トップ :: C 化学 冶金 :: C12 生化学;ビ−ル;酒精;ぶどう酒;酢;微生物学;酵素学;突然変異または遺伝子工学




【発明の名称】 特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法
【発明者】 【氏名】石橋 要

【氏名】辻 明彦
【要約】 【課題】細胞にマーカーとして使用可能な細胞表面分子が存在しない場合や、存在しても細胞間で区別ができない場合、さらにはマーカーとなるべき分子が細胞外液中に遊離してしまう場合であっても、目的とする細胞、すなわち特定の遺伝子を発現した細胞を生きたままの状態で選択的に分離取得することが可能な分離方法を提供すること。

【解決手段】特定のｍＲＮＡを発現した生細胞を含む生細胞群の細胞中に、該ｍＲＮＡを標識可能な標識剤を導入する第１の工程と、前記標識剤で前記ｍＲＮＡを標識することにより、標識化ｍＲＮＡを含有する生細胞を含む生細胞群を得る第２の工程と、前記標識化ｍＲＮＡを検出することにより該標識化ｍＲＮＡを含有する生細胞を同定し、同定した該生細胞を前記第２の工程で得られた前記生細胞群から選択的に分離する第３の工程とを含むことを特徴とする特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 特定のｍＲＮＡを発現した生細胞を含む生細胞群の細胞中に、該ｍＲＮＡを標識可能な標識剤を導入する第１の工程と、前記標識剤で前記ｍＲＮＡを標識することにより、標識化ｍＲＮＡを含有する生細胞を含む生細胞群を得る第２の工程と、前記標識化ｍＲＮＡを検出することにより該標識化ｍＲＮＡを含有する生細胞を同定し、同定した該生細胞を前記第２の工程で得られた前記生細胞群から選択的に分離する第３の工程と、を含むことを特徴とする特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法。
【請求項２】 前記第１の工程における標識剤が、前記ｍＲＮＡと相補的な塩基配列を有し、且つ蛍光色素で標識されたプローブであり、前記第２の工程における標識化ｍＲＮＡが、該プローブと前記ｍＲＮＡとのハイブリッド体であり、前記第３の工程において、該ハイブリッド体を含有する生細胞を含む生細胞群に光を照射して、該ハイブリッド体の形成に基づく前記蛍光色素の蛍光変化を検出することにより該蛍光変化を生じる生細胞を同定し、同定された該生細胞を前記第２の工程で得られた前記生細胞群から選択的に分離することを特徴とする請求項１記載の特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法。
【請求項３】 前記プローブが、第１のプローブおよび第２のプローブからなり、該第１のプローブと、該第２のプローブとは、前記ｍＲＮＡに対して隣接してハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該第１のプローブがエネルギードナー蛍光色素で標識され、そして該第２のプローブがエネルギーアクセプタター蛍光色素で標識されたものであり、前記蛍光変化が、該第１のプローブのエネルギードナー蛍光色素から、該第２のプローブのエネルギーアクセプター蛍光色素への蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により生じるものであることを特徴とする請求項２記載の特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法。
【請求項４】 前記第３の工程における、前記蛍光変化を生じる生細胞の選択的分離が、セルソーター（ＦＡＣＳ）により実施されることを特徴とする請求項２または３記載の特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法。
【請求項５】 前記ｍＲＮＡが、サイトカインをコードするｍＲＮＡであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法。
【請求項６】 前記ｍＲＮＡが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）をコードするｍＲＮＡであり、前記第１のプローブが配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有するプローブであり、さらに、前記第２のプローブが配列表の配列番号１０に記載の塩基配列を有するプローブであることを特徴とする請求項３〜５のいずれか一項に記載の特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法。
【請求項７】 前記第３の工程において選択的に分離される生細胞が、Ｔヘルパー１（ＴＨ１）細胞であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法。
【請求項８】 前記ｍＲＮＡが、インターロイキン−４（ＩＬ−４）をコードするｍＲＮＡであり、前記第１のプローブが配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を有するプローブであり、さらに、前記第２のプローブが配列表の配列番号１８に記載の塩基配列を有するプローブであることを特徴とする請求項３〜５のいずれか一項に記載の特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法。
【請求項９】 前記第３の工程において選択的に分離される生細胞が、Ｔヘルパー２（ＴＨ２）細胞であることを特徴とする請求項１〜５、８のいずれか一項に記載の特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】特定の遺伝子を発現した細胞を生きたままで選択的に分離する方法としては、当該遺伝子の翻訳産物が細胞表面分子である場合は、同表面分子に蛍光標識抗体を結合させフローサイトメーターにより蛍光を発する細胞を同定し、同定された細胞をセルソーター（Fluorescence Activated Cell Sorter、ＦＡＣＳ）により分離する方法を挙げることができる。また、細胞表面分子に特異的に結合する抗体が敷き詰められたディッシュ底面上に目的細胞のみを吸着させるパニング法も知られている。
【０００３】一方、遺伝子の翻訳産物として細胞表面分子を生じることなく、翻訳産物が専ら細胞内（細胞質内もしくは諸器官内）に局在する分子である場合は、上記の方法を採用することができない。この場合は、細胞内に局在する分子に特異的な蛍光標識抗体をマイクロインジェクション法により細胞内に導入して遺伝子発現細胞を蛍光標識し、レーザー光などの照射により生じた蛍光強度の格差に基づいて、上記のセルソーターにより目的遺伝子発現細胞を分離することは理論的には可能である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、マイクロインジェクションによる上記の細胞標識法は、１回の実験あたり１個ないしは数個の細胞に蛍光標識抗体を導入するのが実験手技上の限界であり、また、一度に多くを標識できる手法ではなく、分子量１２万以上の高分子である抗体の高濃度溶液は粘性が高く細胞内への導入は容易ではないことから、実用化の観点で問題がある。
【０００５】また、遺伝子の翻訳産物が細胞表面分子ではなく、翻訳産物が細胞外液中に遊離され、細胞内や細胞膜付近に止まらないような分子である場合は、特定の遺伝子を発現した細胞を上述の手法で選択的に捕らえ、他の分子と分離することは非常に困難である。これは、遺伝情報に基づいて翻訳されて生じたポリぺプチド鎖が折り畳まれて細胞外へ分泌される過程で、その構造は細胞内で時々刻々変化するため、既存の抗体では生細胞の細胞内もしくは細胞表面で効率よくこのポリペプチド鎖に結合できないからである。また、遺伝子翻訳産物が細胞表面に存在する場合であっても、その分子が特定の細胞の細胞表面に特異的に存在するものでなければ、細胞の選択的分離は困難である。
【０００６】上記のような問題点が生じる典型的な例として、以下に述べる、遺伝子の翻訳産物としてサイトカインを分泌する細胞を選択的に分離する場合が挙げられる。
【０００７】生体内に抗原が侵入した場合、その抗原を異物として認識したヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）は活性化され、相互に免疫機能を異にするＴＨ１（Ｔ Ｈｅｌｐｅｒ １、マクロファージ等を活性化し異物を貪食させて排除するなど細胞性免疫機能を担当する）と、ＴＨ２（Ｔ Ｈｅｌｐｅｒ ２、Ｂ細胞を活性化し異物を中和する抗体分子の産生等を促すなど液体性免疫機能を担当する）とに分化する（図９４参照）。ＴＨ１およびＴＨ２は、サイトカインとしてそれぞれインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）を生じる。健常な状態では、ＴＨ１とＴＨ２は相互に機能を抑制し、均衡を保っているが、この関係が破綻すれば、さまざまな感染症や自己免疫疾患の原因となる。
【０００８】ＴＨ１またはＴＨ２を選択的に分離取得することができれば、免疫機能補充等への応用をはかることができるため医学的な重要性が高い。したがって、ＴＨ１やＴＨ２の細胞表面に存在し、分離取得のために用いることが可能な分子を見出す試みが様々なされてきた。
【０００９】例えば、接着分子、Ｐ-ならびにＥ-セレクチン（selectine）依存的な組織浸潤がヒトＴＨ１に特異的に観察されることが報告されている（Austrup, F. et al.Nature, 385, 81-83, 1997）。これは、ＴＨ１の細胞表面特異的に前記セレクチンと接着するリガンドが存在することを意味する。しかしながら、Ｐ-ならびにＥ-セレクチンに対する反応性をフローサイトメトリーで調べてみると、Ｐ-セレクチンについてはＴＨ１：ＴＨ２＝１３１：５２、Ｅ-セレクチンについてはＴＨ１：ＴＨ２＝６６８：８８との結果が得られるため、当該特異性は完全なものではなく、炎症を引き起こした組織（皮膚、関節）に特有な生理的条件下でTH1において特に顕著なＰ-ならびにＥに対するリガンドの発現誘導が起きることが反映された結果であると解釈される。
【００１０】また、ＣＣ−ケモカイン、エオタキシン（eotaxin）受容体（ＣＣＲ３）がヒトＴＨ２の細胞表面において略特異的に存在するとの報告もある（Sallusto,F.et al. Science, 277, 1997）。しかしながら、ＣＣＲ３陰性のＴ細胞群の中でもＩＬ−４を産生するＴＨ２型が１.９％の割合で混在することから、当該特異性は完全なものではない。また、好酸球、好塩基球の細胞表面にはＴＨ２よりも格段に多くの同受容体が存在することから、血液中から粗精製されたＴリンパ球からＣＣＲ３陽性細胞を分離しただけでは、TH2以外の細胞が混入する可能性が懸念される。
【００１１】さらに、他のＣＣ−ケモカイン、ＭＩＰ-１βもしくはＩＰ１０の受容体であるＣＣＲ５、およびＣＸＣ−ケモカイン、ＳＤＦ-１の受容体であるＣＸＣＲ３がヒトＴＨ１の細胞表面に略特異的に存在するとの報告もある（Loestscher, P.et al. Nature, 391, 344, 1998）。しかしながら、得られた９株のＴＨ２クローンの中の１株はＣＣＲ５陽性であったことから、当該特異性は完全なものではない。また、ＣＸＣＲ３の遺伝子発現とＣＸＣ−ケモカイン依存的な遊走活性のレベルではＴＨ１がＴＨ２よりも高いものの、調べたＴＨ２の全クローンにおいてＣＸＣＲ３の遺伝子発現が確認されたことから、当該特異性は完全ではない。また、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ３は好中球の細胞表面にも存在することから、血液中から粗精製されたＴリンパ球から分離されるＣＣＲ５もしくはＣＸＣＲ３陽性細胞中に好中球が混入する可能性が懸念される。
【００１２】また、ＩＬ−１２（インターロイキン１２）の受容体（ＩＬ−１２Ｒ）はヒトTH1の細胞表面に略特異的に存在するとの報告がある（Rogge, L. et al. J.Exp.Med, 185, 825, 1997）。しかしながら、ＴＨ１の細胞表面にはＩＬ−１２に対する高親和性受容体（Kd値＝27 pM）と低親和性受容体（Kd値＝5 nM）が１細胞表面あたりそれぞれ１４０分子、４５０分子存在するが、同様の低親和性受容体（Kd値＝2 nM）がＴＨ２にも１細胞表面あたり２２０分子存在する。このことから、ＩＬ−１２ＲもＴＨ１の細胞表面マーカーとして完全なものとは言えない。また、ＮＫ細胞の細胞表面にもＩＬ−１２Ｒが存在することから、血液中から粗精製されたＴリンパ球から分離されるＩＬ−１２Ｒ陽性細胞中にＮＫ細胞が混入する可能性が懸念される。
【００１３】また、ＩＬ−１８（インターロイキン１８）の受容体（ＩＬ−１８Ｒ）は、オバルブミン（ovalbumin）に対するＴ細胞受容体のトランスジェニックマウスから樹立したＴＨ１クローンの細胞表面に特異的に存在するとの報告がある（Xu,D. et al. J.Exp.Med, 188, 1485, 1998）。しかしながら、ＩＬ−１８Ｒと同様にインターロイキン１の受容体（ＩＬ−１Ｒ）ファミリーに属する分子ＳＴ２ＬがＴＨ２の細胞表面に存在することが知られている。ＩＬ−１Ｒファミリー間の遺伝子相同性はヒトでは特に高いため、ヒトではＩＬ−１８ＲがＴＨ１の決定的な細胞表面マーカーとは言えず、これまでのところヒトＴＨ１の細胞表面に特異的に存在することを報告した例はない。また、単球、好中球、ＮＫ細胞の細胞表面にはＴＨ１よりも格段に多くのＩＬ−１８Ｒが存在することから、血液中から粗精製されたＴリンパ球から分離されるＩＬ−１８Ｒ陽性細胞中には、ＴＨ１以外の細胞が混入する可能性が懸念される。
【００１４】上記の報告は、総じてＴＨ１もしくはＴＨ２の細胞表面に存在するサイトカイン、ケモカインなどの受容体が、量（細胞表面あたりの数）的もしくは質的（リガンドに対する受容体の親和性もしくはリガンドの結合にともなう刺激の細胞内伝達性）に顕著に変化し、その結果、該受容体の分布がＴＨ１もしくはＴＨ２のいずれかに極度に偏ることを述べているものと解釈される。このようなＴＨ１もしくはＴＨ２の細胞表面分子の偏りを生じる原因は、ヘルパーＴ細胞をとりまく生体内の環境（生理的条件）にあると考えられる。
【００１５】例えば、前記サイトカイン受容体のリガンドの一つであるＩＬ−１２は感染初期にマクロファージ等によって分泌されるサイトカインであり（Walker, W. etal. J. Immunol., 162, 5894, 1999）、ＩＬ−１８も活性化されたマクロファージやクッパー細胞によって産生される（Yoshimoto, T. et al. J. Immunol., 161, 3400, 1998）ことが知られている。当然のことながら、これらの両サイトカインは細胞性免疫機能を司るＴＨ１との間にＴＨ２と比較してより多くの接点を有し、マクロファージからＴＨ１への生理的情報の伝達を担う（生体内でＴＨ１を活性化する）因子であると解釈される。
【００１６】このことから、ＴＨ１がマクロファージを活性化することが、マクロファージから返される刺激（ＩＬ−１２やＩＬ−１８）を受けることに繋がり、逆に、ＴＨ１によって活性化されたマクロファージは生体内の異物を排除しながらもＴＨ１を活性化することになる。このような相互に依存し合う関係が生体内の炎症部位で成立していく中で、ＩＬ−１２やＩＬ−１８に対する受容体数ならびに受容体分子の活性がＴＨ１の細胞表面において顕著に増すことは充分に予想されることである。一方のＴＨ２は、生体内でＴＨ１と同じ条件下に曝されることがないため、ＩＬ−１２やＩＬ−１８を受けとめる必要性すら無いと解釈される。しかしながら、たとえ僅かであれＩＬ−１２やＩＬ−１８の受容体がＴＨ２の細胞表面に検出される以上、ＴＨ２もＩＬ−１２やＩＬ−１８に対応する潜在能力を有することは否定できない。
【００１７】したがって、これらのサイトカイン受容体はＴＨ１とＴＨ２両者の中からＴＨ１を識別するための決定的なマーカーであるとは考えられない。このことに加え、ＴＨ１もしくはＴＨ２に分布が偏る前記ケモカイン、サイトカイン受容体は、ＮＫ細胞等ヘルパーＴ細胞以外の細胞種にも分布することから、ＴＨ１もしくはＴＨ２を識別するマーカーとして実用的ではないと考えられる。例えば、ヒトから採血して得られた血液サンプルから通常の方法で分離精製されるＣＤ４陽性細胞（ヘルパーＴ細胞）の細胞試料中には単球や顆粒球が混在していることが多く、これらが疑似陽性細胞となり、ＴＨ１もしくはＴＨ２と見誤ることが予想されるからである。
【００１８】上記のように、ＴＨ１とＴＨ２とを表面分子を利用して選択的に分離するのは非常に困難である。また、ＴＨ１およびＴＨ２が産生するサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＬ−４）は細胞内や細胞膜付近に止まらず、細胞外液中に遊離してしまうため、サイトカインを用いてＴＨ１とＴＨ２とを選択的に分離することも困難である。
【００１９】本発明は、上記の従来技術の問題点を鑑みてなされたものであり、細胞にマーカーとして使用可能な細胞表面分子が存在しない場合や、存在しても細胞間で区別ができない場合、さらにはマーカーとなるべき分子が細胞外液中に遊離してしまう場合であっても、目的とする細胞、すなわち特定の遺伝子を発現した細胞を生きたままの状態で選択的に分離取得することが可能な分離方法を提供することを目的とする。
【００２０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記従来技術の問題点は、特定の遺伝子の翻訳産物（ポリぺプチド）を標的（マーカー）として用い、遺伝子発現細胞を分離しようとするために生じるものであることを見出した。そして、この見解に基づいて鋭意研究を重ねた結果、翻訳産物（ポリぺプチド）に代えて、遺伝子の転写産物であり、主として細胞質中に浮遊状態で存在するｍＲＮＡを標的（マーカー）として用いることにより、マーカーとして使用可能な細胞表面分子が存在しない場合や、存在しても細胞間で区別ができない場合、さらにはマーカーとなるべき分子が細胞外液中に遊離してしまう場合であっても、特定の遺伝子を発現した細胞を生きたままの状態で選択的に分離することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【００２１】すなわち、本発明の特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法は、特定のｍＲＮＡを発現した生細胞を含む生細胞群の細胞中に、該ｍＲＮＡを標識可能な標識剤を導入する第１の工程と、前記標識剤で前記ｍＲＮＡを標識することにより、標識化ｍＲＮＡを含有する生細胞を含む生細胞群を得る第２の工程と、前記標識化ｍＲＮＡを検出することにより該標識化ｍＲＮＡを含有する生細胞を同定し、同定した該生細胞を前記第２の工程で得られた前記生細胞群から選択的に分離する第３の工程とを含むことを特徴とするものである。
