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【発明の名称】 遺伝子導入のためのウイルスエンベロープベクター
【発明者】 【氏名】金田 安史
【要約】 【課題】ウイルスエンベロープを使用する、安全、安定、かつ広範囲の生体内組織に遺伝子導入可能な、高遺伝子導入活性を有する遺伝子導入ベクターが必要とされる。

【解決手段】ウイルスエンベロープに対して、凍結融解処理または界面活性剤との混合によって、外来遺伝子を導入し、遺伝子導入ベクターを調製する。この遺伝子導入ベクターを含む遺伝子治療のための薬学的組成物、この遺伝子導入ベクターを含むキット、およびこの遺伝子導入ベクターを用いた遺伝子導入方法もまた提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ウイルスエンベロープを含む、遺伝子導入ベクター。
【請求項２】 前記ウイルスが、野生型ウイルスまたは組換え型ウイルス由来である、請求項１に記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項３】 前記ウイルスが、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス由来である、請求項１または２に記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項４】 前記ウイルスがＨＶＪである、請求項３に記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のベクターであって、；該ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および該混合液を２回以上凍結融解する工程、を包含する方法によって調製される、遺伝子導入ベクター。
【請求項６】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のベクターであって、該ウイルスを界面活性剤の存在下で外来遺伝子と混合する工程を包含する方法によって調製される、遺伝子導入ベクター。
【請求項７】 前記方法が、ウイルスを不活性化する工程をさらに包含する、請求項５または６に記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項８】 前記界面活性剤が、オクチルグルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＣＨＡＰＳおよびＮＰ−４０からなる群から選択される、請求項７に記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項９】 前記界面活性剤が、オクチルグルコシドである、請求項８に記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項１０】 硫酸プロタミンを前記外来遺伝子に添加する工程をさらに包含する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項１１】 動物生体内の組織に遺伝子導入するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項１２】 前記組織が、肝臓、骨格筋、子宮、脳、眼部、頚動脈、皮膚、血管、肺、心臓、腎臓、脾臓、癌組織、神経、Ｂリンパ球、および呼吸器官の組織からなる群から選択される、請求項１１に記載の遺伝子導入ベクター。
【請求項１３】 遺伝子治療のための、請求項１〜１２に記載の遺伝子導入ベクターを含有する薬学的組成物。
【請求項１４】 請求項１〜１２に記載の遺伝子導入ベクターを含有する、遺伝子ライブラリーのスクリーニングのためのキット。
【請求項１５】 遺伝子導入のためのウイルスエンベロープを含む遺伝子導入ベクターの調製方法であって、以下；該ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および該混合液を２回以上凍結融解する工程、を包含する、方法。
【請求項１６】 遺伝子導入のためのウイルスエンベロープを含む遺伝子導入ベクターの調製方法であって、該ウイルスを界面活性剤の存在下で外来遺伝子と混合する工程、を包含する、方法。
【請求項１７】 ウイルスを不活性化する工程をさらに包含する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】 単離された動物組織に遺伝子を導入する方法であって、以下；所望の外来遺伝子を含有する請求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子導入ベクターを調製する工程、該遺伝子導入ベクターによって、該単離された動物組織に遺伝子を導入する工程、を包含する、方法。
