクレオチドおよび熱安定性ポリメラーゼ、例えば、taqポリメラーゼのようなポリメラーゼを含み得る。
【００７８】本発明の他の態様において、本発明の多形性は結合試験における遺伝子マーカーとして使用し得る。これは、相対的に高い頻度により、配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における６２１−６２７、１１３６、１１８９、１４５８、３３４８３６２２位で特に当て嵌まる(実施例１参照)。
【００７９】本発明の他の態様により：i)配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の１個またはそれ以上の核酸の配列の決定、およびEP1-R遺伝子の多形性を参照したヒトの状態の決定を含むヒトにおけるRP1-R遺伝子の多形性ノ診断；およびii)有効量のEP1-R医薬の投与を含む、EP1-R医薬での処置を必要とするヒトの処置法を提供する。
【００８０】好ましくは、ヒトの状態の決定は診断的に有用である。臨床的有用性の例は、どの医薬(複数もある)を投与するかおよび／または医薬(複数もある)の有効量の確立を含む。
【００８１】EP1-Rの活性を減少させる医薬は、関節リウマチ、骨関節症および骨粗鬆症のような疼痛が不随する疾患を含む、多くの疾患状態に価値がある。
【００８２】本発明の他の態様により、配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の１個またはそれ以上の位置に多形性を有すると診断されたヒトにおけるEP1-R介在疾患を処置するための医薬の製剤における、EP1-R医薬の使用を提供する。
【００８３】本発明の他の態様により、配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の１個またはそれ以上の位置おける多形性を診断的に試験するための、EP1-R医薬およびヒトに投与するため指示書を含む、医薬パックを提供する。
【００８４】本発明の他の態様により、本発明の少なくとも１個の新規ポリヌクレオチド配列が保存されたコンピューター読取可能媒体を提供する。例えば、コンピューター読取可能媒体は相同性探査、地図作成、ハプロタイピング、ジェノタイピングまたは薬理遺伝学的分析または他の生物情報的分析に使用し得る。読者は、Bioinformatics, A practical Guide to the analysis of genes and proteins, Edited by A D Baxevanis & B F F Ouellette, John Wiley & Sons, 1998を参照のこと。例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、コンパクトディスク、デジタルディスク、ビデオディスク、パンチカードおよびハードドライブを含む、コンピューター読取可能媒体を使用し得る。
【００８５】本発明のポリヌクレオチド配列、またはその一部、特に、本明細書で同定した多形性に関するまたはそれを同定するものは、例えば、個体を単模式種および他のサブグループ化、例えば、特定の医薬での処置に対する感受性などの観点から特徴するための、価値のある情報源である。これらの試みは、コンピューター読取媒体に配列情報を保存し、次いで標準生物情報的プログラム、またはGCG(Genetics Computer Group)、BlastX BlastP、BlastN、FASTA(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に引用)のような当分野で標準的な研究用ツールを探索するためのに使用することにより、より容易に促進される。このように、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列同一性および他の研究分析のための有用なデータベースにおける成分として特に有用である。本明細書で使用する限り、コンピューター読取可能媒体への配列情報の貯蔵および配列データベースの、“本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列”に関する使用は、コンピューターディスのような有形媒体に、好ましくはコンピューター読取可能の形で変形し、変換しまたは貯蔵し得る、本発明のポリヌクレオチドの検出可能な化学的または物理的特長をカバーする。例えば、クロマトグラフスキャンデータまたはピークデータ、写真スキャンまたはピークデータ、マススペクトルデータ、配列ゲル(または他)データ。
【００８６】本発明は、本発明の１個またはそれ以上のポリヌクレオチド配列が貯蔵されたコンピューター読取可能媒体を提供する。例えば、提供されるコンピューター読取可能媒体は：本発明のポリヌクレオチドの配列を含むポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドから成るポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドの一部を含むポリヌクレオチド(その一部は本発明の少なくとも一つの多形性を含む)、少なくとも一つの本発明のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列のセット、本発明のポリヌクレオチド配列または本明細書で同定された少なくとも一つの多形性を含む部分を含む、またはそれから成るデータセットからなる群から選択されるメンバーを含み、保存されている。
【００８７】したがって、本発明の別の態様により、EP1-R遺伝子配列の少なくとも１７、好ましくは少なくとも２０連続塩基を含む、核酸配列が貯蔵され、該配列が配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の位置に少なくとも１個の多形性を含むものである、コンピューター読取可能媒体が提供される。