【００２２】本発明の特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法においては、前記第１の工程における標識剤が、前記ｍＲＮＡと相補的な塩基配列を有し、且つ蛍光色素で標識されたプローブであり、前記第２の工程における標識化ｍＲＮＡが、該プローブと前記ｍＲＮＡとのハイブリッド体であり、前記第３の工程において、該ハイブリッド体を含有する生細胞を含む生細胞群に光を照射して、該ハイブリッド体の形成に基づく前記蛍光色素の蛍光変化を検出することにより該蛍光変化を生じる生細胞を同定し、同定された該生細胞を前記第２の工程で得られた前記生細胞群から選択的に分離することが好ましい。
【００２３】また、前記プローブが、第１のプローブおよび第２のプローブからなり、該第１のプローブと、該第２のプローブとは、前記ｍＲＮＡに対して隣接してハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該第１のプローブがエネルギードナー蛍光色素で標識され、そして該第２のプローブがエネルギーアクセプタター蛍光色素で標識されたものであり、前記蛍光変化が、該第１のプローブのエネルギードナー蛍光色素から、該第２のプローブのエネルギーアクセプター蛍光色素への蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により生じるものであることが好ましい。
【００２４】さらに、本発明の特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法においては、前記第３の工程における、前記蛍光変化を生じる生細胞の選択的分離が、セルソーター（ＦＡＣＳ）により実施されることが好ましい。
【００２５】また、前記ｍＲＮＡが、サイトカインをコードするｍＲＮＡであることが好ましく、さらには、前記ｍＲＮＡが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）をコードするｍＲＮＡであり、前記第１のプローブが配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有するプローブであり、さらに、前記第２のプローブが配列表の配列番号１０に記載の塩基配列を有するプローブであることが好ましい。
【００２６】また、前記ｍＲＮＡが、インターロイキン−４（ＩＬ−４）をコードするｍＲＮＡであり、前記第１のプローブが配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を有するプローブであり、さらに、前記第２のプローブが配列表の配列番号１８に記載の塩基配列を有するプローブであることが好ましい。
【００２７】本発明においては、前記第３の工程において選択的に分離される生細胞が、Ｔヘルパー１（ＴＨ１）細胞、または、Ｔヘルパー２（ＴＨ２）細胞であることが好ましい。
【００２８】
【発明の実施の形態】本発明の特定の遺伝子を発現した生細胞の選択的分離方法は、特定のｍＲＮＡを発現した生細胞を含む生細胞群の細胞中に、該ｍＲＮＡを標識可能な標識剤を導入する第１の工程と、前記標識剤で前記ｍＲＮＡを標識することにより、標識化ｍＲＮＡを含有する生細胞を含む生細胞群を得る第２の工程と、前記標識化ｍＲＮＡを検出することにより該標識化ｍＲＮＡを含有する生細胞を同定し、同定した該生細胞を前記第２の工程で得られた前記生細胞群から選択的に分離する第３の工程とを含む方法である。
【００２９】本発明において細胞中に導入する標識剤は、ｍＲＮＡを標識できるものであればよく、特に制限されない。標識剤は細胞内でｍＲＮＡと結合することにより標識化ｍＲＮＡが生じるが、細胞中にｍＲＮＡが存在しない場合や、ｍＲＮＡが存在したとしても標識剤を過剰量導入したような場合は、ｍＲＮＡとの結合に関与しない標識剤が細胞中に残存することが考えられるため、標識剤は、ｍＲＮＡと結合したときのみに検出可能となるようなものであるか、もしくは、ｍＲＮＡと結合したものとｍＲＮＡに結合しないものとを別々に検出できるようなものであることが好ましい。
【００３０】本発明においては、標識剤として、ｍＲＮＡと相補的な塩基配列を有し、且つ蛍光色素で標識されたプローブ（以下、場合により蛍光標識プローブと呼ぶ）を使用することが好ましい。このようなプローブは細胞内でｍＲＮＡとハイブリッド体を形成するが、上記のようにハイブリッド体を形成しないプローブと分離して検出する必要があるために、本プローブはハイブリッド体が形成されたことに基づいて蛍光変化を生じるようなものを用いることが好ましい。
【００３１】このようなプローブとしては、それぞれ別種の蛍光色素で標識したプローブを組み合わせて用いることが好ましい。すなわち、第１のプローブおよび第２のプローブからなるプローブであって、該第１のプローブと、該第２のプローブとは、前記ｍＲＮＡに対して隣接してハイブリダイズ可能な塩基配列を有し、該第１のプローブがエネルギードナー蛍光色素で標識され、そして該第２のプローブがエネルギーアクセプタター蛍光色素で標識されたプローブを用いることが好ましい。
【００３２】第１のプローブを標識するエネルギードナー蛍光色素と、第２のプローブを標識するエネルギーアクセプタター蛍光色素とを、適当な距離（例えば８ｎｍ以下）に接近させることにより、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が可能となる。したがって、プローブにおけるそれぞれの蛍光色素の標識位置は、第１のプローブと第２のプローブとｍＲＮＡの３者がハイブリッド体を形成したときに、エネルギードナー蛍光色素とエネルギーアクセプタター蛍光色素の間でＦＲＥＴが生じうる距離になるようにすることが好ましい。前記２種類の蛍光色素間の好適な距離は、蛍光色素の種類や、ｍＲＮＡにおいてハイブリダイズする部位等により変化するが、一般的には、２つの蛍光色素は２０塩基以内の距離に位置することが好ましく、２〜４塩基以内の位置とすることがより好ましい。ＦＲＥＴを生じうるプローブを設計する場合においては、例えば、Lakowicz, J. R. "Principles of Fluorescence Spectroscopy" (1983), Plenum Press, New York を参照することができる。
【００３３】本発明において用いられるエネルギードナー蛍光色素としては、４，４−ジフロロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−８−プロピオン酸（4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-8-propionic acid）およびその誘導体（これらはBodipy 493/503シリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（５−イソチオシアネートおよび６−イソチオシアネートの混合物であってもよい）（tetramethylrhodamine-5-(and-6)-isothiocyanate）およびその誘導体（これらはＴＲＩＴＣシリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；及び４，４−ジフロロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid）およびその誘導体（これらはBodipy FLシリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）が挙げられる。
【００３４】また、本発明において用いられるエネルギーアクセプター蛍光色素としては、１，１’−ビス（ε−カルボキシペンチル）−３，３，３’，３’−テトラメチル インドジカルボシアニン−５，５’−二スルホン酸カリウム塩（1,1'-bis(ε-carboxypentyl)-3,3,3',3'-tetramethyl indodicarbocyanine-5,5'-disulfonate potassium salt)およびその誘導体（これらはＣｙ５シリーズとしてアマシャム ファルマシア バイオテク社から入手可能）；１，１’−ビス（ε−カルボキシペンチル）−３，３，３’，３’−テトラメチル インドカルボシアニン−５，５’−二スルホン酸カリウム塩（1,1'-bis(ε-carboxypentyl)-3,3,3',3'-tetramethyl indocarbocyanine-5,5'-disulfonate potassium salt)およびその誘導体（これらはＣｙ３シリーズとしてアマシャム ファルマシア バイオテク社から入手可能）；Ｘ−ローダミンイソチオシアネート（５−イソチオシアネートおよび６−イソチオシアネートの混合物であってもよい）（X-rhodamine-5-(and-6)-isothiocyanate）およびその誘導体（これらはＸＲＩＴＣシリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；６−（（（４，４−ジフロロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）スチリロキシ）アセチル）アミノヘキサン酸（6-(((4,4-difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-yl)styryloxy)acetyl)aminohexanoic acid）およびその誘導体（これらはBodipy 630/650シリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）；６−（（（４，４−ジフロロ−５−（２−ピローリル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）スチリロキシ）アセチル）アミノヘキサン酸（6-(((4,4-difluoro-5-(2-pyrrolyl) -4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene- 3-yl)styryloxy)acetyl)aminohexanoic acid）およびその誘導体（これらはBodipy 650/665シリーズとしてモレキュラープローブス社から入手可能）等が挙げられる。
【００３５】本発明においては、エネルギードナー蛍光色素としてはBodipy 493/503を用いることが好ましく、また、エネルギーアクセプター蛍光色素としてはＣｙ５またはＸＲＩＴＣを用いることが好ましい。
【００３６】本発明において、１本のプローブを構成するオリゴヌクレオチドの塩基数には特に厳しい制限はない。ただし、塩基数が極端に少ない場合、例えば１０塩基未満である場合は、十分安定なハイブリッド体を形成することが困難になる傾向にある。また、プローブの塩基数が５０塩基を超すほど多い場合には、プローブの合成が困難になるばかりか、プローブの安定性も低下し、ハイブリッド体形成に要する時間も長くなる傾向にある。
【００３７】プローブの塩基数は、用いる生細胞中のｍＲＮＡの濃度やハイブリダイゼーション時の温度等のハイブリダイゼーションの条件を考慮して決定する。一般に、プローブとｍＲＮＡとで形成されるハイブリッド体の融点は、プローブの塩基数が増えるにつれ上昇する。例えば、プローブの塩基数が１５程度である場合は、室温において十分に高い効率でハイブリッド体が形成される傾向にあるが、３７℃においてはハイブリッド体の形成率は必ずしも高くない。したがって、３７℃でハイブリッド体の検出を行うためには１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上の長さを有するプローブを使用することが望ましい【００３８】ただし、塩基数が多くなるほどｍＲＮＡとハイブリッド体を形成する速度が小さくなる傾向は、プローブの塩基数が１５〜２０の範囲でも同様である。例えば、室温において、２０塩基のプローブとｍＲＮＡのハイブリダイゼーションが終了するために必要な時間は、１５塩基のプローブを用いる場合に比べて数倍長い。
【００３９】これらの要件を総合的に判断すれば、使用するプローブの塩基数は、１０〜５０塩基であることが好ましく、１５〜２０塩基であることがさらに好ましい。
【００４０】プローブを設計する場合においては、上述したようにプローブの塩基数が重要となるが、これに加えて、プローブがｍＲＮＡのどの位置でハイブリダイズするかも重要となる。すなわち、一般に、ｍＲＮＡはそれ自体が複雑な立体構造をとっている分子であるため、用いるプローブがｍＲＮＡのある部位と相補的な塩基配列を有していても、その部位が分子内の他の部位と相互作用する場合には立体構造的にハイブリダイゼーションに障害が生じることがある。したがって、本発明において、プローブがハイブリダイズするｍＲＮＡの部位を適宜選択することが好ましい。
【００４１】ハイブリダイズする部位は、例えば以下に述べるような手法により決定することができる。まず、目的のｍＲＮＡの塩基配列をデータベース等から入手する。データベースが利用できない場合は公知の方法によりｍＲＮＡの塩基配列を決定する。そして、その情報をもとにｍＲＮＡの２次構造をシミュレーションする。これは、例えば、ＤＮＡｓｉｓ（日立ソフトエンジニアリング株式会社製）等のＲＮＡの２次構造予測用の市販のコンピュータプログラムを使用することにより可能である。得られた２次構造図を用いて立体構造的に障害のない部分を中心に、適当な数の塩基配列を選択し、その塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、それを蛍光標識してプローブとして用いる。
【００４２】コンピュータプログラムにより得られた２次構造図をもとに、ＦＲＥＴを生じうる一組のプローブを設計する場合においては、ｍＲＮＡの立体構造的に障害のない部分を中心として、例えば、３０〜４０塩基の部位を数箇所選択し、それぞれの部位をさらに２つに分割し（各１５〜２０塩基）、２分割された部位のそれぞれに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、それを蛍光標識して第１のプローブおよび第２のプローブとして用いることが好ましい。
【００４３】このようにして合成した数組のプローブの中から最適なプローブの組を選別するためには、例えば、以下のような方法を用いることができる。すなわち、上記の方法により合成した第１のプローブと第２のプローブの混合溶液を調製して蛍光スペクトルを測定する。次いで、目的のｍＲＮＡをこの混合溶液に添加して、蛍光スペクトルの変化を観察する。第１のプローブ、第２のプローブおよびｍＲＮＡでハイブリッド体が形成されれば２種類の蛍光色素間でＦＲＥＴが生じ、その結果、エネルギードナー色素の蛍光強度が減少し、エネルギーアクセプター色素の蛍光強度が増大した蛍光スペクトルが得られる。次に、第１のプローブと第２のプローブの何種類かの組について上記の作業を行い、蛍光スペクトルの変化量を比較して、変化量が大きいプローブの組を選択する。なお、上記の測定に使用するｍＲＮＡは、対応するｃＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを用いてインビトロ転写反応により合成することが可能である。
【００４４】また、ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションの効率を正確に評価するためには、それぞれのプローブとｍＲＮＡとを水溶液中で混合し反応させた後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により、ハイブリッド体と遊離したままのプローブを分離し、ハイブリッド体を構成するプローブのプローブ全体に対する比率を求めることが可能である。
【００４５】以上、蛍光標識プローブの最適化について詳述したが、上述したように蛍光標識プローブは本発明において用いられる標識剤の好ましい一形態である。本発明においては標識剤を調製した後に、これを特定のｍＲＮＡを発現した生細胞中に導入する。標識剤を生細胞中に導入する方法に関しては特に制限はなく、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法など公知の方法が適用可能である。本発明においては、一度に１００万個以上の生きた細胞に短時間で標識剤を導入する方法である、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。
【００４６】標識剤を生細胞に導入した後は、細胞中において当該標識剤によりｍＲＮＡを標識する。標識剤として蛍光標識プローブを用いた場合においては、当該プローブとｍＲＮＡをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションを行う条件は特に制限されないが、例えば、蛍光標識プローブを導入した生細胞を室温にて数分間保持すればよい。
【００４７】細胞内でｍＲＮＡを標識した後は、標識化ｍＲＮＡを検出することにより、該標識化ｍＲＮＡを含有する生細胞を同定し、同定した該細胞を選択的に分離する。本発明において、標識化ｍＲＮＡを検出する方法には特に制限はない。ただし、標識剤を導入した生細胞群はその全てがｍＲＮＡを発現しているとは限らず、また、ｍＲＮＡが存在したとしても標識剤を過剰量導入したような場合は、ｍＲＮＡと結合していない標識剤が細胞中に残存するため、検出時においては、標識化ｍＲＮＡと、ｍＲＮＡと結合していない遊離の標識剤とを、分離して検出することが必要である。
【００４８】標識化ｍＲＮＡと、ｍＲＮＡと結合していない遊離の標識剤とを、簡単且つ高感度に分離して検出する方法としては、エネルギードナー色素で標識された第１のプローブと、エネルギーアクセプター色素で標識された第２のプローブを組み合わせて使用する方法が好ましい。すなわち、これらのプローブを生細胞中に導入し、プローブとｍＲＮＡがハイブリダイズする条件で生細胞を保持した後に、第１のプローブのエネルギードナー蛍光色素の励起光を生細胞群に照射し、ＦＲＥＴに基づく第２のプローブのエネルギーアクセプター蛍光色素からの蛍光を観測することにより、簡単且つ高感度に分離検出が可能である。
【００４９】励起光の照射によって、ｍＲＮＡとハイブリダイズしている第１のプローブのエネルギードナー色素も、ｍＲＮＡとハイブリダイズしていない第１のプローブのエネルギードナー色素も同時に励起されるが、第１のプローブに隣接して第２プローブがハイブリダイズしている場合にのみＦＲＥＴが生じ、このときは第２のプローブのエネルギーアクセプター蛍光色素から蛍光が生じる。すなわち、エネルギーアクセプター蛍光色素からの蛍光が観察されたときは、第１のプローブと第２のプローブが隣接していることを意味するから、生細胞中でｍＲＮＡが標識化されたこと、すなわち、生細胞中にｍＲＮＡが発現していることがわかる。
【００５０】このようにして検出された特定のｍＲＮＡを発現した生細胞は選択的に分離されるが、この分離方法に関しては特に制限はない。本発明において、蛍光標識プローブを用いる場合においては、セルソーター（Fluorescence Activated CellSorter、ＦＡＣＳ）を用いて、特定のｍＲＮＡを発現している生細胞を検出するとともに、選択的に分離することが好ましい。