【請求項１９】 浮遊細胞に外来遺伝子を導入する方法であって、以下：該浮遊細胞と請求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子導入ベクターとを、硫酸プロタミン存在下で混合する工程、該混合液を遠心する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、インビトロおよび生体内での遺伝子導入のための安全かつ高効率のベクターに関する。特に、本発明は、ウイルス、不活性化ウイルス、特に不活性化ＨＶＪ（センダイウイルス）を用いて調製する遺伝子導入ベクターに関する。また、本明細書の遺伝子導入ベクターは、遺伝子治療および高スループットスクリーニングにも使用され得る。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子治療のために、遺伝子導入のための多くのウイルスおよび非ウイルス（合成）法が開発されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０、９２６〜９３２（１９９３）およびＬｅｄｌｅｙ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第６巻、１１２９〜１１４４（１９９５））。一般に、細胞への遺伝子送達のために、ウイルス法は、非ウイルス法より効果的である。しかし、ウイルスベクターは、親ウイルスからの必須遺伝子要素の同時導入、ウイルス遺伝子のリーキーな発現、免疫原性、および宿主ゲノム構造の改変のため安全性での問題を生じ得る。一般に、非ウイルスベクターは、細胞傷害性および免疫原性がより少ない。しかし、大部分の非ウイルス法は、ウイルスベクターのいくつかに比べ、特に生体内への遺伝子導入効率はより悪い。
【０００３】従って、ウイルスおよび非ウイルスベクターの両方は、制限とともに長所を持っている。それ故、高効率および低毒性を持つ生体内への遺伝子導入ベクターを開発することで、１つのタイプのベクターシステムの制限を、別のタイプのシステムの有利な点を導入することにより補償すべきである。
【０００４】一方、ＨＶＪは免疫原性が高く、特にＮＰタンパク質が大量に産生されるとＣＴＬを誘導することが知られている（Ｃｏｌｅ、Ｇ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８、４３０１〜４３０９（１９９７））。また宿主のタンパク質合成が阻害される懸念もある。
【０００５】ＨＶＪについて、ウイルス融合タンパク質を遠心やカラム操作で融合タンパク質を精製して脂質膜に再構成する方法で作成された粒子は、再構成させることによってウイルスの持つ他のタンパク質（主としてＭタンパク質）が失われることにより、融合活性に必要なＦｌとＨＮタンパク質の比率が野生型のウイルスと同様には保たれないために、融合活性が低くなるという欠点もある。また再構成したときに融合タンパク質が脂質膜に挿入される方向性が野生型ウイルスと同様であるとは限らないために未知の抗原提示がなされる可能性もある。
【０００６】また、新たな分子を加えて再構成する方法も報告されているが（Ｕｃｈｉｄａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８０、１０〜２０、１９７９）、この方法では完成粒子の膜組成は本来のウイルス粒子とは大きく異なるために本来のウイルス機能が喪失される危険性は大きい。
【０００７】従来のＨＶＪ−リポソームに代表されるように遺伝子やタンパク質をリポソームに封入し、これと不活性化ＨＶＪを融合して作成される融合粒子を用いる方法は、培養細胞や生体組織への非侵襲の遺伝子導入を可能とし、世界的にもこの手法が動物実験レベルでは頻用されるようになった（Ｄｚａｕ，Ｖ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１１４２１〜１１４２５（１９９６）およびＫａｎｅｄａ，Ｙ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ、５、２９８〜３０３（１９９９））。しかしウイルスとリポソームという２つの異なるベシクルを準備する必要があり手法が複雑であること、リポソームと融合することによってウイルス粒子より平均直径が１．３倍大きくなった粒子は融合活性がウイルスの１０％以下に落ちてしまうことなどの欠点も合わせ持つことがわかった。
【０００８】さらに、従来のＨＶＪに基づくベクターでは、遺伝子導入が不可能な組織や極めて効率の低い組織も存在した。このことは、従来法に基づく遺伝子治療の対象となる組織を限定し得ることを示す。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】ヒト遺伝子治療のために、安全、高効率かつ簡便に調製でき、かつ広範囲の生体内組織に対して遺伝子導入が可能なウイルスベクターの開発が望まれている。