【００８８】コンピューターをベースにした方法は、また配列同定の実行のために提供され、該方法は本発明の多形性を含む核酸配列のコンピューター読取可能媒体への提供；および同一性(相同性)の同定のための該多形性含有核酸配列と、少なくとも一つの他の核酸またはポリペプチド配列の比較、即ち、多形性の存在のスクリーニングの段階を含む。
【００８９】本発明の他の態様において：EP1-R遺伝子配列の少なくとも２０連続塩基対を含み、配列番号１の位置により定義されたEP1-R遺伝子における３４４、６２１−６２７、７９３−７９９、９０８、１１３６、１１６０、１１８９、１４５８、１６５６、２４４８、２５３１、３３４８、３４３２および３６２２位の位置に少なくとも一つの多形性を含む核酸配列のコンピューター読取可能媒体への提供；および該核酸配列と同定された同一性の少なくとも一つの他の核酸配列との比較の段階を含む、配列同定を実施する方法が提供される。
【００９０】本発明の多形性の二つは、翻訳タンパク質におけるアミノ酸配列に変化をもたらす。２４４８位の多形性は、翻訳タンパク質の対応する１２６位におけるロイシンからプロリンへのアミノ酸変化をもたらす(Leu126Pro)。配列番号１により定義される２５３１位の多形性は、翻訳タンパク質の対応する１５４位におけるアラニンからスレオニンへのアミノ酸変化をもたらす(Ala154Thr)【００９１】このように、本発明の他の態様により、１２６位にプロリンおよび／または１５４位にスレオニンを有するヒトEP1-Rポリペプチドの対立遺伝子変異体、またはフラグメントが１２６位および／または１５４位に対立遺伝子を含む限り、少なくとも１０アミノ酸を含むそのフラグメントを提供する。好ましくは、対立遺伝子変異体は少なくとも３０％純粋、より好ましくは少なくとも６０％純粋、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、およびより好ましくは少なくとも９９％純粋である。
【００９２】EP1-Rポリペプチドのフラグメントは少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸である。本発明のポリペプチドは、例えば、自然に存在する限り、天然に存在するポリペプチドを含まず、例えば、ポリペプチドは天然に存在する少なくとも一つの成分から、少なくとも部分的に精製する。好ましくは、ポリペプチドは少なくとも３０％純粋、より好ましくは少なくとも６０％純粋、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、およびより好ましくは少なくとも９９％純粋である。
【００９３】本発明の別の態様により、１２６位にプロリンを有するおよび／または１５４位にスレオニンを有するヒトEP1-Rポリペプチドの対立遺伝子変異体、またはフラグメントが１２６位および／または１５４位に対立遺伝子を含む限り、少なくとも１０アミノ酸を含むそのフラグメントに特異的な抗体が提供される。
【００９４】抗体は、適当な方法を使用して製造できる。例えば、精製ポリペプチドは特異的抗体の製造のために使用し得る。“抗体”なる用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および例えば、F(ab)'２、Fabおよび一本鎖Fvのような種々のタイプの抗体構築物を含む。抗体は、１０７M−１より大きいまたはそれと同様のKaで抗原と結合できる場合、特異的に結合すると定義する。結合の親和性は慣用法、Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949)に記載されているものを使用して決定できる。
【００９５】ポリクローナル抗体は、種々の供給源、例えば馬、牛、ヤギ、羊、犬、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットから、当分野でよく知られる方法を用いて容易に作製することができる。一般に、抗原は、典型的には非経口注射によって宿主動物に投与する。抗原の免疫原性は、アジュバント、例えば完全フロイントまたは不完全フロイントアジュバントの使用により増強することができる。ブースター免疫の後、少量の血清試料を採取し、抗原に対する反応性について試験する。このような測定のために有用な様々な検定の例は、Antibodies :A Laboratory Manual, HarlowおよびLane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988に記載の検定；および向流免疫電気泳動(CIEP)、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降法、酵素結合イムノソルベント検定(ELISA)、ドットブロット検定、およびサンドイッチ検定のような方法を包含し、米国特許第4376110および4486530号を参照されたい。
【００９６】モノクローナル抗体は周知の方法を用いて容易に作製することができ、例えば米国特許第RE32011、4902614、4543439および4411993号；Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis、Plenum Press、Kennett、McKearnおよびBechtol(編)、(1980)に記載の方法を参照されたい。
【００９７】本発明に係るモノクローナル抗体は、これらに代わる技術、例えばAlting-Mess等による「モノクローナル抗体発現ライブラリー：ハイブリドーマの迅速な代替物」、Strategies in Molecular Biology、3:1-9(1990)に記載の技術を用いて作製することもでき、これを引用して本明細書の一部とする。同様に、特異的結合抗体をコードしている遺伝子の可変領域が組み込まれるように、組み換えDNA技術を用いて結合相手を組み立てることができる。このような技術はLarrick等、Biotechnology、7:394(1989)に記載されている。
【００９８】分離および精製されたならば、その抗体を、確立された検定プロトコルを用いて試料中の抗原の存在の検出に使用することができる。