【００５１】セルソーターは、フローサイトメーターと細胞分取装置とを備えたものであり、特定物質を蛍光標識プローブで染色した個々の細胞に、細い流路の途中でレーザー光を照射することにより、散乱光（前方散乱光や側方散乱光）や蛍光のシグナル情報を個々の細胞ごとに測定し、その結果を、例えば度数分布（ドットプロット）として表示する機能を有しており、特定のシグナル情報を発する細胞にゲートをかけ所望の細胞を分取することができる。なお、以上のような方法はフローサイトメトリーと呼ばれている。
【００５２】本発明において、ＦＲＥＴを生じうる蛍光標識プローブを用いてセルソータにより特定のｍＲＮＡを発現した生細胞を選択的に分離する場合においては、例えば以下に述べる方法を適用することができる。すなわち、セルソーターにより個々の生細胞における、エネルギードナー蛍光色素（例えば、Bodipy 493/503）を励起するレーザーを照射したときの同蛍光色素の相対的蛍光強度、およびＦＲＥＴに基づくエネルギーアクセプター蛍光色素（例えば、Ｃｙ５）の相対的蛍光強度のシグナル情報を得て、例えば、前者を横軸、後者を縦軸としてドットプロットを行い、後者が高い値をとる細胞群を選択し、Ｒ２として領域指定する。さらに、測定対象の生細胞の細胞サイズに基づく前方散乱光と、生細胞の内部構造の複雑さに基づく側方散乱光のシグナル情報を得て、例えば、前者を横軸、後者を縦軸としてドットプロットを行い、測定対象の生細胞を表わしていると考えられる細胞群を選択し、Ｒ１として領域指定する。そして、Ｒ１およびＲ２の両選択条件を満たす（Ｒ１かつＲ２に属する）生細胞のみを分取できるようにセルソーターをセッティングすることにより、特定のｍＲＮＡが発現した細胞のみを選択的に分離することができる。
【００５３】以上で説明した方法により、様々な種類の生細胞が選択的分離の対象となる。また、様々な種類のｍＲＮＡが対象となる。抗原を異物として認識し活性化されたヘルパーＴ細胞から派生するＴＨ１とＴＨ２は、識別のための決定的な細胞表面抗原（マーカー）が存在せず、さらに、ＴＨ１およびＴＨ２が産生するサイトカイン（ＩＬ−２およびＩＬ−４）は細胞内や細胞膜付近に止まらず、細胞外液中に遊離してしまうため、ＴＨ１またはＴＨ２は、本発明の選択的分離方法の適用対象として最適である。すなわち、本発明の選択的分離方法は、サイトカインをコードするｍＲＮＡを保有する生細胞を含む生細胞群を対象とすることが好ましい。
【００５４】なかでも、インターロイキン−２（ＩＬ−２）をコードするｍＲＮＡを保有する生細胞を含む生細胞群を対象とし、配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有しエネルギードナー蛍光色素で標識された第１のプローブと、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列を有しエネルギーアクセプター蛍光色素で標識された第２のプローブを用い、これらのプローブのＦＲＥＴを利用して選択的分離を行うことが好ましい。
【００５５】配列表の配列番号９に記載の塩基配列は、ＩＬ−２を生じるｍＲＮＡの塩基配列における３４２〜３５６番目の塩基配列に相補的であり、配列表の配列番号１０に記載の塩基配列は、ＩＬ−２を生じるｍＲＮＡの塩基配列における３５７〜３７１番目の塩基配列に相補的である。エネルギードナー蛍光色素で標識された第１のプローブと、エネルギーアクセプター蛍光色素で標識された第２のプローブをｍＲＮＡの上記の位置で隣接させることにより、ＦＲＥＴに伴う検出を非常に高感度に行うことができる。
【００５６】また、インターロイキン−４（ＩＬ−４）をコードするｍＲＮＡを保有する生細胞を含む生細胞群を対象とし、配列表の配列番号１７に記載の塩基配列を有しエネルギードナー蛍光色素で標識された第１のプローブと、配列表の配列番号１８に記載の塩基配列を有しエネルギーアクセプター蛍光色素で標識された第２のプローブを用い、これらのプローブのＦＲＥＴを利用して選択的分離を行うことが好ましい。
【００５７】配列表の配列番号１７に記載の塩基配列は、ＩＬ−４を生じるｍＲＮＡの塩基配列における２６５〜２７９番目の塩基配列に相補的であり、配列表の配列番号１８に記載の塩基配列は、ＩＬ−４を生じるｍＲＮＡの塩基配列における２８０〜２９４番目の塩基配列に相補的である。エネルギードナー蛍光色素で標識された第１のプローブと、エネルギーアクセプター蛍光色素で標識された第２のプローブをｍＲＮＡの上記の位置で隣接させることにより、ＦＲＥＴに伴う検出を非常に高感度に行うことができる。
【００５８】
【実施例】以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５９】（１） IL-2 mRNAと相補的なオリゴヌクレオチドの蛍光色素標識体の調製IL-2 mRNAおよびIL-4 mRNAの全塩基配列から任意に30塩基の連続した配列を5箇所選び、これらと相補的な配列を有し、Bodipy493/503（エネルギードナー蛍光色素）、Cy5（エネルギーアクセプター蛍光色素）、もしくはXRITC（エネルギーアクセプター蛍光色素）で蛍光標識されたオリゴDNAプローブ（１５ｍｅｒ）を設計した。
【００６０】DNA/RNAシンセサイザー（Perkin Elmer:Model 394もしくはPerceptive:Model18909）を用いて、βシアノエチルアミダイト法により、設計したプローブの核酸合成を行った。なお、IL-2 mRNAの全塩基配列とオリゴDNAプローブの塩基配列を図１に示し、IL-4 mRNAの全塩基配列とオリゴDNAプローブの塩基配列を図２に示す。また、設計したIL-2に関する１０種類のオリゴＤＮＡプローブの塩基配列（配列番号１〜１０）と、該オリゴＤＮＡプローブがハイブリダイズするIL-2 mRNAの塩基番号（ハイブリダイズ位置）を以下の表１に示し、IL-4に関する１０種類のオリゴＤＮＡプローブの塩基配列（配列番号１１〜２０）と、該オリゴＤＮＡプローブがハイブリダイズするIL-4 mRNAの塩基番号（ハイブリダイズ位置）を以下の表２に示す。
【００６１】
【表１】

【００６２】
【表２】

【００６３】なお、以下に述べる（４Ａ）においては、上記配列番号１〜１０の塩基配列の５’末端をBodipy493/503で標識して得られたプローブを用い、（８）においては、上記配列番号１〜１０の塩基配列を蛍光色素で標識せずにプローブとして用いた。（９）においては、上記配列番号１、３、５、７、９の５’末端をBodipy493/503で標識したプローブと、上記配列番号２、４、６、８、１０の３’末端から４−５塩基間にＸＲＩＴＣで標識したプローブを用いた。また、（１１）においては、上記配列番号１、３、５、７、９の５’末端をBodipy493/503で標識したプローブと、上記配列番号２、４、６、８、１０の３’末端から４−５塩基間にＣｙ５で標識したプローブを用いた。また、Bodipy493/503、ＸＲＩＴＣ、Ｃｙ５による標識方法は、以下に述べる（ａ）〜（ｃ）の方法に従った。
【００６４】本発明においては、エネルギードナー蛍光色素で標識したオリゴＤＮＡプローブをドナープローブと略称し、エネルギーアクセプター蛍光色素で標識したオリゴＤＮＡプローブをアクセプタープローブと略称する場合がある。また、配列番号１の塩基配列をエネルギードナー蛍光色素で標識したプローブは、配列番号１がIL-2 mRNAの２２８〜２４２番目の塩基配列に相補的であることから、IL-2 228-242(D)と表記する場合がある（Ｄはドナーを意味する）。また、配列番号２の塩基配列をエネルギーアクセプター蛍光色素で標識したプローブは、配列番号２がIL-2 mRNAの２４３〜２５７番目の塩基配列に相補的であることから、IL-2 243-257(A)と表記する場合がある（Ａはアクセプターを意味する）。なお、蛍光色素で標識しない場合は、例えば、単にIL-2 228-242と表記する。したがって、以下に述べる（９）および（１１）においては、用いるプローブは以下の表３に示すプローブ名で表わすことができる。
【００６５】
【表３】

【００６６】ＩＬ−４用プローブも上記と同様に表記する場合がある。例えば、以下に述べる（３Ｂ）においては、用いるプローブは以下の表４に示すプローブ名で表わすことができる。
【００６７】
【表４】

【００６８】（ａ）ドナープローブ（Bodipy493/503標識）の作製2.5mgのNHSS(N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)を30μlの滅菌水に溶かしたものと、5mgのEDAC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)を50μlの滅菌水に溶かしたものと1mgのBodipy493/503プロピオン酸を50μlのDMFに溶かしたものを混合し、室温で30分間反応させた。
【００６９】一方、5'末端アミノ化試薬６-（トリフルオロアセチルアミノ）ヘキシル-（2-シアノエチル）-（N,N-ジイソプロピル）-ホスホロアミダイトを用いて上記塩基配列を有するオリゴＤＮＡの5'末端にヘキシルアミノ基が導入したもの（凍結乾燥品）を200μlの0.5 M Na2HCO3/NaH2CO3緩衝液（pH9.3）に溶解させた。
【００７０】これらを混合して遮光条件下で一晩反応させ、反応液をゲル濾過し、未反応の色素を除去した後、CAPCELL PACK18（資生堂、カラムサイズは6mm内径×250mm全長）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（流速；1ml/分、カラム温度；40℃、移動相組成；5 mM TEAA入りのCH3CNの5%溶液Aと40%溶液Bを用意しBの比率を20分の間に30-80%の濃度勾配をかけた）により、260nmと493nmに吸収をもつ反応生成物を分取し、凍結乾燥した。
【００７１】（ｂ）アクセプタープローブ（Ｃｙ５標識）の作製１チューブ分のCy5色素（Amersham, Fluorolink Cat. No. PA25001）を100μlの滅菌水に溶解した。一方、Uni-Link AminoModifier (Clontech社製)を用いて上記塩基配列を有するオリゴＤＮＡの３’末端から４と５塩基の間にヘキシルアミノ基を導入したもの（凍結乾燥品）を200μlの Na2HCO3/NaH2CO3緩衝液（0.5M、pH9.3）に溶解させた。そして、これらを混合し、遮光して一晩反応させた。
【００７２】反応液をゲル濾過し、未反応の色素を除去した後、CAPCELL PACK18（資生堂、カラムサイズは6mm内径×250mm全長）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（流速；1ml/分、カラム温度；40℃、移動相組成；5 mM TEAA入りのCH3CNの5%溶液Aと40%溶液Bを用意しBの比率を20分の間に15-60%の濃度勾配をかけた）により、260nmに吸収をもつ成分を分取し、その吸収スペクトルを220-700nmの範囲で測定し、650-700nmにおけるCy5の最大吸収を確認後、凍結乾燥した。
【００７３】（ｃ）アクセプタープローブ（ＸＲＩＴＣ標識）の作製100μlのXRITC色素溶液（溶媒；100% DMSO、Perkin Elmer, ROX-NHS）を、（ｂ）と同様にヘキシルアミノ基が導入された上記塩基配列を有するオリゴＤＮＡと反応させた。反応生成物を逆相高速液体クロマトグラフィーにかけ、260nmに吸収をもつ成分を分取し、その吸収スペクトルを220-650nmの範囲で測定し、550-600nmにおけるXRITCの最大吸収を確認後、凍結乾燥した。
【００７４】（２Ａ）ヒトIL-2 RNAの試験管内合成ヒトIL-2 mRNAと同等の塩基配列を有するヒトIL-2 RNAを取得するために、ヒトIL-2 cDNAを有するプラスミドDNA、pTCGF-II（ATCC#39673）より制限酵素pstIで切り出したIL-2 cDNA断片を、RNA合成用ベクターpBluescript KS(+)のpst I消化部位にT3プロモーター下流に同cDNAが位置するようにライゲーションキット（タカラ社製）を用いて連結した。得られた組換体プラスミドを大腸菌JM109株のコンピテントセル（タカラ社製）に導入し、得られた同大腸菌の形質転換体を培養し、100 mlの同培養液からPlasmid Midi Kit（QIAGEN社製）を用いて46.2μgのプラスミドDNAを抽出・精製した。
【００７５】同組換体プラスミドを制限酵素Sma I消化により線状化し、同プラスミド溶液中に存在する蛋白質をproteinase Kで分解後、フェノール／クロロホルムを用いて変性・除去した。この精製遺伝子断片（0.66 μg）を鋳型とするRNAを合成するために、インビトロ転写反応キット（Megascript T3 Kits、Ambion社）を用いてヒトIL-2 mRNAを構成する各塩基（A（アデニン）、C（シトシン）、G（グアニン）、U（ウラシル））の組成（A：:C：G：U＝35：18：14：32％）に基づいて、それぞれ105、54、42、96 mM（終濃度）のA、C、G、Uを、T3 RNAポリメラーゼとともに前記鋳型に添加し、 RNAポリメラーゼ反応溶液を調製した。37℃で6時間ポリメラーゼ反応を行い、ヒトIL-2 RNAを合成した。反応終了後、DNase I（Megascript T3 Kits、Ambion社製）で鋳型DNAを分解し、転写反応溶液中の蛋白質をフェノール／クロロホルムを用いて変性・除去した。得られたRNA溶液に等容のイソプロパノールを加え、遠心（14krpm、7分間）による沈殿物としてヒトIL-2RNAを回収し、未反応の酵素反応基質である各ヌクレオチド等を除去した。70%エタノールで１回すすいだヒトIL-2 RNA沈殿物（139 μg）をRNase を含有しない水（Megascript T3 Kits、Ambion社製）で溶かし、5 μg/μlのヒトIL-2 RNA溶液を調製し、以降のハイブリダイゼーション実験に使用した。
【００７６】（２Ｂ）ヒトIL-4 RNAの試験管内合成次に、ヒトIL-4 mRNAと同等の塩基配列を有するIL-4 RNAを取得するために、ヒトIL-4 cDNAを有するプラスミドDNA、pcD-hIL-4（ATCC#57593）より制限酵素BamHIおよびXho Iで切り出したIL-4 cDNA断片を、RNA合成用ベクターpBluescriptKS(+)のBamHIおよびXho I消化部位にT3プロモーター下流に同cDNAが位置するようにライゲーションキット（タカラ社製）を用いて連結した。得られた組換体プラスミドを大腸菌JM109株のコンピテントセル（タカラ社製）に導入し、得られた同大腸菌の形質転換体を培養し、100 mlの同培養液からPlasmid Midi Kit（QIAGEN社製）を用いて152 μgのプラスミドDNAを抽出・精製した。
【００７７】同組換体プラスミドを制限酵素Sma I消化により線状化し、同プラスミド溶液中に存在する蛋白質をproteinase Kで分解後、フェノール・クロロホルムを用いて変性・除去した。この精製遺伝子断片（0.49 μg）を鋳型とするRNAを合成するために、インビトロ転写反応キット（Megascript T7 Kits、Ambion社）を用いてヒトIL-4 mRNAを構成する各塩基の組成（A：:C：G：U＝29：24：21：26％）に基づいてA、C、G、Uをそれぞれ87、72、63、78 mM（終濃度）をT7 RNAポリメラーゼとともに前記鋳型に添加し、 RNAポリメラーゼ反応溶液を調製した。37℃で6時間ポリメラーゼ反応を行い、ヒトIL-4 RNAを合成した。
【００７８】反応終了後、DNase I（同キット、Ambion社）で鋳型DNAを分解し、転写反応溶液中の蛋白質をフェノール・クロロホルムを用いて変性・除去した。得られたRNA溶液にイソプロパノールを２倍容加え、遠心（14krpm、7分間）による沈殿物としてヒトIL-4 RNAを回収し、未反応の酵素反応基質である各ヌクレオチド等を除去した。70%エタノールで１回すすいだRNA沈殿物（183 μg）をRNase free water（同キット、Ambion社）で溶かし、5 μg/μlのRNA溶液を調製し、以降のハイブリダイゼーション実験に使用した。
【００７９】（３Ａ）蛍光標識プローブとヒトIL-2 RNAのハイブリダイゼーションによる蛍光スペクトル変化ドナープローブとアクセプタープローブが隣接してハイブリダイズすることにともなう蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に基づく蛍光スペクトルの変化を測定するために、300 nM（終濃度）のBodipy493/503標識ドナープローブおよびXRITC標識アクセプタープローブの組とヒトIL-2 RNAとを混合し、100μlの1×SSC（150 mM 塩化ナトリウム, 17 mM クエン酸ナトリウム, pH 7.0）溶液とし、室温で１５分間放置した後に蛍光スペクトルを測定した。ドナープローブとアクセプタープローブの組としては、IL-2 228-242(D)とIL-2 243-257(A)、IL-2 198-212(D)とIL-2 213-227(A)、IL-2 77-91(D)とIL-2 92-106(A)、IL-2 287-301(D)とIL-2302-316(A)、IL-2 342-356(D)とIL-2 357-371(A)を用いた。また、対照として、300 nMの上記プローブ単独の蛍光スペクトルを同様に測定した。なお、蛍光スペクトル測定条件は以下の通りであった。
蛍光分光光度計；F4500（日立）
励起波長；480nm蛍光測定波長；500-750nm温度；室温【００８０】その結果、全てにおいてヒトIL-2 RNAを加えると、エネルギードナー蛍光色素を励起したときのドナー色素の蛍光強度はFRETにより減少し、エネルギーアクセプター色素の蛍光波長領域(580-650nm)に顕著な蛍光スペクトルの変化（蛍光強度が増大）が認められた（図３〜７）。図３、４、５、６、７には、それぞれIL-2 228-242(D)とIL-2 243-257(A)の組、IL-2 198-212(D)とIL-2 213-227(A)の組、IL-2 77-91(D)とIL-2 92-106(A)の組、IL-2 287-301(D)とIL-2 302-316(A)の組、IL-2 342-356(D)とIL-2 357-371(A)の組を用いたときの蛍光スペクトルを示す。図２〜６を比較することによりわかるように、蛍光スペクトルはプローブの各組の間で格差が見られ、IL-2 342-356(D)とIL-2 357-371(A)の組を用いたときが最も顕著であった。
【００８１】（３Ｂ）蛍光標識プローブとヒトIL-4 RNAのハイブリダイゼーションによる蛍光スペクトル変化ドナープローブとアクセプタープローブが隣接してハイブリダイズすることにともなう蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に基づく蛍光スペクトルの変化を測定するために、300 nM（終濃度）のBodipy493/503標識ドナープローブおよびCy5標識アクセプタープローブの組とヒトIL-2 RNAとを混合し、100μlの1×SSC（150mM 塩化ナトリウム, 17 mM クエン酸ナトリウム, pH 7.0）溶液とし、室温で１５分間放置した後に蛍光スペクトルを測定した。ドナープローブとアクセプタープローブの組としては、IL-4 70-84(D)とIL-4 85-99(A)、IL-4 119-133(D)とIL-4 134-148(A)、IL-4 176-190(D)とIL-4 191-205(A)、IL-4 265-279(D)とIL-4 280-294(A)、IL-4 376-390(D)とIL-4 391-405(A)を用いた。また、対照として、300 nMの上記プローブ単独の蛍光スペクトルを同様に測定した。なお、蛍光スペクトル測定条件は以下の通りであった。
蛍光分光光度計；F4500（日立）
励起波長；480nm蛍光測定波長；500-750nm温度；室温【００８２】その結果、全てにおいてヒトIL-2 RNAを加えると、エネルギードナー蛍光色素を励起したときのドナー色素の蛍光強度はFRETにより減少し、エネルギーアクセプター色素の蛍光波長領域(650-700nm)に顕著な蛍光スペクトルの変化（蛍光強度が増大）が認められた（図８〜１２）。図８、９、１０、１１、１２には、それぞれIL-4 70-84(D)とIL-4 85-99(A)の組、IL-4 119-133(D)とIL-4 134-148(A)の組、IL-4 176-190(D)とIL-4 191-205(A)の組、IL-4 265-279(D)とIL-4 280-294(A)の組、IL-4 376-390(D)とIL-4 391-405(A)の組を用いたときの蛍光スペクトルを示す。図８〜１２を比較することによりわかるように、蛍光スペクトルはプローブの各組の間で格差が見られ、IL-4 265-279(D)とIL-4 280-294(A)の組を用いたときが最も顕著であった。この測定結果をBodipy493-503を励起したときのCy5の蛍光強度と、Bodipy493-503の蛍光強度の比（Cy5の蛍光強度／Bodipy493-503の蛍光強度）を百分率（概算値）で表すと以下の表５の通りとなった。
【００８３】
【表５】

【００８４】（４Ａ）プローブとヒトIL-2 RNAとのHPLCによるハイブリダイゼーション効率の測定上記配列番号１〜１０の塩基配列を有するオリゴＤＮＡをBodipy493/503で標識したドナープローブの各々3 pmolを、等モルの（２Ａ）で合成したヒトIL-2 RNAと混合し、10μlの1×SSC（150 mM 塩化ナトリウム, 17 mM クエン酸ナトリウム, pH 7.0）溶液とし、室温で１５分間放置した。その後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて、ヒトIL-2 RNAと上記プローブとからなるハイブリッド体を、遊離のプローブから保持時間の差異を利用して以下の条件で分離した（同条件下での保持時間は遊離のプローブが約４〜５分、ハイブリッド体が7.5分前後である）。
カラム：TSKgel DEAE-NPR（東ソー、内径4.6mm×全長35mm）
カラム流速：1ml/分カラム温度：25℃移動相：A液；20 mM Tris-HCl (pH9.0)移動相：B液；0.5 M NaCl、20 mM Tris-HCl (pH9.0)【００８５】上記A液に対するB液の比率について、10分の間に25-100%（0.125-0.5 M NaClに相当）の濃度勾配をかけ、溶出される成分について紫外吸収（260nm）による核酸を示すピークと励起波長475nm／蛍光測定波長515nmによる標識色素Bodipy493/503に関するピークの検出を同時に行い、検出された全蛍光ピーク面積の中でハイブリッド体のピーク面積が占める割合(％)を求め、ハイブリダイゼーション効率の指標とした。
【００８６】図１３にIL-2 342-356(D)を用いた場合のＨＰＬＣクロマトグラムを示し、図１４にIL-2 357-371(D) を用いた場合のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。また、各プローブに関するハイブリッド体のピーク面積が占める割合（％）をまとめて表６に示す。
【００８７】
【表６】

【００８８】表６に示した結果から、IL-2 213-227(D)、IL-2 342-356(D)、そしてIL-2 357-371(D)が個別で比較的効率よく標的RNAにハイブリダイズするプローブであることが判明した。（３Ａ）において、IL-2 342-356(D)、IL-2 357-371(A)はそれぞれドナープローブ、アクセプタープローブとしてハイブリダイゼーションの効率を司る蛍光スペクトル変化が最も顕著であったことから、（３Ａ）と（４Ａ）の両実験結果は整合性がとれていると考えられる。
【００８９】（４Ｂ）プローブとヒトIL-4 RNAとのHPLCによるハイブリダイゼーション効率の測定上記配列番号１１〜２０の塩基配列を有するオリゴＤＮＡをBodipy493/503で標識したドナープローブの各々3 pmolを、等モルの（２Ｂ）で合成したヒトIL-4RNAと混合し、10μlの1×SSC（150 mM 塩化ナトリウム, 17 mM クエン酸ナトリウム, pH 7.0）溶液とし、室温で１５分間放置した。その後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて、ヒトIL-4 RNAと上記プローブとからなるハイブリッド体を、遊離のプローブから保持時間の差異を利用して分離した（同条件下での保持時間は遊離のプローブが約４〜５分、ハイブリッド体が7.5分前後である）。分離の条件およびハイブリダイゼーション効率の測定方法は上記（４Ａ）と同様であった。
【００９０】図１５、１６、１７、１８に、IL-4 119-133(D)、IL-4 134-148(D)、IL-4 265-279(D)、IL-4 280-294(D)を用いた場合のＨＰＬＣクロマトグラムをそれぞれ示す。また、各プローブに関するハイブリッド体のピーク面積が占める割合（％）をまとめて表７に示す。
【００９１】
【表７】

【００９２】表７に示した結果から、IL-4 265-279(D)およびIL-4 280-294(D)が個別で比較的効率よく標的RNAにハイブリダイズするプローブであることが判明した。（３Ｂ）において、IL-4 265-279(D)、IL-4 280-294(A)はそれぞれドナープローブ、アクセプタープローブとしてハイブリダイゼーションの効率を司る蛍光スペクトル変化が最も顕著であったことから、（３Ｂ）と（４Ｂ）の両実験結果は整合性がとれていると考えられる。
【００９３】（５）ヒトＴ細胞白血病株細胞Jurkat E6-1におけるIL-2遺伝子発現の誘導細胞密度が1×106/mlのJurkat E6-1細胞に0.5 mg/ml（終濃度）の抗CD3抗体（イムノテック社製）、同濃度の抗CD28抗体（イムノテック社製）、10 nM PMA（シグマ社製）を添加して３日間（72時間）37℃、5% 二酸化炭素存在下で培養した。
【００９４】（６） IL-2蛋白分子の産生量の測定（５）のIL-2遺伝子発現誘導処理に依存して多くのIL-2分子が産生され培養上清中に放出されれば、その細胞内ではIL-2 mRNAが活発に合成されたものと判断される。そこでIL-2遺伝子発現の確認のために、（５）の処理が施されたJurkatE6-1細胞（以下、場合によりIL-2発現誘導細胞と呼ぶ）の培養上清を採取し、上清中のIL-2 (pg/ml/107 cells)をヒトインターロイキン-2測定キットを利用した以下に述べるELISAサンドイッチ法により定量し、未処理細胞（以下、場合によりIL-2発現未誘導細胞と呼ぶ）の場合と比較した。
【００９５】抗ヒトIL-2モノクローナル抗体が固相化されている96ウェルプレート（抗体プレート）の使用するウェルを洗浄液で２回洗浄し、使用する各ウェルに150 μlの緩衝液を加えた。各ウェルに50 μlのスタンダードIL-2（0-1,600 pg/ml、前記測定キットの付属品）および上記培養上清を加え、37℃で一晩インキュベートした。ウェル内の反応液を除去し、洗浄液で３回洗浄した。第一抗体（抗ヒトIL-2ウサギ血清）溶液を100 μl/ウェルになるように加え、室温で２時間インキュベートした。次いで、ウェル内の抗体液を除去し、洗浄液で３回洗浄した。
【００９６】第二抗体（ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体）溶液を100 μl/ウェルになるように加え、室温で２時間インキュベートした。ウェル内の抗体液を除去し、洗浄液で３回洗浄後、各ウェルを充分乾燥させた。ペルオキシダーゼ基質（o-フェニレンジアミン）の0.015%過酸化水素水溶液を100 μl/ウェルになるように加え、室温で10-20分間反応させた。反応停止液（1 N H2SO4）を100 μl各ウェルに加え、反応を停止させ、各ウェルの492 nmにおける吸光度をマイクロプレート用吸光度計で測定した。スタンダードIL-2の吸光度値から作成される検量線を基に、培養上清中のIL-2を定量した。
【００９７】その結果、IL-2発現誘導細胞は6157±168 (pg/ml/107 cells)のIL-2分子が培養液中に検出されたのに対して、IL-2発現未誘導細胞の上清中のIL-2は検出限界以下（＜0.1 pg/ml/107 cells）であった。
【００９８】（７）IL-2遺伝子発現量の測定本実験には、スタンダードとしてIL-2 RNA、測定試料としてJurkat E6-1細胞の全RNA、さらにIL-2 RNAもしくはmRNA検出用のプローブとしてIL-2リボプローブ（ジゴキシゲニン標識体）が実験材料として必要であったため、以下の（ａ）〜（ｃ）のようにしてこれらを取得した。
【００９９】（ａ）スタンダードIL-2 RNAスタンダードIL-2 RNAは、（２Ａ）で合成されたヒトIL-2 RNA（1 μg/μl）を1×dilution buffer（RNase を含有しない滅菌蒸留水:20×SSC:ホルムアミド= 5:3:1）で（104倍、105倍、106倍、107倍に）順次希釈された後に、同希釈RNA溶液を68℃で10分間加熱後急冷されたものをブロッテイングに用いた。
【０１００】（ｂ）Jurkat E6-1細胞の全RNAJurkat E6-1細胞の全RNAは、RNeasy Kit（QIAGEN社製）を利用して抽出した。（５）の条件下で0、24、48、72、96時間IL-2発現誘導処理を施された細胞（0.8-1.2×107個）を1,500rpmで5分間の遠心により沈殿として回収し、10μlのβメルカプトエタノールを加えた1,000μlのホモジナイゼーションbufferに細胞を懸濁し、18-gaugeの注射針で吸引／噴出しを繰り返し、充分に変性させた。同ホモジネートに1,000μlの70%エタノールを加え、RNA吸着用カラムに加え、4,000×gで5分間遠心し、さらに洗浄用bufferを加え、同様に遠心しカラムを洗浄した。
【０１０１】カラムにRNase を含有しない滅菌蒸留水を加え、吸着RNAを溶出させた。その溶出RNA溶液に1/10倍容の4 Mの酢酸ナトリウムと１倍容のイソプロパノールを加え、RNAは15,000×gで15分間遠心し沈殿物として回収した。同RNAはRNase を含有しない滅菌蒸留水に溶解した後、等容の2×dilution buffer（RNase を含有しない滅菌蒸留水:20×SSC:ホルムアミド = 1:6:2）で希釈し、68℃で10分間加熱後急冷した。
【０１０２】（ｃ）ジゴキシゲニン（DIG）標識IL-2リボプローブDIG標識IL-2リボプローブは、DIG RNA Labeling Kit（Boehringer Mannheim社製）を利用して合成した。EcoRI消化により完全に線状化された10 μgのヒトIL-2 cDNA組み換えプラスミド（pTCGF#2）DNAをフェノール／クロロホルム抽出による蛋白質変性除去後にエタノール沈殿により精製し、リボプローブ合成のための鋳型とした。同鋳型DNA（5 μg）と1.8 mM ATP、0.9 mM CTP、0.7 mM GTP、1.1mM UTP、0.58 mM UTP（DIG標識体）をT7 RNA ポリメラーゼ存在下で混和し、37℃で2時間インキュベートした後、DNase I溶液を加え10分間反応させ、鋳型DNAを破壊した。同反応溶液に1/10倍容の5 Mの酢酸ナトリウムと１倍容のイソプロパノールを加え、合成RNAは15,000×gで15分間遠心し沈殿物として回収した。同RNAはRNase を含有しない滅菌蒸留水に溶解した。
【０１０３】（ｄ）IL-2遺伝子発現量の測定上記（ａ）〜（ｃ）で取得した材料を用いてIL-2遺伝子発現量を測定した。細胞全RNA試料溶液をスタンダードIL-2 RNA溶液とともにナイロン膜にドットし、5×SSCで２回洗った後、ナイロン膜上のRNAをUV-クロスリンカー（Biorad社製）により固定した。同ナイロン膜をPrehybridization buffer（5×SSC、5% SDS、50 mMリン酸ナトリウム (pH7.0)、 50% ホルムアミド、2% Blocking Reagent (Boehringer Mannheim社製)、1% Ｎ−ラウロイルサルコシネート(N-lauroyl sarcosinate))とともにハイブリバッグ（井内社製、耐湯バッグL）に封入し、68℃で1時間プレハイブリダイゼーションを行った。
【０１０４】終濃度100 ng/mlになるようにDIG標識IL-2リボプローブをPrehybridization bufferで希釈し、10分間煮沸後急冷し、ハイブリダイゼーション液とした。ハイブリパック内のプレハイブリダイゼーション液をハイブリダイゼーション液と交換し、68℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ナイロン膜を2×Washing solution（2×SSC、0.1% SDS）で各5分間２回洗った後、0.2×Washing solution（0.2×SSC、0.1% SDS）で68℃で各15分間２回洗った。Buffer I（100 mM マレイン酸、150 mM NaCl(pH7.5)）による1分間の洗いの後、ナイロン膜をBuffer II(Blocking Reagent (Boehringer Mannheim社製)をbuffer Iで1%溶液としたもの）で30分間ブロッキングを行った。
【０１０５】DIG標識RNAハイブリッドの化学発光検出は、DIG Luminescent Detection Kit（Boehringer Mannheim社製）を使用して行った。アルカリフォスファターゼ標識抗DIG抗体のBuffer II溶液（150 mU/ml）でナイロン膜を室温で1時間処理後、Buffer Iで各15分間２回洗い、CSPD（disodium 3- (4-methoxyspiro[1,2-dioxetane-3,2'- (5'-chloro) tricyclo [3.3.1.13, 7] decan] -4-yl) phenylphosphate）をBuffer III（0.1 M Tris, pH 9.7, 0.1 M NaCl, 0.05 M MgCl2）で希釈して得られた250 μMの基質溶液とともにバッグ（LIFETECHNOLOGIES社製、Photogene development folder）に封入した。標識RNAに基づき発せられたフォトン数をアルガス50（浜松ホトニクス社製）で計測し、スタンダードIL-2 RNAのフォトン数から検量線を作成し、それを基にして細胞の全RNA中のIL-2 mRNAを定量した。得られたIL-2 mRNA量（モル）と全RNA抽出に用いた細胞数から単一細胞あたり大体のIL-2 mRNA分子数を求めた（図１９）。
【０１０６】図１９に示すように、0、24、48、72、96時間IL-2発現誘導処理を施された細胞の細胞内IL-2 mRNA分子数（×104）は、＜0.29×10-4、0.76±0.17、1.11±0.40、1.22±0.67、1.20±0.28であり、72時間（３日間）処理された細胞において最もIL-2 mRNAが多く存在することが判明した。また、上記各時間処理した細胞の培養液中のIL-2含量（pg/ml/107 cells）は順に＜0.32、1032±25、2433±533、2688±194、2531±283であることから、IL-2の遺伝子発現の活発化にともない、より多くのIL-2分子が分泌されることが示唆された。
【０１０７】（８）個々のプローブとIL-2遺伝子発現が誘導されたヒトＴ細胞白血病株細胞Jurkat E6-1細胞のIL-2 mRNAとの細胞内ハイブリダイゼーション前記（５）と同様に抗CD3抗体、抗CD28抗体、PMAで３日間処理することによってIL-2遺伝子発現を誘導させたIL-2発現誘導細胞と、IL-2発現未誘導細胞について、細胞内のIL-2 mRNAと個々のIL-2プローブとのハイブリダイゼーションを以下のようなIST（In Situ Transcription）法により検出した。
【０１０８】各Jurkat E6-1細胞（5×105 cells/ml）をPBS(-)で３回洗い、1 mlのPBS(-)で懸濁し、12mmのカバーガラス（poly-L-lysineが底面にコート）上にマウントし、単層細胞を調製した。0.5% Triton-X100溶液に細胞を90秒間室温で曝すことによって細胞膜に物質透過性を付与した。細胞を速やかにPBS(-)で洗い、10 μM（最終濃度）の上記表１に示した配列番号１〜１０の塩基配列を有するプローブ（非色素標識体）、オリゴｄＴ（デオキシチミジンオリゴヌクレオチド、非色素標識体）またはオリゴｄＡ（デオキシアデニンオリゴヌクレオチド、非色素標識体）を添加し、1時間室温でインキュベートした。細胞を速やかにPBS(-)で洗い、4%パラホルムアルデヒド溶液で室温で15分間固定した。
【０１０９】細胞を1×SSCで３回洗い、0.35 mMのDIG（ジゴキシゲニン）標識dUTPを含む1mM デオキシリボヌクレオチド溶液（Boehringer Mannheim社製）を1 u/μlの逆転写酵素（東洋紡社製）とともに細胞に加え、30℃で２時間インキュベートした。細胞を1×SSCで３回洗い、Blocking buffer（Blocking Reagent(Boehringer Mannheim社製) を1（w/v）%になるようにマレイン酸緩衝液で溶解したもの）で室温で１時間処理した。細胞をマレイン酸緩衝液で３回洗い、FITC（Fluorescein-isothiocyanate）標識抗DIG抗体（Blocking bufferで1 μg/mlになるように溶解したもの）を添加し、30分間室温でインキュベートした。カバーガラスをPBS(-)で３回洗い、蛍光顕微鏡観察し、１視野あたりの総蛍光強度（相対値）を測定した。
【０１１０】そのときに得られた蛍光顕微鏡写真を図２０および２１に示す。図２０は、固定された状態のIL-2発現誘導細胞およびIL-2発現未誘導細胞の細胞中の全てのｍＲＮＡとオリゴｄＴとの間で形成される複合体を蛍光検出した蛍光顕微鏡写真であり、オリゴｄＴの代わりにオリゴｄＡを細胞に添加した場合や、複合体を蛍光標識するのに必要なＤＩＧ標識ｄＵＴＰと逆転写酵素の両者を添加しなかった場合の対照実験結果も示している。図２１は、固定された状態のIL-2発現誘導細胞およびIL-2発現未誘導細胞の細胞中のIL-2 mRNAと上記プローブ（非蛍光標識体）との間で形成されるハイブリッド体を蛍光検出した蛍光顕微鏡写真である。なお、図２１においては、IL-2発現誘導細胞およびIL-2発現未誘導細胞のそれぞれにおいて、各プローブの蛍光像を２枚表示してある。また、蛍光強度と細胞数から、１細胞あたりの蛍光強度（平均値±SE）を算出し、オリゴｄＴを細胞に添加したときの蛍光強度を基準（100%）に各プローブによる値を規格化し、図２２に示す。