【００９９】ここで本発明を以下の実施例に言及することにより説明するが、これは限定的なものではない。温度は全て摂氏である。
【０１００】下記の実施例において、別途記載のない限り、以下の方法論および材料を適用した。
【０１０１】Perkin-Elmer Cetusより入手可能なAMPLITAQ(登録商標)またはAMPLITAQ GOLD(登録商標)を熱安定性DNAポリメラーゼの原料として使用する。
【０１０２】全般的な分子生物学的手法は、「分子クローニング − 研究室マニュアル」第2版、Sambrook、FritschおよびManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory、1989)、または「分子生物学の最新プロトコル」、1-3巻、F M Asubel、R BrentおよびR E Kingston編、John Wiley出版、1998に記載の任意の方法に従うことができる。
【０１０３】電気泳動図は標準的方法で取得した：データはABI377データ採集ソフトウェアにより採集し、波形はABI Prism(登録商標)配列決定分析(2.1.2)によって作製した。
【０１０４】実施例１ヒトEP1-R遺伝子のゲノムDNA配列図１多形性の同定１．方法ゲノムDNAの調製プロトコルI(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, p392, Sambrook, Fritsch and Maniatis, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, 1989)にしたがって、以下の修飾をして、白人ドナー由来のリンパ芽球セルラインからゲノムDNAを調製した。DNAを脱イオン水に溶解した。
【０１０５】鋳型の調製鋳型は、PCRにより調製した。伸長温度は７２°、変性温度は９４°であり、各工程は１分間であった。一般に、各反応においてｃDNA １００pgを使用し、４０サイクルのPCRに付した。色素プライマー配列決定のために、前プライマーを修飾してオリゴヌクレオチドの５’末端にM１３前配列(ABIプロトコールP/N402114, Applied Biosystems)を含めた。
【０１０６】色素プライマー配列決定M13前進プライマーを用いる色素−プライマー配列決定は、“AmpliTaq FS”(登録商標)DNAポリメラーゼを伴うABI Prism(登録商標)色素プライマーサイクル配列決定コアキットのためのABIプロトコルP/N 402114に記載の通りとし、アニーリング温度を４５゜とし、そしてDMSOを最終濃度５％となるまでこのサイクル配列決定混合物に添加するという修飾を施した。
【０１０７】各塩基についての伸長反応をプールし、エタノール／酢酸ナトリウム沈澱させ、洗浄し、ホルムアミド負荷緩衝液に再懸濁した。自動シークエンサー(ABI377、Applied Biosystems)上で4.25%アクリルアミドゲルを稼働させた。
【０１０８】２.結果新規多形性【表２】
頻度はコントロール対照における第２対立遺伝子の対立遺伝子頻度である。
【０１０９】実施例２ヒトEP1-R遺伝子の完全長DNA配列の決定ヒトEP1-R遺伝子の完全長ゲノムDNA配列をPCRにより得た。イントロン配列は、フランキングｃDNA配列からPCRにより得た。ゲノム配列１−１０７３をvectorette PCRにより得た(Riley et al., Nuc. Acid Res. 18, 2887-2890, 1990)。
【０１１０】配列番号１とEMBL L22647の対応領域の比較配列番号１ EMBL L22647位置 位置1074-1130 1-572055-3013 58-10163566-3908 1017-1359【０１１１】公開されたEP1-R遺伝子における誤りの同定配列番号１により定義されたEP1-R遺伝子の完全長ゲノムDNAと、EMBL L22647に公開されたｃDNA配列およびEMBL AC008569に公開されたゲノムDNAの詳細な比較の実施により、我々は公開された配列に以下の誤りを発見し、その幾つかは公開アミノ酸配列に変化をもたらす。
【０１１２】
【表３】
【表４】
【０１１３】実施例３操作されたRFLP【表５】
全ての位置は、配列番号１の位置を参照する。
【０１１４】
プライマー1161-1182 BfaICTTCATGCCCTCCTCCTCCCTA 配列番号２１１６０位のCが診断フラグメントにおいてBfa Iを創製する。
プライマー1459-1477 ApaICCTGCCCCATGGACGGGCC 配列番号３１４５８位のGが診断フラグメントにおいてApa I部位を創製する。
プライマー1657-1682 Msc ITCTGATAGCTCTCACCCATTTTGGCC 配列番号４１６５６位のTが診断フラグメントにおいてMsc Iを創製する。
プライマー2449-2472 Sac IITCCACGGCCATGCCACAGCCCCGC 配列番号５２４４８位のCが診断フラグメントにおいてSac IIを創製する。
プライマー3623-3646 Spe IGGAGGCAAGGCGCACGGCCAGGAC 配列番号６３６２２位のAが診断フラグメントにおいてSpe I部位を創製する。
【０１１５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING<110> ASTRAZENECA AB ANAND, RAKESH SMITH, JOHN C MORTEN, JOHN E N<120> DIAGNOSTIC METHOD<130> LDSG/Z70667<140><141><160> 6<170> PatentIn Ver. 2.1<210> 1<211> 3918<212> DNA<213> Human<400> 1aaacagagtg tggtcagggg cagttttggc aataaggagt gtgtgtgcgt gtgtgtatct 60ctcggggtgc caagtgagac cctatttccc agcactaagg agggtggttc gggtgatcat 120ctcagagggc tgcattttgg