【０１１１】その結果、IL-2 342-356およびIL-2 357-371が個別で最も効率良く細胞内IL-2mRNAとハイブリダイズすることが示された。これらはIL-2 mRNA分子内の連続した30塩基配列に相補的であることから、それぞれがエネルギードナー蛍光色素、エネルギーアクセプター蛍光色素で標識されれば、細胞内ハイブリダイゼーションにともなうFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）に基づく蛍光を特異的に検出することが可能となることが示唆された。
【０１１２】（９）ドナープローブ、アクセプタープローブとIL-2発現誘導細胞におけるIL-2mRNAとの細胞内ハイブリダイゼーション（ISH法）（８）のIST法による実験結果において、蛍光顕微鏡視野全体の細胞にほぼ均一にプローブが導入されていたことに着目し、このプローブ導入方法をドナーおよびアクセプターの蛍光標識プローブにも応用し、これらのプローブと細胞内IL-2 mRNAとのハイブリダイゼーションをFRETに基づく蛍光として測定し、各組のプローブについて比較検討した。この方法はIST法からヒントを得て発展させたことからISH（In Situ Hybridization）法と呼ぶ。
【０１１３】（８）で記した方法によって細胞膜表面に物質透過性を付与されたIL-2発現誘導細胞およびIL-2発現未誘導細胞に、Bodipy493/503で標識したドナープローブおよびＸＲＩＴＣ標識したアクセプタープローブの溶液を2 μＭ（最終濃度）添加し、１時間室温でインキュベートした。ドナープローブとアクセプタープローブの組としては、IL-2 228-242(D)とIL-2 243-257(A)、IL-2 198-212(D)とIL-2213-227(A)、IL-2 77-91(D)とIL-2 92-106(A)、IL-2 287-301(D)とIL-2 302-316(A)、IL-2 342-356(D)とIL-2 357-371(A)を用いた。蛍光標識プローブをＰＢＳ（−）で洗い除き、４％パラホルムアルデヒド溶液で１５分間室温で細胞を固定した。カバーガラスをＰＢＳ（−）で３回洗って蛍光顕微鏡観察を行い、細胞にＡ（エネルギーアクセプター色素）の励起光を照射したときに細胞から発せられるＡの蛍光（以下、場合によりＡ／Ａ像と呼ぶ）、細胞にＤ（エネルギードナー色素）の励起光を照射したときに細胞から発せられるＤの蛍光（以下、場合によりＤ／Ｄ像と呼ぶ）、細胞にＤの励起光を照射したときに蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により細胞から発せられるＡの蛍光（以下、場合によりＤ／Ａ像と呼ぶ）を得た。この結果、IL-2 342-356(D)をドナープローブ、IL-2 357-371(A)をアクセプタープローブとしたときに最大レベルのＦＲＥＴに基づく蛍光が検出された。この蛍光顕微鏡写真を図２３に示す。なお、図２３においては、IL-2発現誘導細胞およびIL-2発現未誘導細胞のそれぞれにおいて、各プローブの組のＡ／Ａ像、Ｄ／Ｄ像、Ｄ／Ａ像を２枚表示してある。また、対照実験としてプローブを導入しなかった結果も示してある。
【０１１４】次に、得られた蛍光像の１視野全体の Ｄ/Ａ（Ｄ励起によるＦＲＥＴに基づくＡの蛍光）およびＡ/Ａ（Ａ励起によるＡの蛍光）を測定し、これらの測定値と１視野あたりの細胞数から１細胞あたりの蛍光強度値（平均値±ＳＥ）を算出した。以上の計算結果から細胞内ハイブリダイゼーションの効率を求めるために、細胞内全体のアクセプタープローブに対するIL-2 mRNAとハイブリダイズしたプローブの割合｛（１細胞あたりのＤ/Ａ）／（１細胞あたりのＡ/Ａ）｝を百分率に換算した。この（Ｄ/Ａ）／（Ａ/Ａ）（％）を指標にプローブの各組を比較した結果を図２４に示す。以上（８）、（９）の結果を総合すると、IL-2 342-356(D)、IL-2 357-371(A)は個別で、かつ連続して標的ｍＲＮＡに細胞内でハイブリダイズすることが示唆された。
【０１１５】（１０）生きたIL-2発現誘導細胞にドナープローブおよびアクセプタープローブを導入したときの細胞内ハイブリダイゼーション（３Ａ）〜（９）の結果を踏まえ、IL-2 342-356(D)、IL-2 357-371(A)を生細胞内のIL-2 mRNA検出に使用するプローブとして選定した。蛍光色素で標識されたこれらのプローブをIL-2遺伝子を発現する生きた細胞に導入し、FRETによる蛍光の変化を指標にハイブリダイゼーションを特異的に検出することを試みた。
【０１１６】前記（５）と同様に抗CD3抗体、抗CD28抗体、PMAで３日間処理することによって得られたIL-2発現誘導細胞と、IL-2発現未誘導細胞を回収し、氷冷PBS(-)で２回洗った後、同PBS(-)で細胞密度が1×107 cells/mlになるように懸濁した。0.9mlの同細胞懸濁液を、エレクトロポレーション用キュべット内にいれ、5.4 nmol（最終濃度6.0 μM）のBodipy493/503標識されたドナープローブIL-2 342-356(D)、および5.3 nmol（同終濃度5.86 μM）のXRITC標識されたアクセプタープローブIL-2 357-371(A)を添加して250 V、975 μFで細胞にパルスをかけた。細胞懸濁液を70μmのセルストレイナー（Falcon）を通過させ、軽く遠心後、細胞をPBS(-)で再度懸濁した。さらに通過液を40μmのストレイナー（Falcon社製）を通し、通過液を遠心後、再度懸濁して多くの死細胞を巻き込んだデブリ等を可及的に除いた後に、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１１７】その結果を図２５に示す。図２５にはIL-2発現誘導細胞およびIL-2発現未誘導細胞における、Ａ／Ａ像、Ｄ／Ｄ像、Ｄ／Ａ像、および位相差顕微鏡観察による透過像が示されている。なお、図２５においては、IL-2発現誘導細胞およびIL-2発現未誘導細胞のそれぞれにおいて、各プローブの組のＡ／Ａ像、Ｄ／Ｄ像、Ｄ／Ａ像、および位相差顕微鏡観察による透過像を２枚表示してある。IL-2発現誘導細胞においては、視野全体の細胞２０〜２２個の中で１〜３個の細胞に、ドナープローブおよびアクセプタープローブがIL-2 mRNAに対して隣接してハイブリダイズしたことに基づく、Ｄ／Ａが検出された。一方、IL-2発現未誘導細胞にはこのようなＦＲＥＴによる蛍光は全く検出されなかった。
【０１１８】（１１）フローサイトメトリーによるIL-2遺伝子を発現する細胞の選択的分離IL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞に、ドナープローブとアクセプタープローブを導入し、これらのプローブとIL-2 mRNAの生細胞内ハイブリダイゼーションに基づくFRETによる蛍光強度の格差を利用して、IL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞とを選択的に分離することを以下のように試みた。
【０１１９】（９）と同様に調製したIL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞の細胞懸濁液をそれぞれ100対0、0対100、50対50、20対80％の割合で混合して得られた懸濁液0.9mlをエレクトロポレーション用キュべット内にいれ、16.2 nmol（最終濃度18.0 μM）のBodipy493/503標識されたドナープローブIL-2 342-356(D)、および14.7 nmol（同終濃度16.4 μM）のCy5標識されたアクセプタープローブIL-2 357-371(A)を添加して（９）と同じ条件でパルスをかけた。生細胞を集め、フローサイトメトリー用実験装置（FACSCalibur、BECTON DICKINSON社製）に注入した。
【０１２０】流路の一カ所で、細胞にエネルギードナー蛍光色素（Bodipy493/503）の励起光を照射したときに、前記ハイブリダイゼーションに基づいてアクセプター（Cy5標識体）から発せられる相対的蛍光強度（FL3-Height）をBodipy493/503による相対的蛍光強度（FL1-Height）とともにドットプロットとして検出した。このプロットの中でFL3-Heightが高い値をとる細胞群を選択し、R2として領域指定した。一方、ヒトリンパ球系細胞としての細胞のサイズ（FSC-Height；前方散乱光）ならびに内部構造の複雑さ（SSC-Height；側方散乱光）を有する集団を参考値（FACSCalibur Training Manual, BECTON DICKINSON社）に基づいて選択し、R１として領域指定した。
【０１２１】以上により得られたドットプロットを図２６〜３３に示す。なお、図２６はIL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞の混合比率が100対0の場合のFSC-HeightおよびSSC-Heightに基づくドットプロットを示し、図２７は同様の混合比率の場合のFL1-HeightおよびFL3-Heightに基づくドットプロットを示す。図２８はIL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞の混合比率が0対100の場合のFSC-HeightおよびSSC-Heightに基づくドットプロットを示し、図２９は同様の混合比率の場合のFL1-HeightおよびFL3-Heightに基づくドットプロットを示す。また、図３０はIL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞の混合比率が50対50の場合のFSC-HeightおよびSSC-Heightに基づくドットプロットを示し、図３１は同様の混合比率の場合のFL1-HeightおよびFL3-Heightに基づくドットプロットを示す。さらに、図３２はIL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞の混合比率が20対80の場合のFSC-HeightおよびSSC-Heightに基づくドットプロットを示し、図３３は同様の混合比率の場合のFL1-HeightおよびFL3-Heightに基づくドットプロットを示す。
【０１２２】前記R2の条件を満たし、かつR1の条件も満たす集団をセルソーテイング機能（セルソーター）を利用して選択的に分取した。分取した細胞群を再びFACSCaliburに注入し、目的通りに蛍光標識された細胞群であることを確認するために同様のドットプロットとして検出した。得られたドットプロットを図３４〜３９に示す。図３４はIL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞の混合比率が100対0の場合のFSC-HeightおよびSSC-Heightに基づくドットプロットを示し、図３５は同様の混合比率の場合のFL1-HeightおよびFL3-Heightに基づくドットプロットを示す。また、図３６はIL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞の混合比率が50対50の場合のFSC-HeightおよびSSC-Heightに基づくドットプロットを示し、図３７は同様の混合比率の場合のFL1-HeightおよびFL3-Heightに基づくドットプロットを示す。さらに、図３８はIL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞の混合比率が20対80の場合のFSC-HeightおよびSSC-Heightに基づくドットプロットを示し、図３９は同様の混合比率の場合のFL1-HeightおよびFL3-Heightに基づくドットプロットを示す。
【０１２３】図２７、図３１、図３３を比較することにより、細胞懸濁液中のIL-2発現誘導細胞の割合を100から50、20％と減少させるのにともない、FL3-Heightが高くR2に属する細胞群のドットプロット全体の中で占める割合が減少することがわかった。これに対して、同じドナープローブおよびアクセプタープローブをIL-2発現未誘導細胞に導入しても、FL3-Heightの値が高い細胞群は全く認められなかった（図２９）。また、セルソーテイング機能によりソートアウト（選択的分離）した細胞の大多数はゲートR1ならびにR2の条件を満たす集団であることから、IL-2発現誘導細胞が充分なＦＲＥＴ蛍光を発する細胞群として分取されたことが確認された（図３４〜３９参照）。
【０１２４】（１２）蛍光顕微鏡観察によるフローサイトメトリー前後の細胞群の比較フローサイトメトリー前後の細胞の一部をガラス底ディッシュに移し、蛍光顕微鏡を用いて視野全体の細胞の中で、Ｄ／Ａ、Ａ／Ａ、Ｄ／Ｄの蛍光を発する細胞の割合について調べた。
【０１２５】その結果を図４０〜４６に示す。図４０、４２、４４、４６には、フローサイトメトリー前の細胞群における、IL-2 mRNAとドナープローブおよびアクセプタープローブの３者で形成されるハイブリッド体のＦＲＥＴに基づくアクセプター色素の蛍光像（Ｄ／Ａ像）、細胞中の全てのドナープローブの存在を示すドナー色素の励起によるドナー色素の蛍光像（Ｄ／Ｄ像）、アクセプタープローブの存在を示すアクセプター色素の励起によるアクセプター色素の蛍光像（Ａ／Ａ像）、および前記細胞群の位相差顕微鏡観察による透過像が示されている。図４１、４３、４５はフローサイトメトリー後（セルソーテイング機能によって選択的に分取された後）の、上記と同様の像が示されている。なお、図４０〜４６においては、細胞の蛍光像と透過像間の位置合わせのために、一部の細胞を指し示す矢印が記載されている。
【０１２６】図４０および４１の細胞群は、IL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞（いずれも生きた状態）を100対0の比率で混合したものであり、図４２および４３の細胞群は、これらの比率が50対50のものである。また、図４４および４５の細胞群は、IL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞（いずれも生きた状態）を20対80の比率で混合したものであり、図４６の細胞群はこれらの比率が0対100のものである。
【０１２７】図４０において、位相差顕微鏡観察による透過像に２０cellsとの記載があることからわかるように、視野全体に２０個の細胞が存在している。また、Ａ/Ａ像、Ｄ/Ａ像およびＤ/Ｄ像に、それぞれ５cells、４cellsおよび７cellsとの記載があることからわかるように、Ａ/Ａ、Ｄ/Ａ、Ｄ/Ｄの蛍光を発する細胞の個数はそれぞれ５、４、７個であることがわかる。
【０１２８】また、図４２においては、２０cells、３cells、１cellsおよび１０cellsとの記載があることからわかるように、視野全体の細胞は２０個であり、このなかでＡ/Ａ、Ｄ/Ａ、Ｄ/Ｄの蛍光を発する細胞の個数はそれぞれ３、１、１０個である。同様に、図４４において、３６cells、７cells、１cellsおよび２０cellsとの記載があることからわかるように、視野全体の細胞は３６個であり、このなかでＡ/Ａ、Ｄ/Ａ、Ｄ/Ｄの蛍光を発する細胞の個数はそれぞれ７、１、２０個である。更に、IL-2発現誘導細胞を含まない図４６においては、２１cells、２cells、０cellsおよび３cellsとの記載があることからわかるように、視野全体の細胞は２１個であり、このなかでＡ/Ａ、Ｄ/Ａ、Ｄ/Ｄの蛍光を発する細胞の個数はそれぞれ２、０、３個である。
【０１２９】以上のことから、IL-2発現誘導細胞の割合を100から50、20％と減少させるのにともないフローサイトメトリー前にはハイブリダイゼーションに基づいてIL-2mRNAが蛍光標識されている細胞（D/Aの蛍光を発する細胞）の視野全体の細胞に対する割合が減少することがわかった。
【０１３０】図４１は、IL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞（いずれも生きた状態）を100対0の比率で混合したものに対してフローサイトメトリーによる選択的分離を行った後の像を示すものであるが、位相差顕微鏡観察による透過像に７cellsとの記載があることからわかるように、視野全体に７個の細胞が存在している。また、Ａ/Ａ像、Ｄ/Ａ像およびＤ/Ｄ像に、それぞれ７cells、７cellsおよび７cellsとの記載があることからわかるように、Ａ/Ａ、Ｄ/Ａ、Ｄ/Ｄの蛍光を発する細胞の個数はいずれも７個であった。
【０１３１】また、図４３の全てにおいて６cellsとの記載があることからわかるように、視野全体の細胞は６個であり、このなかでＡ/Ａ、Ｄ/Ａ、Ｄ/Ｄの蛍光を発する細胞の個数はいずれも６個であった。同様に、図４５の全てにおいて５cellsとの記載があることからわかるように、視野全体の細胞は５個であり、このなかでＡ/Ａ、Ｄ/Ａ、Ｄ/Ｄの蛍光を発する細胞の個数はいずれも５個であった。
【０１３２】図４０と４１、図４２と４３、図４４と４５を比較することにより、フローサイトメトリーのセルソーテイング機能（セルソーター）によって、IL-2 mRNAが蛍光標識されている細胞のみを選択的に分離することが可能であることがわかった。
【０１３３】（１３）In situ Hybridization法によるフローサイトメトリー前後の細胞群の比較フローサイトメトリー前後の細胞の一部を別のガラス底ディッシュに移し、4%パラホルムアルデヒド／PBS (pH7.4) で室温で30分間細胞を固定し、FISH（Fluorescent in situ Hybridization）法により視野全体の細胞の中でIL-2 mRNAを保有する細胞（IL-2 mRNA (+)）の割合を求めた。このFISH法に用いるリボプローブは、未反応のリボプローブが細胞内に止まることに起因する高バックグラウンドを防ぐために、（７）（ｃ）で記した方法で取得された全長のIL-2リボプローブを次の方法で細かく断片化したものを実験に用いた。
【０１３４】10 μgのリボプローブを100 μlのアルカリ変性用溶液（42 mM NaHCO3, 63 mMNa2CO3, 5 mM DTT）に溶かし、60℃で10〜15分間インキュベートした後に、10μlの3 M 酢酸ナトリウムとともに350 μlのエタノールを加え、リボプローブをエタノール沈殿させた。-20℃で30分間放置後、16 krpmで20分冷却遠心し、得られた沈殿を70％ エタノールで沈殿を洗い、乾燥させた後、50 μlのRNase を含有しない滅菌蒸留水で溶解し、アルカリ変性IL-2リボプローブ溶液とした。
【０１３５】ディッシュ底面に固定された細胞をPBS (-)で３回洗い、0.1% Triton X-100/PBS溶液で室温にて5分間処理し細胞膜に物質透過性を付与した後にPBS (-)で３回洗い、0.2N HClで室温にて10分間処理した。単層細胞をPBS (-)で洗った後、1μg/ml Proteinase K／PBS溶液で5分間37℃でインキュベートした。単層細胞をPBS (-)で洗った後、4% パラホルムアルデヒド／PBS (pH7.4)で30分間再度固定した。2 mg/ml グリシン／PBSで２回洗い（15分／回）、50% 脱イオン済ホルムアミド／2×SSC溶液（溶液A、後出）で30分間処理し、ハイブリダイゼーション溶液（50% 脱イオン処理済ホルムアミド、5×denhardt、2×SSC、アルカリ変性処理済IL-2リボプローブ（1 μg／ml））を調製し、90℃で10分間熱変性処理後氷冷し、同溶液100 μlをディッシュに添加し、45℃で一晩反応させた。
【０１３６】ハイブリダイゼーション後の単層細胞を溶液 Aで5分間45℃で洗い、続いて溶液 B（10 mM Tris・HCl (pH8.5), 500 mM NaCl）で２回洗い（5分／回）、20 μg/ml RNase A／溶液 B（90℃10分間熱処理したもの）で37℃で20分間処理した。溶液 A、溶液 C（50% 脱イオン処理済ホルムアミド／1×SSC）の順で45℃で各30分間、さらに溶液 Cで室温で20分間洗った。さらに、Buffer 1（100 mM マレイン酸、150 mM NaCl（pH7.5））で洗った（5分×2回）後、Buffer 2（1% Blocking Reagent (Boehringer Mannheim社製) in Buffer I）で室温で20分間ブロッキングを行った。
【０１３７】Buffer 1で２回洗った後、 FITC標識抗DIG抗体（Fab、Buffer 2で100倍希釈したもの、蛋白質濃度にして〜1 μg/ml）を単層細胞に加え30分間以上インキュベートし、PBS (-)で3回洗浄後蛍光顕微鏡観察し、視野全体の細胞に対するIL-2 mRNAを保有する細胞の割合を求めた。
【０１３８】図４７および４８は、IL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞の混合比率が100対0である場合の蛍光顕微鏡写真であり、図４７はフローサイトメトリー前、図４８はフローサイトメトリー後を示す。また、図４９は、IL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞の混合比率が0対100である場合のフローサイトメトリー前の蛍光顕微鏡写真である。図５０および５１は、IL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞の混合比率が50対50である場合の蛍光顕微鏡写真であり、図５０はフローサイトメトリー前、図５１はフローサイトメトリー後を示す。また、図５２および５３は、IL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞の混合比率が20対80である場合の蛍光顕微鏡写真であり、図５２はフローサイトメトリー前、図５３はフローサイトメトリー後を示す。
【０１３９】なお、図中に記載された数字は視野全体の細胞数あたりの蛍光を発する細胞の個数を示しており、例えば、図４７の４８／４８は、視野を占める４８細胞全てに蛍光が観察され、IL-2 mRNAが含まれることを示すのに対して、図４９の０／３２は、３２個の細胞の中でIL-2 mRNAを保有する細胞が皆無であることを示す。また、図５０の１８／３５は、３５個の細胞中に１８個のIL-2 mRNA保有細胞が検出されたことを示し、図５２の８／３９は、３９個の細胞中に８個のIL-2 mRNA保有細胞が検出されたことを示すことから、図５０においては５０対５０の比率で、図５２においては２０対８０の比率でIL-2発現誘導細胞とIL-2発現未誘導細胞を混合したことがよく反映されている。一方、図４８、図５１、図５３における数字はそれぞれ９／９、７／７、８／８であり、このことから、フローサイトメトリー前には多くても５０％もしくは約２０％しか存在しなかったIL-2 mRNA保有細胞はすべてフローサイトメトリー後に１００％に濃縮されることが確認された。
【０１４０】（１４）特定の遺伝子を発現する生細胞の蛍光強度の格差を利用した分離法（１１）〜（１３）の実験結果を整理し、IL-2 mRNAが蛍光標識されることに基づく蛍光強度の格差を利用した分離法の成績を以下の表８に示す。フローサイトメトリー前には多くても５０％もしくは約２０％しか存在しなかったIL-2 mRNA保有細胞は、この蛍光強度の格差を利用した分離法によって１００％に濃縮された。すなわち、IL-2 mRNA保有細胞を含む生細胞群から１００％の純度で当該IL-2 mRNA保有細胞が選択的に分離された。
【０１４１】
【表８】

【０１４２】（１５） ヒト末梢血からのリンパ球の分離終濃度10 U/mlのヘパリンを加えた血液を、健常人から200ml採取後、２倍容の3%デキストランin PBS（phosphate buffered saline）溶液と50mlの遠心チューブ（Falcon2070）内で混和し、室温で15分間静置し、赤血球を沈降させた。上清21.5 mlを15 mlのフィコールパック（ファルマシア）に静かに重層し、490×g(1,600 rpm)で30分間遠心した。上清において白色の浮遊物として観察されるリンパ球層をピペットにより採取した。リンパ球層を３倍容のHBSS（Hanks' Balanced Salt Solution, GIBCO BRL製）と50mlの遠心チューブ（Falcon2070）内で混和し、1,200 rpmで10分間遠心後、リンパ球から成る沈殿を30 mlのPBS(-)で２回洗浄後、細胞密度が約2.5×107 cells/mlになるように懸濁した。
【０１４３】（１６）末梢血リンパ球からヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性細胞）の分離および蛍光抗体染色ＣＤ４陽性細胞の分離には、ヒトＣＤ４陽性細胞回収用カラムキット（HumanCD4 cell Recovery Column Kit、CEDARLANE社製）を使用し、同キットに備え付けのプロトコールに従い、以下のように分離操作を行った。
【０１４４】ＣＤ４陽性細胞分離用カラム （CEDARLANE社）をカラムスタンドにセットし、カラム内ガラスビーズを１５mlのPBS(-)を注ぎ加え、洗い流し、PBS(-)がビーズの真上に僅かに残った状態で止めた。同ビーズにヤギ抗ヒトIgG (H+L)およびヤギ抗マウスIgG (H+L)血清を付加するために、カラムリエージェント（Column Reagent, CEDARLANE社）内の試薬粉末を１〜１.５mlのPBS(-)で溶かし、同リエージェント溶液をカラム内ビーズに加え、流し、ビーズの真上に僅かに残った状態で止め、室温で１-８時間静置した。
【０１４５】セルリエージェント（Cell Reagent, CEDARLANE社）内の粉末を１.５mlのPBS(-)で溶かし、同セルリエージェント全量と（１５）で調製した３.５-４.５mlのリンパ球懸濁液を50mlの遠心チューブ（Falcon 2070）内で混和し、３０分間以上氷上でインキュベートし、細胞群中のＣＤ８陽性細胞を同リエージェントに含まれるＣＤ８に対する特異抗体（マウス抗ヒトCD8）で中和した。このリンパ球懸濁液に１５mlのPBS(-)を加え、４℃で200×g（約1,200 rpm）で5-10分間遠心し、上清をピペッテイングにより除いた。
【０１４６】得られた細胞沈殿を１５mlのPBS(-)で洗った後、沈殿を細胞密度が約5×107 cells/mlになるように懸濁した。PBS(-)で平衡化されたカラムのビーズに２０mlのPBS(-)を注ぎ加え、洗い流しながら、流速を６-８滴／分（１滴／８秒間）に合わせた後、細胞懸濁液をカラムビーズに加え流し、15mlのFalconチューブで溶出液を回収し、細胞懸濁液がビーズの真上に僅かに残った状態で流入を停止した。さらにPBS(-)をビーズに注ぎ加え、15mlのFalconチューブで１０〜１５mlの溶出液を回収した。得られた溶出液を４℃で1,200 rpmで10分間遠心し、上清をピペッテイングにより除き、得られた細胞沈殿を細胞密度が1.0×107 cells/mlになるように胎児ウシ血清（ＦＢＳ）が１０％含まれるPBS(-)で懸濁した。
【０１４７】細胞懸濁液中にＣＤ４陽性Ｔ細胞が占める割合を調べる目的で、得られた細胞懸濁液の一部（50μl）に対して、抗CD4／CD8抗体（サイマルテスト(Leu-3A/2a)、Becton Dickinson社）とコントロール抗体（サイマルテストコントロール、Becton Dickinson社）20μlを２mlのマイクロチューブ内で混合し、30-45分間遮光しながら氷中でインキュベートし、細胞表面のＣＤ４およびＣＤ８を蛍光染色した。２mlのPBS(-)を前記混合液に加え、ボルテックスミキサーで混和し、300×gで５分間遠心し、上清をピペッテイングもしくはアスピレーションにより除去後、細胞沈殿を1mlのPBS(-)で懸濁後、フローサイトメトリー用実験装置（FACSCalibur、Becton Dickinson社）に注入し、ＣＤ４およびＣＤ８に関するフローサイトメトリーを実施した。その結果、前記カラムにかける前の末梢血リンパ球中には多くのＣＤ８陽性細胞が確認された（図５６）。これに対して、前記ＣＤ４陽性細胞分離操作を経て得られた細胞懸濁液には５０％程度のＣＤ４陰性ならびに弱陽性細胞が含まれることが判明したが、ＣＤ８陽性細胞の混入は認められなかった（図５９）。
【０１４８】（１７）ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性細胞）の活性化（１６）で得られた細胞懸濁液（細胞密度は1.0×107 cells/ml）に1 μg/ml（終濃度）のイオノマイシン（SIGMA）、30 nM PMA（SIGMA）を添加して37℃、5% CO2存在下で２時間インキュベートした。
【０１４９】（１８）ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性細胞）の細胞内IL-2 mRNAの蛍光標識（１７）で得られた活性化ＣＤ４陽性細胞の懸濁液0.9 mlを、エレクトロポレーション用キュべット（Gene Pulser専用キュベット（電極間距離=0.4cm）、BIO-RAD社）内に容れ、5.4 nmol（最終濃度6.0 μM）のBodipy493-503で標識されたドナープローブIL-2 342-356(D)および5.3 nmol（同終濃度5.86 μM）のCy5で標識されたアクセプタープローブIL-2 357-371(A)を添加して250 V、975 μFで細胞にパルスをかけた。細胞懸濁液を70μmのセルストレイナー（Falcon）を通過させ、軽く遠心後、細胞をPBS(-)で再度懸濁した。さらに通過液を40μmのストレイナー（Falcon）を通し、通過液を遠心後、再度懸濁して多くの死細胞を巻き込んだデブリ等を可及的に除いた後に、細胞の一部をカバーガラスチャンバー（Lab-Tek II Chambered Coverglass#155409、NUNC社）に移し、蛍光顕微鏡を用いて視野全体の細胞の中で、下記の蛍光を発する細胞の割合について調べた。
■A/A｛細胞にA（アクセプター色素）の励起光を照射したときに細胞から発せられるAの蛍光｝
■D/A｛細胞にD（ドナー色素）の励起光を照射したときに細胞から発せられるAの蛍光、FRETによる蛍光｝
■D/D｛細胞にDの励起光を照射したときに細胞から発せられるDの蛍光｝
【０１５０】その結果、視野全体（２５細胞）の中で３個の細胞がD/Aの蛍光を発していることが観察され、IL-2 mRNAがドナーおよびアクセプタープローブとのハイブリダイゼーションに基づいて特異的に蛍光標識されたことが確認された。この結果から、活性化ＣＤ４陽性細胞群中にＴＨ１が１２％程度存在することが示唆された（図６０）。
【０１５１】（１９）活性化ＣＤ４陽性細胞群からのフローサイトメトリーによるTH1の選択的分離IL-2 mRNAとドナーおよびアクセプタープローブとの生細胞内ハイブリダイゼーションに基づくFRETによる蛍光によって生じる（IL-2 mRNAを保有する細胞としない細胞間の）蛍光強度の格差を利用して、ＴＨ１を選択的に分離することを以下のように試みた。
【０１５２】（１８）で得られたIL-2 mRNAが蛍光標識された細胞が含まれる細胞群の懸濁液を、フローサイトメトリー用実験装置（FACSCalibur）に注入した。流路の一カ所で、細胞にドナー色素（Bodipy）の励起光を照射したときに、前記ハイブリダイゼーションに基づいてアクセプター（Cy5標識体）から発せられる相対的蛍光強度（FL3-Height）をBodipyによる相対的蛍光強度（FL1-Height）とともにドットプロットとして検出した。このブロットの中でFL3-Heightが高い値をとる細胞集団を選択し、R2として領域指定した（図６３）。
【０１５３】一方、ヒトリンパ球系細胞としての細胞のサイズ（FSC-Height；前方散乱光）ならびに内部構造の複雑さ（SSC-Height；側方散乱光）を有する集団を参考値（FACSCalibur Training Manual, BECTON DICKINSON）に基づいて選択し、R1として領域指定した（図６２）。前記R2の条件を満たし、かつR1の条件も満たす集団をセルソーテイング機能を利用して選択的に分取した。分取した細胞集団を再びFACSCaliburに注入し、目的通りに蛍光標識された細胞集団であることを確認するために同様のドットプロットとして検出した結果、セルソーテイング機能によりソートアウトされた細胞の大多数はゲートR1ならびにR2の条件を満たす集団であり、IL-2 mRNAが蛍光標識された細胞は充分なFRET蛍光を発する細胞群として分取されたことが確認された（図６５）。これに対して、蛍光標識プローブを導入しなかった対照実験の細胞群のドット解析の結果、FL1-Heightについて微弱な蛍光を発する細胞群が検出されたものの、FL3-Heightについては総てのドットがベースライン付近に密集したため、IL-2 mRNAが特異的に蛍光標識された細胞群とはドットプロット上で容易に識別されることが確認された（図６７）。
【０１５４】次に、ソートアウトされた細胞群の一部を（１８）と同様に蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ソートアウトされた細胞群は視野全体の８個の細胞総てがD/A（FRETによる蛍光）を発しており、IL-2 mRNAが蛍光標識されていることが観察された（図６１）。この結果と、（１８）のフローサイトメトリーにかける前の結果をIL-2 mRNAが蛍光標識された細胞の存在比率を指標に比較したところ、フローサイトメトリーに基づくセルソーテイングによってTH1が選択的に分離されたことが示唆された。
【０１５５】（２０）ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性細胞）の細胞内IL-4 mRNAの蛍光標識（１７）で得られた活性化ＣＤ４陽性細胞の懸濁液0.9 mlを、（１８）と同様にエレクトロポレーション用キュべット（BIO-RAD社）内に容れ、15.1 nmol（最終濃度16.8 μM）のBodipy493-503で標識されたドナープローブIL-4 265-279および13.6 nmol（同終濃度15.1 μM）のCy5で標識されたアクセプタープローブIL-4 280-294を添加して250 V、975 μFで細胞にパルスをかけた。細胞懸濁液を（１８）と同様に70μmのセルストレイナー（Falcon）を通過させ、軽く遠心後、細胞をPBS(-)で再度懸濁した。さらに通過液を40μmのストレイナー（Falcon）を通し、通過液を遠心後、再度懸濁して多くの死細胞を巻き込んだデブリ等を可及的に除いた後に、細胞の一部をカバーガラスチャンバー（NUNC社）に移し、蛍光顕微鏡を用いて視野全体の細胞の中で、（１８）と同様にA/A、D/A、D/Dの蛍光を発する細胞の割合について調べた。その結果、視野全体（４１細胞）の中で２個の細胞がD/Aの蛍光を発していることが観察され、IL-4 mRNAがドナーおよびアクセプタープローブとのハイブリダイゼーションに基づいて特異的に蛍光標識されたことが確認された（図６８）。この結果から、活性化ＣＤ４陽性細胞群中にTH2が５％近く存在することが示唆された。
【０１５６】（２１）活性化ＣＤ４陽性細胞群からのフローサイトメトリーによるTH2の選択的分離IL-4 mRNAとドナーおよびアクセプタープローブとの生細胞内ハイブリダイゼーションに基づくFRETによる蛍光によって生じる（IL-4 mRNAを保有する細胞としない細胞間の）蛍光強度の格差を利用して、TH2を選択的に分離することを以下のように試みた。
【０１５７】（２０）で得られたIL-4 mRNAが蛍光標識された細胞が含まれる細胞群の懸濁液を、フローサイトメトリー用実験装置（FACSCalibur）に注入した。（１９）と同様に、細胞にドナー色素（Bodipy）の励起光を照射したときに、前記ハイブリダイゼーションに基づいてアクセプター（Cy5標識体）から発せられる相対的蛍光強度（FL3-Height）をBodipyによる相対的蛍光強度（FL1-Height）とともにドットプロットとして検出した。このプロットの中でFL3-Heightが高い値をとる細胞集団を選択し、R2として領域指定した（図７１）。
【０１５８】一方、ヒトリンパ球系細胞としての細胞のサイズ（FSC-Height；前方散乱光）ならびに内部構造の複雑さ（SSC-Height；側方散乱光）を有する集団を選択し、R1として領域指定した（図７０）。前記R2の条件を満たし、かつR1の条件も満たす集団をセルソーテイング機能を利用して選択的に分取した。分取した細胞集団を再びFACSCaliburに注入し、目的通りに蛍光標識された細胞集団であることを確認するために同様のドットプロットとして検出した結果、セルソーテイング機能によりソートアウトされた細胞の大多数はゲートR1ならびにR2の条件を満たす集団であり（図７２および７３）、IL-4 mRNAが蛍光標識された細胞は充分なFRET蛍光を発する細胞群として分取されたことが確認された。
【０１５９】次に、ソートアウトされた細胞群の一部を（２０）と同様に蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ソートアウトされた細胞群は視野全体の７個の細胞総てがD/A（FRETによる蛍光）を発しており、IL-2 mRNAが蛍光標識されていることが観察された（図６９）。この結果と、（２０）のフローサイトメトリーにかける前の結果をIL-4 mRNAが蛍光標識された細胞の存在比率を指標に比較したところ、フローサイトメトリーに基づくセルソーテイングによってTH2が選択的に分離されたことが示唆された。