ggtgttggga ggggctggaa ttgaggcagt aactctgggt 180gcgtcccggc gctgggggta agaccctgag ttcagggatg tggcggcagc aacctggctg 240tgctgagatg gggacaggat gaaactgagt ggtaagtgac aggattgtat gtcttagggt 300gtgaggctgt gccagtgtga ccctacttct cagggcagga ggcgagtctt tgtgtcttag 360gacgtgtgtc acaggtgtca ctcagcccat cttaaaggag ccagtcactg gggagagtcc 420ccaggtcgcc aggcctcctg gttcccctgc cccctttcag cctcctccca ggatatgact 480cgctgtggcc ctagccgggg cttaagcccc tgtataaata ggcggatccc ctggccaggc 540tgggcctgac ccaagctggt ctacccgagg ccctgcccac cagcacccac cccgacatcc 600acgaaggctt tggcagggca gggggggcat tgctggcccc acagaattgg agttagcctc 660tctagctcca aagccccagg gaggggggca gtggcacccc ctgcagctgc cccagcccgc 720cccagacgac gctcacattt tccagtgttt agattttatc cgctttatta atgaggcaag 780aggcccgatc ctggggggga agggggctgc tcccgccctg ctgggaggag ggggtcacat 840ggggccagac caactccagg gagcctcact cctcgtggag ggagccgctg gggcccagag 900tggcccccgc ccattgccag gagcagagag gggggtctct gccactccag gcccccagcg 960ggcgtgcgcg gggtggagcg gcccctggag gccagcaagg gcggcgggag gagctgagga 1020gccgccccag gaagagggag ggaggaagcg gcttgccgga gagccagggc gcagtgggcg 1080gcagggctga gcggccggtg atggggaccc cacatcccag gcagtgccgg gtaagcgggt 1140tgcacatgag ggtccctgat tggggaggag gagggcatga aggggtgggg ccatggccac 1200ctgctgtccg tcctgtgtcc ccgggctctt ctccctgatc tgtgcgtccc tgtcttaccg 1260tctgtccatc ctcccttccc atctggcctg gtgggcagtt ccgccctttc agccctcacc 1320accaggatat caaagagtgg atggtcgtgg ggccgcctcc aggcctctgg ggcagggata 1380tggagtggaa ccgtgggcac ccagggtgag gcagaggtga tcggggtagg gcctggcgag 1440agaccgcagt ggagcagggg caggtccatg gggcaggggc agagatgggt ccatggcaca 1500gatgtggctg tgccatgtgg ggtcagagat gggtccatgg gggacaggga catggccgtg 1560gggagagatg tgcccgtggt ggtagagatg gggctggggc atcgaggatg ggactggagt 1620aaagctgaca tggggaaagt caggtagggc cacagtggca gaaatgggtg agagctatca 1680gatggagcca caggccccag gaatttgctg ggtgtaaaaa tggaaggtgg gggtcggagg 1740cactggcaga gatgcctgag ggcggggctg gggggaatct tgcaggaaac catgaagggc 1800agagaaaggg ccagtggggt tagagggagg ccctggagca ggagatgggg tggtgagagg 1860caaaagagag ggagaagggt ttccaaatgg agtggccagg tcatttggag ttgcccatgg 1920caactgccat gggcagaggg gccgcctgag aacgccatgg agtcaaacag gccctgatgt 1980tctgagatgg caccgtgggc tggtccccgc ccgggcccag ccagcctcac tctgccctcc 2040tctcctctat ccagcacccc tggcgcctga catgagccct tgcgggcccc tcaacctgag 2100cctggcgggc gaggcgacca catgcgcggc gccctgggtc cccaacacgt cggccgtgcc 2160gccgtcgggc gcttcgcccg cgctgcccat cttctccatg acgctgggcg ccgtgtccaa 2220cctgctggcg ctggcgctgc tggcgcaggc cgcgggccgc ctgcgacgcc gccgctcggc 2280cgccaccttc ctgctgttcg tggccagcct gctggccacc gacctggcgg gccacgtgat 2340cccgggcgcg ctggtgctgc gtctgtacac tgcggggcgc gctccggccg gcggggcctg 2400ccacttcctg ggcggctgca tggtcttctt cggcctgtgc ccgctgctgc tgggctgtgg 2460catggccgtg gagcgctgcg tgggcgtcac gcggccgctg ctccacgccg cgcgggtctc 2520ggtcgcccgc gcgcgcctgg cgctggccgc ggtggccgcg gtggccttgg ccgtggcgct 2580gctgccgctg gcgcgcgtgg gccgctatga gctgcagtac ccgggcacgt ggtgcttcat 2640cggcctgggt cccccgggcg gctggcgcca ggcactgctt gctggcctct tcgccagcct 2700cggcctggtc gcgctcctcg ccgcgctggt gtgcaacacg ctcagcggcc tggccctgct 2760acgcgcccgc tggcgacgcc gctcccgacg gcctcccccg gcctcaggcc ccgacagccg 2820gcgtcgctgg ggggcgcacg gaccccgctc ggcctccgcc tcgtccgcct cgtccatcgc 2880ttcggcctcc accttctttg gcggctctcg gagcagcggc tcggcacgca gagctcgcgc 2940ccacgacgtg gagatggtgg gccagcttgt cggtatcatg gtggtgtcgt gcatctgctg 3000gagcccaatg ctggtgaggg gcgcaccggc ccctcgagcc acgctccttc ccgctccctc 3060tcggcaccct cccgcccttt gtcgtcccag gacacctggg gcctccatcc tggactcaac 3120caaggccccg gcccctagag gccccacctg ccccgaaagc cagcatcgcc ttctccatct 3180gacctcccat ccttcctcct agcccccctc tcctcttcct ttttggggtc tttgtagcgc 3240accccgaccc acacaagcct cctctcctgc cccaccgtta taagtcgccg cgcttcattc 3300cctagtcctt tcacccaacc cccttgcttt tcctctttcc gggacacctg agactcctct 3360acggccggac ccccacccac tgaaggtgtt tgtttctttg cccccctttt ttttccgcat 3420ccgtttctca tctggatccc catttaccct ccctgcgacg gctcgcccct cctcccaggc 3480ttttaccttc cagccacgcc cccaccatcc ctgcgccccc ctgcgcccgc gcctgctcta 3540tagctcacac cggcttcccc cgcaggtgtt ggtggcgctg gccgtcggcg gctggagctc 3600tacctccctg cagcggccac tgttcctggc cgtgcgcctt gcctcctgga accagatcct 3660ggacccttgg gtgtacatcc tactgcgcca ggccgtgctg cgccaactgc ttcgcctctt 3720gcccccgagg gccggagcca agggcggccc cgcggggctg ggcctaacac cgagcgcctg 3780ggaggccagc tcgctgcgca gctcccggca cagcggcctc agccacttct aagcacaacc 3840agaggcccaa cgactaagcc agcccaccct gggctgggcc caggtgcgcg gcgcagagcc 3900tttgggaact tgggccag 3918<210> 2<211> 22<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: Primer<400> 2cttcatgccc tcctcctccc ta 22<210> 3<211> 19<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: Primer<400> 3cctgccccat ggacgggcc 19<210> 4<211> 26<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: Primer<400> 4tctgatagct ctcacccatt ttggcc 26<210> 5<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: Primer<400> 5tccacggcca tgccacagcc ccgc 24<210> 6<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: Primer<400> 6ggaggcaagg cgcacggcca ggac 24 |
| 【出願人】 |
【識別番号】３９１００８９５１
【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ
|
| 【出願日】 |
平成１３年２月１６日（２００１．２．１６） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００６２１４４
【弁理士】
【氏名又は名称】青山 葆 （外１名）
|
| 【公開番号】 |
特開２００１−２８６２８８（Ｐ２００１−２８６２８８Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１３年１０月１６日（２００１．１０．１６） |
| 【出願番号】 |
特願２００１−４００７６（Ｐ２００１−４００７６） |
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