【０１６０】（２２） ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性細胞）におけるTH2の誘導健常な生体内ではTH1とTH2の均衡が保たれており、両者のバランスがとれた関係が生体内免疫調節の恒常性が維持されていると考えられる。これとは反対に、TH1とTH2の均衡の破綻は多くの免疫病発症の要因となる。生体内で発生する均衡を破綻させる要素こそが当該疾病に至らしめる根源に違いないが、発病に至るまでの機構は試験管内で再構成させるにはあまりに複雑である。しかしながら、両者の均衡が破綻した状態を人為的に再構成することは以前から知られている。例えば、TH2がTH1に対して圧倒的に優位である場合には、生体内では代表的な液性免疫機能であるＢ細胞による免疫グロブリン（抗体分子）の過剰な産生と分泌が促され、その結果、通常では産生されない自己抗体（自己成分に反応し組織障害を引き起こす抗体）が作られ、自己免疫疾患の原因となることが考えられる。
【０１６１】このような病態を模倣し、TH2優位なヘルパーＴ細胞群を人為的に構成するには、「自らが産生するサイトカイン（IL-4）によって、自らを活性化する」というTH2の性質を利用した高濃度のIL-4でヘルパーＴ細胞群を処理してTH2を誘導する方法がとられている（Openshaw, P. et al. J. Exp. Med. 182(5), 1357, 1995）。そこで、（１６）で得られたＣＤ４陽性細胞の細胞懸濁液に（１７）で記載したイオノマイシン、PMAとともに20 ng/ml（終濃度）のヒトリコンビナントIL-4（Genzyme社）を添加して37℃で２時間インキュベートした。
【０１６２】（２３）TH2優位なヘルパーＴ細胞におけるTH1の細胞内IL-2 mRNAの蛍光標識TH2優位なヘルパーＴ細胞群の中では少数派と思われるTH1を選択的に分離取得することを試みた。（２２）でTH2が誘導されたＣＤ４陽性細胞の懸濁液0.9 mlを、（１８）と同様にエレクトロポレーション用キュべット（BIO-RAD社）に容れ、5.4 nmol（最終濃度6.0 μM）のBodipy493-503で標識されたドナープローブIL-2 342-356および5.3 nmol（同終濃度5.86 μM）のCy5で標識されたアクセプタープローブIL-2 357-371を添加して250 V、975 μFで細胞にパルスをかけた。（１８）と同様に細胞懸濁液から多くの死細胞を巻き込んだデブリ等を除去した後、細胞の一部をカバーガラスチャンバー（NUNC社）に移し、蛍光顕微鏡を用いて視野全体の細胞の中で、A/A、D/A、D/Dの蛍光を発する細胞の割合について調べた。その結果、視野全体（２３細胞）の中で１個の細胞がD/Aの蛍光を発していることが観察され、IL-2 mRNAが特異的に蛍光標識された細胞が存在することが確認された（図７４）。この結果から、TH2優位なＣＤ４陽性細胞群中でTH1は４％程度にまで減少したことが示唆された。
【０１６３】（２４）TH2優位なヘルパーＴ細胞群からのフローサイトメトリーによるTH1の選択的分離（１９）と同様にIL-2 mRNAが蛍光標識されることによって生じる（IL-2 mRNAを保有する細胞としない細胞間の）蛍光強度の格差を利用して、TH1を選択的に分離することを以下のように試みた。
【０１６４】（２３）で得られたIL-2 mRNAが蛍光標識された細胞が含まれる細胞群の懸濁液を、フローサイトメトリー用実験装置（FACSCalibur）に注入した。（１９）と同様に、細胞にドナー色素（Bodipy）の励起光を照射したときに、アクセプター（Cy5標識体）から発せられる相対的蛍光強度（FL3-Height）をBodipyによる相対的蛍光強度（FL1-Height）とともにドットプロットとして検出した。このプロットの中でFL3-Heightが高い値をとる細胞集団を選択し、R2として領域指定した（図７７）。一方、ヒトリンパ球系細胞としての細胞のサイズ（FSC-Height；前方散乱光）ならびに内部構造の複雑さ（SSC-Height；側方散乱光）を有する集団を選択し、R1として領域指定した（図７６）。前記R2の条件を満たし、かつR1の条件も満たす集団をセルソーテイング機能を利用して選択的に分取した。分取した細胞集団において目的通りに蛍光標識された細胞が存在することを確認するために、細胞を再びFACSCaliburに注入し、同様にドットの分布を調べた結果、セルソーテイング機能によりソートアウトされた細胞の大多数はゲートR1ならびにR2の条件を満たす集団であり（図７８および７９）、IL-2 mRNAが蛍光標識された細胞は充分なFRET蛍光を発する細胞群として分取されたことが確認された。
【０１６５】次に、ソートアウトされた細胞群の一部を（２０）と同様に蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ソートアウトされた細胞群は視野全体の５個の細胞総てがD/A（FRETによる蛍光）を発しており、IL-2 mRNAが蛍光標識されていることが観察された（図７５）。この結果と、（２３）のフローサイトメトリーにかける前の結果をIL-2 mRNAが蛍光標識された細胞の存在比率を指標に比較したところ、フローサイトメトリーに基づくセルソーテイングによってTH1が選択的に分離されたことが示唆された。
【０１６６】（２５）ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性細胞）におけるTH1の誘導（２２）とは反対に、TH1がTH2に対して圧倒的に優位である場合には、結核様癩のような慢性疾患に罹患することが知られている（Mitra, D.K. et al. Int.Immunol. 11(11), 1801, 1999）。このような病態を模倣し、TH1優位なヘルパーＴ細胞群を人為的に構成するには、TH1を活性化するサイトカインIL-12を細胞外液中のIL-4を中和して不活化するためのIL-4に対する特異抗体でヘルパーＴ細胞群を処理してTH1を誘導する方法がとられている（Openshaw, P. et al. J. Exp.Med. 182(5), 1357, 1995）。
【０１６７】そこで、（１６）で得られたＣＤ４陽性細胞の細胞懸濁液に（１７）で記載したイオノマイシン、PMAとともに10 ng/ml（終濃度）のヒトリコンビナントIL-12（Genzyme社）を抗ヒトIL-4マウスモノクローナル抗体（Genzyme社）とともに添加して37℃で２時間インキュベートした。
【０１６８】（２６）TH1優位なヘルパーＴ細胞におけるTH2の細胞内IL-4 mRNAの蛍光標識TH1優位なヘルパーＴ細胞群の中では少数派と思われるTH2を選択的に分離取得することを試みた。（２５）でTH1が誘導されたＣＤ４陽性細胞の懸濁液0.9 mlを、（１８）と同様にエレクトロポレーション用キュべット（BIO-RAD社）に容れ、15.1 nmol（最終濃度16.8 μM）のBodipy493-503で標識されたドナープローブIL-4 265-279(D)および13.6 nmol（同終濃度15.1 μM）のCy5で標識されたアクセプタープローブIL-4 280-294(A)を添加して250 V、975 μFで細胞にパルスをかけた。
【０１６９】（１８）と同様に細胞懸濁液から多くの死細胞を巻き込んだデブリ等を除去した後、細胞の一部をカバーガラスチャンバー（NUNC社）に移し、蛍光顕微鏡を用いて視野全体の細胞の中で、A/A、D/A、D/Dの蛍光を発する細胞の割合について調べた。その結果、視野全体（４２細胞）の中で１個の細胞がD/Aの蛍光を発していることが観察され、IL-4 mRNAが特異的に蛍光標識された細胞が存在することが確認された（図８０）。この結果から、TH1優位なＣＤ４陽性細胞群においてTH2が２％程度の割合で残っていることが示唆された。
【０１７０】（２７）TH1優位なヘルパーＴ細胞群からのフローサイトメトリーによるTH2の選択的分離（２１）と同様にIL-4 mRNAが蛍光標識されることによって生じる（IL-4 mRNAを保有する細胞としない細胞間の）蛍光強度の格差を利用して、TH2を選択的に分離することを以下のように試みた。
【０１７１】（２６）で得られたIL-4 mRNAが蛍光標識された細胞が含まれる細胞群の懸濁液を、フローサイトメトリー用実験装置（FACSCalibur）に注入した。（１９）と同様に、細胞にドナー色素（Bodipy）の励起光を照射したときに、アクセプター（Cy5標識体）から発せられる相対的蛍光強度（FL3-Height）をBodipyによる相対的蛍光強度（FL1-Height）とともにドットプロットとして検出した。このブロットの中でFL3-Heightが高い値をとる細胞集団を選択し、R2として領域指定した（図８３）。一方、ヒトリンパ球系細胞としての細胞のサイズ（FSC-Height；前方散乱光）ならびに内部構造の複雑さ（SSC-Height；側方散乱光）を有する集団を選択し、R1として領域指定した（図８２）。前記R2の条件を満たし、かつR1の条件も満たす集団をセルソーテイング機能を利用して選択的に分取した。分取した細胞集団において目的通りに蛍光標識された細胞が存在することを確認するために、再び細胞をFACSCaliburに注入し、同様にドットの分布を調べた結果、セルソーテイング機能によりソートアウトされた細胞の大多数はゲートR1ならびにR2の条件を満たす集団であり（図８４および８５）、IL-4 mRNAが蛍光標識された細胞は充分なFRET蛍光を発する細胞群として分取されたことが確認された。
【０１７２】次に、ソートアウトされた細胞群の一部を（２０）と同様に蛍光顕微鏡で観察した。その結果、ソートアウトされた細胞群は視野全体の細胞総てがD/A（FRETによる蛍光）を発しており、IL-4 mRNAが蛍光標識されていることが観察された（図８１）。この結果と、（２３）のフローサイトメトリーにかける前の結果をIL-4 mRNAが蛍光標識された細胞の存在比率を指標に比較したところ、フローサイトメトリーに基づくセルソーテイングによってTH2が選択的に分離されたことが示唆された。
【０１７３】（２８）In situ Hybridization法によるフローサイトメトリー前の細胞集団中のIL-2 mRNAもしくはIL-4 mRNA保有細胞の検出フローサイトメトリー（セルソーターで分離する）前の細胞の一部をカバーガラスチャンバー（Lab-Tek II Chambered Coverglass#155409、NUNC社）に移し、4% パラフォルムアルデヒド／PBS (pH7.4) で室温で30分間細胞を固定し、以下に記載したFISH（Fluorescent in situ Hybridization）法により視野全体の細胞におけるIL-2 mRNAもしくはIL-4 mRNAを保有する細胞（IL-2 mRNA (+)もしくはIL-4 mRNA (+)）の存在割合を求めた。
【０１７４】第一に、固定された前記細胞の細胞内IL-2 mRNAを検出するのに必要なジゴキシゲニン（以下DIG）標識IL-2リボプローブを、DIG RNA Labeling Kit（Boehringer Mannheim）を用いて同キット専用のプロトコールに従って合成した。（２Ａ）で記載した方法でヒトIL-2 RNA合成用に作成された組換体プラスミド（pTCGF#2）10 μgをEcoRI消化により完全に線状化し、得られたDNA溶液中の線状DNAを、phenol/chloroform抽出による蛋白質変性除去後にエタノール沈殿により精製し、リボプローブ合成のための鋳型とした。同鋳型DNA（5 μg）と1.8 mM ATP、0.9 mM CTP、0.7 mM GTP、1.1 mM UTP、0.58 mM UTP（DIG標識体）をT7 RNA polymerase存在下で混和し、37℃で2時間インキュベートした後、DNase I溶液を加え10分間反応させ、鋳型DNAを破壊した。同反応溶液に1/10倍容の5 Mの酢酸ナトリウムと１倍容のイソプロパノールを加え、15,000×gで15分間遠心することにより沈殿物として回収された合成RNAは、RNase freeの滅菌蒸留水に溶解された。
【０１７５】第二に、固定された前記細胞の細胞内IL-4 mRNAを検出するのに必要なDIG標識IL-4リボプローブを、IL-2の場合と同様にDIG RNA Labeling Kit（Boehringer Mannheim）を用いて次の方法で合成した。（２Ｂ）で記載した方法でヒトIL-4 RNA合成用に作成された組換体プラスミド（phIL-4#9）をSma Iで完全に消化して線状化し、得られたDNA溶液中の線状DNAをphenol/chloroformで処理後、エタノール沈殿により精製し、リボプローブ作成のための鋳型とした。同鋳型DNA（5 μg）と1.2 mM ATP、1.0 mM CTP、1.1 mM GTP、0.8 mM UTP、0.5 mM UTP（DIG標識体）をT7 RNA polymerase存在下で混和し、37℃で2時間インキュベートした後、DNase I溶液を加え10分間反応させ、鋳型DNAを破壊した。同反応溶液に1/10倍容の5 Mの酢酸ナトリウムと１倍容のイソプロパノールを加え、15,000×gで15分間の遠心により沈殿物として回収された合成RNAは、RNase freeの滅菌蒸留水に溶解された。
【０１７６】第三に、上記の通り得られた全長のIL-2もしくはIL-4のリボプローブを直接ハイブリダイゼーションに用いると、未反応のリボプローブが細胞内に止まることに起因する高バックグラウンド（ノイズ）が予想されたため、（１３）と同様に、次の方法により細かく断片化されたものをハイブリダイゼーション実験に用いた。10 μgのIL-2もしくはIL-4リボプローブを100 μlのアルカリ変性用溶液（42 mM NaHCO3, 63 mM Na2CO3, 5 mM DTT）に溶かし、60℃で10-15分間インキュベートした後に、10 μlの3 M 酢酸ナトリウムとともに350 μlのEtOHを加え、リボプローブをエタノール沈殿させた。-20℃で30分間放置後、16 krpmで20分間冷却遠心し、得られた沈殿を70％ エタノールで洗い、乾燥させた後、50 μlのRNase free滅菌蒸留水で溶解し、アルカリ変性IL-2もしくはIL-4リボプローブ溶液とした。
【０１７７】チャンバーの底面に固定された細胞をPBS (-)で３回洗い、0.1% Triton X-100/PBS溶液で室温で5分間処理して細胞膜に物質透過性を付与した後にPBS (-)で３回洗い、0.2 N HClで室温で10分間処理した。単層細胞をPBS (-)で洗った後、1μg/ml Proteinase K／PBS溶液で5分間37℃でインキュベートした。単層細胞をPBS (-)で洗った後、4% パラフォルムアルデヒド／PBS (pH7.4)で30分間再度固定した。2 mg/ml グリシン／PBSで２回洗い（15分／回）、50% 脱イオン済フォルムアミド／2×SSC溶液（以下Soln. A）で30分間処理し、ハイブリダイゼーション溶液（50% 脱イオン処理済フォルムアミド、5×denhardt、2×SSC、アルカリ変性処理済IL-2もしくはIL-4リボプローブ（1 μg／ml））を調製し、90℃で10分間変性処理後氷冷し、同溶液100 μlをチャンバーに添加し、45℃で一晩反応させた。
【０１７８】ハイブリダイゼーション後の単層細胞をSoln. Aで5分間45℃で洗い、続いてSoln. B（10 mM Tris・HCl (pH8.5), 500 mM NaCl）で２回洗い（5分／回）、20 mg/ml RNase A／Soln. B（90℃で10分間熱処理したもの）で37℃20分間処理した。 Soln. A、Soln. C（50% 脱イオン処理済フォルムアミド／1×SSC）の順で45℃で各30分間、さらにSoln. Cで室温で20分間洗った。さらに、Buffer 1（100 mM マレイン酸、150 mM NaCl（pH7.5））で洗った（5分×2回）後、Buffer 2（1%Blocking Reagent (Boehringer Mannheim) in Buffer I）で室温で20分間ブロッキングを行った。 Buffer 1で２回洗った後、 FITC標識抗DIG抗体（Fab、Buffer 2で100倍希釈したもの、蛋白質濃度にして〜1 μg/ml）を単層細胞に加え30分間以上インキュベートし、PBS (-)で3回洗浄後蛍光顕微鏡観察し、視野全体の細胞に対するIL-2 mRNAもしくはIL-4 mRNAを保有する細胞（TH1もしくはTH2）の存在割合を求めた。
【０１７９】その結果、TH1を選択的に分離するためにIL-2 mRNAを蛍光標識した（１８）の実験で使用した細胞群において、２４細胞中５個のIL-2 mRNA、４３細胞中３個のIL-4 mRNAを保有する細胞が検出された（図８６）。この結果においてIL-2 mRNA保有細胞の存在比率（20.8％）は（１８）で記載した蛍光顕微鏡観察結果（12.0％）をかなり上回ったが、この原因として（１８）の実験では顕微鏡視野下の総てのTH1に均一に蛍光プローブが導入されなかったことが考えられた。
【０１８０】一方、TH2を選択的に分離するためにIL-4 mRNAを蛍光標識した（２０）の実験で使用した細胞群において、２８細胞中６個のIL-2 mRNA、４２細胞中３個のIL-4 mRNAを保有する細胞が検出された（図８８）。この結果におけるIL-4 mRNA保有細胞の存在比率（7.1％）は（２０）で記載した蛍光顕微鏡観察結果（4.9％）を僅かに上回る程度であった。
【０１８１】さらに、TH2優位な細胞群からTH1を選択的に分離するためにIL-2 mRNAを蛍光標識した（２３）の実験で使用した細胞群において、２８細胞中２個、別の視野では３５細胞中３個のIL-2 mRNA、４１細胞中８個、別の視野では４２細胞中９個のIL-4 mRNAを保有する細胞が検出された（図９０）。この結果においてIL-2mRNA保有細胞の存在比率（7.9％）は（２３）で記載した蛍光顕微鏡観察結果（4.3％）を上回ったが、この原因も（２３）の実験で総てのTH1に均一に蛍光プローブが導入されなかったことが考えられた。
【０１８２】また、TH1優位な細胞群からTH2を選択的に分離するためにIL-4 mRNAを蛍光標識した（２６）の実験で使用した細胞群において、２４細胞中９個、別の視野では２９細胞中１１個のIL-2 mRNA、４８細胞中１個、別の視野では４１細胞中１個のIL-4 mRNAを保有する細胞が検出された（図９２）。この結果においてIL-4mRNA保有細胞の存在比率（2.2％）は（２６）で記載した蛍光顕微鏡観察結果（2.4％）と同等であった。このようにIL-4 mRNAについて蛍光顕微鏡観察結果とFISHの結果の整合性が高いことは、IL-2と比較して高濃度のIL-4蛍光プローブ存在下で細胞に電気パルスを加えたため比較的均一にプローブがTH2に導入された可能性が考えられた。
【０１８３】（２９）In situ Hybridization法によるフローサイトメトリー後の（セルソーターによって選択的に分離された）細胞集団中のIL-2、γ-IF、TNF-β、 IL-4、IL-5、IL-10 mRNA保有細胞の検出（２４）−（２７）で取得したフローサイトメトリー後の（セルソーターによって選択的に分離された）細胞の一部をカバーガラスチャンバー（NUNC社製）に移し、 4% パラフォルムアルデヒド／PBS (pH7.4) で室温で30分間細胞を固定し、（２８）で詳細に記載したFISH法により視野全体の細胞におけるTH1型のサイトカインであるIL-2、γ-IF、TNF-βならびにTH2型のサイトカインである IL-4、IL-5、IL-10のmRNAを保有する細胞（IL-2 mRNA (+)、γ-IF mRNA (+)、TNF-βmRNA (+)、 IL-4 mRNA (+)、IL-5 mRNA (+)、IL-10 mRNA (+) ）の存在割合を求めた。以上のサイトカインの中で、IL-2およびIL-4については、アルカリ変性されたリボプローブを既に（２８）で取得済みであるため、固定された細胞におけるIL-2およびIL-4以外の上記サイトカインのmRNAを検出するのに必要なリボプローブ（DIG標識体）を、DIG RNA Labeling Kit（Boehringer Mannheim）を用いて同キット専用のプロトコールに従って合成した。
【０１８４】第一に、γ-IFに関しては、ヒトγ-IF cDNAを有するプラスミドDNA、pPLc28-HIIF52を、２８℃で培養した同プラスミド保有大腸菌株（ATCC#39278）の培養液50 mlからPlasmid Midi Kit（QIAGEN）を用いて抽出・精製した。同プラスミドを制限酵素BamHIおよびClaIで消化し、切り出されたγ-IF cDNA断片を、RNA合成用ベクターpBluescript KS(+)のAccIおよびBamHI消化部位にライゲーションキット（タカラ）を用いて連結した。得られた組換体プラスミドを大腸菌JM109株のコンピテントセル（タカラ）に導入し、得られた同大腸菌の形質転換体を培養し、100 mlの同培養液からPlasmid Midi Kit（QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを抽出・精製した。得られた組換体プラスミド（phγ-IF#1）を制限酵素KpnIで消化し、得られたDNA溶液中の線状DNAをphenol/chloroformで処理後、エタノール沈殿により精製し、リボプローブ作成のための鋳型とした。同鋳型DNA（5 μg）と1.3 mM ATP、0.7 mM CTP、0.8 mM GTP、0.8 mM UTP、0.43 mM UTP（DIG標識体）をT7 RNA polymerase存在下で混和し、37℃で7時間インキュベートした後、DNase I溶液を加え10分間反応させ、鋳型DNAを破壊した。同反応溶液に1/10倍容の5Mの酢酸ナトリウムと１倍容のイソプロパノールを加え、15,000×gで15分間の遠心により沈殿物として回収された合成RNAは、RNase freeの滅菌蒸留水に溶解された。
【０１８５】第二に、TNF-βに関しては、ヒトTNF-β cDNAを有するプラスミドDNAを保有する大腸菌株HILBI37（ATCC#104607）の培養液50 mlからPlasmid Midi Kit（QIAGEN）を用いて抽出・精製した。同プラスミドを制限酵素BamHIで消化し、得られたDNA溶液中の線状DNAをphenol/chloroformで処理後、エタノール沈殿により精製し、リボプローブ作成のための鋳型とした。同鋳型DNA（5 μg）と0.7 mM ATP、1.4 mM CTP、1.1 mM GTP、0.4 mM UTP、0.24 mM UTP（DIG標識体）をT7 RNA polymerase存在下で混和し、37℃で6時間インキュベートした後、DNase I溶液を加え10分間反応させ、鋳型DNAを破壊した。同反応溶液に1/10倍容の5 Mの酢酸ナトリウムと１倍容のイソプロパノールを加え、15,000×gで15分間の遠心により沈殿物として回収された合成RNAは、RNase freeの滅菌蒸留水に溶解された。
【０１８６】第三に、IL-5に関しては、ヒトIL-5 cDNAを有するプラスミドDNA、phIL-5-115.1（ATCC#59395）2 μgの凍結乾燥粉末を20 μlの滅菌蒸留水に溶解後、同プラスミド1 ngを大腸菌JM109株のコンピテントセル（タカラ）に導入し、得られた同大腸菌の形質転換体を培養し、50 mlの同培養液からPlasmid Midi Kit（QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを抽出・精製した。同プラスミドを制限酵素BamHIで消化し、切り出されたIL-5 cDNA断片を、RNA合成用ベクターpBluescript KS(+)のBamHI消化部位にライゲーションキット（タカラ）を用いて連結した。
【０１８７】得られた組換体プラスミドを大腸菌JM109株のコンピテントセル（タカラ）に導入し、得られた同大腸菌の形質転換体を培養し、100 mlの同培養液からPlasmid Midi Kit（QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを抽出・精製した。得られた組換体プラスミド（phIL-5#8）を制限酵素Not Iで消化し、得られたDNA溶液中の線状DNAをphenol/chloroformで処理後、エタノール沈殿により精製し、リボプローブ作成のための鋳型とした。同鋳型DNA（5 μg）と1.3 mM ATP、0.7 mM CTP、0.8mM GTP、0.8 mM UTP、0.42 mM UTP（DIG標識体）をT3 RNA polymerase存在下で混和し、37℃で6時間インキュベートした後、DNase I溶液を加え10分間反応させ、鋳型DNAを破壊した。同反応溶液に1/10倍容の5 Mの酢酸ナトリウムと１倍容のイソプロパノールを加え、15,000×gで15分間の遠心により沈殿物として回収された合成RNAは、RNase freeの滅菌蒸留水に溶解された。
【０１８８】第四に、IL-10に関しては、ヒトIL-10 cDNAを有するプラスミドDNA、pH15Cを保有する大腸菌株（ATCC#104607）の培養液50 mlからPlasmid Midi Kit（QIAGEN）を用いて抽出・精製した。得られたプラスミドを制限酵素BamHIで消化し、切り出されたIL-10 cDNA断片を、RNA合成用ベクターpBluescript KS(+)のBamHI消化部位にライゲーションキット（タカラ）を用いて連結した。得られた組換体プラスミドを大腸菌JM109株のコンピテントセル（タカラ）に導入し、得られた同大腸菌の形質転換体を培養し、50 mlの同培養液からPlasmid Midi Kit（QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを抽出・精製した。
【０１８９】得られた組換体プラスミド（phIL-10#10）を制限酵素Sma Iで消化し、得られたDNA溶液中の線状DNAをphenol/chloroformで処理後、エタノール沈殿により精製し、リボプローブ作成のための鋳型とした。同鋳型DNA（5 μg）と1.1 mM ATP、0.9 mM CTP、0.9 mM GTP、0.6 mM UTP、0.50 mM UTP（DIG標識体）をT7 RNA polymerase存在下で混和し、37℃で6時間インキュベートした後、DNase I溶液を加え10分間反応させ、鋳型DNAを破壊した。同反応溶液に1/10倍容の5 Mの酢酸ナトリウムと１倍容のイソプロパノールを加え、15,000×gで15分間の遠心により沈殿物として回収された合成RNAは、RNase freeの滅菌蒸留水に溶解された。
【０１９０】以上で取得したγ-IF、TNF-β、IL-5、IL-10の全長リボプローブについても、IL-2、IL-4の場合と同様に細かく断片化するために、10 μgのリボプローブを100 μlの前記アルカリ変性用溶液に溶かし、60℃で10-15分間インキュベートした後に、10 μlの3 M 酢酸ナトリウムとともに350 μlのエタノールを加え、リボプローブを沈殿させた。-20℃で30分間放置後、16 krpmで20分間冷却遠心し、得られた沈殿を70％ エタノールで洗い、乾燥させた後、50 μlのRNase free滅菌蒸留水で溶解し、アルカリ変性γ-IF、TNF-β、IL-5、IL-10リボプローブ溶液を調製した。チャンバーの底面に固定された細胞をPBS (-)で３回洗い、0.1% Triton X-100/PBS溶液で室温で5分間処理して細胞膜に物質透過性を付与した後にPBS(-)で３回洗い、0.2 N HClで室温で10分間処理した。
【０１９１】単層細胞をPBS (-)で洗った後、1 μg/ml Proteinase K／PBS溶液で5分間37℃でインキュベートした。単層細胞をPBS (-)で洗った後、4% パラフォルムアルデヒド／PBS (pH7.4)で30分間再度固定した。2 mg/ml グリシン／PBSで２回洗い（15分／回）、50% 脱イオン済フォルムアミド／2×SSC溶液（以下Soln. A）で30分間処理し、ハイブリダイゼーション溶液（50% 脱イオン処理済フォルムアミド、5×denhardt、2×SSC、アルカリ変性処理済IL-2、γ-IF、TNF-β、IL-4、IL-5、IL-10リボプローブ（1 μg／ml））を調製し、90℃10分間変性処理後氷冷し、同溶液100 μlをチャンバーに添加し、45℃で一晩反応させた。
【０１９２】ハイブリダイゼーション後の単層細胞をSoln. Aで5分間45℃で洗い、続いてSoln. B（10 mM Tris・HCl (pH8.5), 500 mM NaCl）で２回洗い（5分／回）、20 mg/ml RNase A／Soln. B（90℃で10分間熱処理したもの）で37℃で20分間処理した。 Soln. A、Soln. C（50% 脱イオン処理済フォルムアミド／1×SSC）の順で45℃で各30分間、さらにSoln. Cで室温で20分間洗った。さらに、Buffer 1（100mM マレイン酸、150 mM NaCl（pH7.5））で洗った（5分×2回）後、Buffer 2（1% Blocking Reagent (Boehringer Mannheim) in Buffer I）で室温で20分間ブロッキングを行った。 Buffer 1で２回洗った後、 FITC標識抗DIG抗体（Fab、Buffer 2で100倍希釈したもの、蛋白質濃度にして〜1 μg/ml）を単層細胞に加え30分間以上インキュベートし、PBS (-)で3回洗浄後蛍光顕微鏡観察し、視野全体の細胞に対するIL-2、γ-IF、TNF-β、IL-4、IL-5、IL-10 mRNAを保有する細胞の存在割合を求め、セルソーターで分離された細胞のタイプ（TH1もしくはTH2）を同定した。
【０１９３】その結果、（１９）と（２４）でセルソーターにより分離された細胞集団はIL-2、γ-IF、TNF-βのmRNAについて陽性、 IL-4、IL-5、IL-10については陰性であり（図８７および９１）、調べた範囲内で総ての細胞がTH1特有のサイトカイン産生細胞であることが示された。一方、（２１）と（２７）でセルソーターにより分離された細胞集団はIL-2、γ-IF、TNF-βのmRNAについては陰性、反対にIL-4、IL-5、IL-10について陽性であり（図８９および９３）、TH2特有のサイトカイン産生細胞であることが判明した。
【０１９４】（３０）特定の遺伝子を発現する生きたTH1もしくはTH2の蛍光強度の格差を利用した選択的分離法（２４）−（２９）の実験結果を整理し、IL-2もしくはIL-4 mRNAが蛍光標識されることに基づく蛍光強度の格差を利用した、換言すれば、これらのmRNAをマーカーとして利用したTH1もしくはTH2の選択的分離実験を、（１８）、（２０）、（２３）、（２６）の各実験結果毎に整理し、選択的分離の成績として示した（表９）。
【０１９５】
【表９】

【０１９６】（１８）において、12%（図６０、生細胞の蛍光観察結果）もしくは20%（図８６、FISH実験の結果）程度しか存在しなかったIL-2発現細胞（TH1）は、（１９）で記載されたようにこの蛍光強度の格差を利用した分離法によって100％に濃縮された。フローサイトメトリーにかける前の細胞集団におけるIL-4発現細胞（TH2）は（２０）で記載されたように、4.9%（図６８、生細胞の蛍光観察結果）もしくは7.1%（図８８、FISH実験の結果）程度しか存在しなかった。しかし、IL-4 mRNAをマーカーに利用した（２１）の選択的分離法によって取得された細胞は総てIL-4 mRNAを保有していた。
【０１９７】さらに、TH2が過剰に活性化された免疫疾患を想定してTH1とTH2の存在比率を人為的にTH2に偏らせた（バランスを破綻させた）（２３）において、4.3%（図７４、生細胞の蛍光観察結果）もしくは7.9%（図９０、FISH実験の結果）と（１８）と比較して顕著に減少したTH1が、フローサイトメトリーによる選択的分離法によって100％の純度で取得されることが（２４）で示された。また、（２３）とは反対に、TH1が圧倒的に優位となった免疫疾患を想定してTH1とTH2のバランスを人為的にTH1に偏らせた（２６）において、2.4%（図８０、生細胞の蛍光観察結果）もしくは2.3%（図９２、FISH実験の結果）と（２５）と比較してさらに減少したTH2が、前記選択的分離法によって（２７）では100％の純度で取得された。
【０１９８】以上の結果についてさらに確認するために前記（２９）で実施したTH1もしくはTH2特有のサイトカインのmRNAを検出してタイプ解析の結果から、（１８）と（２３）の細胞から（１９）と（２４）でセルソーターにより分離された細胞集団は総てがTH1であり、（２０）と（２６）の細胞から（２１）と（２７）で選択的に分離された細胞集団はTH2であることが証明された。
【０１９９】これら総ての結果を総合すると、TH1もしくはTH2特有のサイトカインであるそれぞれIL-2もしくはIL-4のmRNAをマーカーとして利用した前記分離方法によって、TH1もしくはTH2が、これら両者を含む細胞集団から100％の純度で選択的に分離されることが結論された。
【０２００】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、細胞にマーカーとして使用可能な細胞表面分子が存在しない場合や、存在しても細胞間で区別ができない場合、さらにはマーカーとなるべき分子が細胞外液中に遊離してしまう場合であっても、目的とする細胞、すなわち特定の遺伝子を発現した細胞を生きたままの状態で選択的に分離取得することが可能な分離方法を提供することが可能となる。
【配列表】
SEQUENCE LISTING <110> Laboratory of Molecular Biophotonics<120> Method for selectively separating live cells that have expressed a specific gene<130> MBP-179<140><141><160> 20<170> PatentIn Ver. 2.1<210> 1<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 1gtaaaactta aatgt 15 <210> 2<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 2ggccttcttg ggcat 15 <210> 3<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 3tttgggattc ttgta 15 <210> 4<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 4gagcatcctg gtgag 15 <210> 5<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 5gcaagactta gtgca 15 <210> 6<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 6ctgtttgtga caagt 15 <210> 7<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 7ggtttgagtt cttct 15 <210> 8<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 8agcacttcct ccaga 15 <210> 9<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 9cctgggtctt aagtg 15 <210> 10<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 10attgctgatt aagtc 15 <210> 11<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 11cagttgggag gtgag 15 <210> 12<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 12gaacagaggg ggaag 15 <210> 13<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 13cgtggacaaa gttgc 15 <210> 14<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 14tatcgcactt gtgtc 15 <210> 15<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 15ctgtgaggct gttca 15 <210> 16<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 16acagagtctt ctgct 15 <210> 17<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 17agccctgcag aaggt 15 <210> 18<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 18ccggagcaca gtcgc 15 <210> 19<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 19ccgtttcagg aatcg 15 <210> 20<211> 15<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Probe<400> 20gaggttcctg tcgag 15
【出願人】 【識別番号】５９５０４７３８５
【氏名又は名称】株式会社分子バイオホトニクス研究所
【出願日】 平成１２年４月２８日（２０００．４．２８）
【代理人】 【識別番号】１０００８８１５５
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹 （外１名）
【公開番号】 特開２００１−２８６２８５（Ｐ２００１−２８６２８５Ａ）
【公開日】 平成１３年１０月１６日（２００１．１０．１６）
【出願番号】 特願２０００−１３０７９３（Ｐ２０００−１３０７９３）