【００１０】従って、本発明の目的は、従来の再構成ＨＶＪベクター法またはＨＶＪ−リポソーム法の欠点を克服し、広範囲の培養細胞や生体組織に対する、安全、高効率かつ簡便なウイルスベースの遺伝子導入ベクターを開発することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の１つの局面において、不活性化ウイルスを使用する安全かつ高効率な遺伝子導入ベクターが提供される。ウイルスのゲノムが不活性化されている不活性化ウイルスでは、ウイルスタンパク質の複製がないため安全で細胞毒性・抗原性も低い。不活性化ウイルスを用いる遺伝子導入ベクターであるウイルスエンベロープベクター中に遺伝子を封入することにより、培養細胞や生体組織に対する、安全、高効率かつ簡便な遺伝子導入ベクターが調製される。
【００１２】本発明のさらなる局面において、広範囲の生体内組織に遺伝子導入が可能であるウイルスエンベロープベクターが提供される。１つの実施態様において、使用されるウイルスは、ＨＶＪである。本発明のウイルスエンベロープベクターによって生体内で遺伝子導入される組織としては、肝臓、骨格筋、子宮、脳、眼部、頚動脈、皮膚、血管、肺、心臓、腎臓、脾臓、癌組織、神経、Ｂリンパ球、および呼吸器官の組織が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】本発明の別の局面において、浮遊細胞に簡便に遺伝子導入する方法が提供される。本発明のウイルスエンベロープベクターを使用する、好ましい浮遊細胞への遺伝子導入方法としては、浮遊細胞とウイルスエンベロープベクターとを硫酸プロタミン存在下で混合する工程、およびその混合液に遠心力を加える工程を包含する、遺伝子導入方法が挙げられる。
【００１４】本発明の１つの局面において、本発明の遺伝子導入ベクターを用いて、大量の遺伝子を短時間で封入することによる、高効率で迅速な培養細胞及び生体組織への遺伝子導入が可能となる。従って、本発明のさらなる局面において、本発明の遺伝子導入ベクターを用いるゲノムの高スループットの大量迅速解析システムが可能となる。
【００１５】本発明の特定の局面において、遺伝子導入ベクターは、−２０℃で凍結した状態で長期間（少なくとも２〜３ヶ月以上）の保存が可能である。そしてこの遺伝子導入ベクターは、例えば凍結状態で密封し、貯蔵し、輸送することができる。
【００１６】本発明の別の局面において、インビトロにおいて好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の細胞に遺伝子導入活性を有する遺伝子導入ベクターが提供される。
【００１７】本発明のある局面において、不活性化ウイルスの調製の２ヶ月後に遺伝子導入ベクターであるウイルスエンベロープベクターを形成した場合に、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上の遺伝子導入活性を保持する遺伝子導入ベクターが提供される。
【００１８】本発明の別の局面において、生体内での局所投与において好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらにより好ましくは５０％以上、最も好ましくは６０％以上の組織中の細胞に対して遺伝子導入活性を有する遺伝子導入ベクターが提供される。
【００１９】本発明の局面において、不活性化ウイルスエンベロープを含む遺伝子導入ベクターが提供される。
【００２０】本発明の１つの局面において、遺伝子導入ベクターの調製のために使用されるウイルスは、野生型ウイルスであっても、組換え型ウイルスであってもよい。
【００２１】本発明のさらなる局面において、使用されるウイルスは、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスである。また、本発明の特定の局面において、使用されるウイルスは、ＨＶＪである。また、本発明のさらなる局面において、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７８、２８１３〜２８２０（１９９７））またはＹｏｎｅｍｉｔｓｕ，Ｙ．ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８、９７０〜９７３（２０００））に記載される組換え型センダイウイルスを用いて、遺伝子導入ベクターが調製される。
【００２２】本発明の別の局面において、動物生体内の組織に遺伝子導入するための遺伝子導入ベクターが提供される。
【００２３】本発明の遺伝子導入ベクターを調製する方法において、ウイルスを不活性化する工程は必ずしも必要ではない。従って、本発明の１つの局面において、ウイルスを不活性化する工程を行わずに、１）ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および２）この混合液を凍結融解するか、もしくはこの混合液を、さらに界面活性剤と混合する工程、を包含する方法によって遺伝子導入ベクターを作成し得る。
【００２４】本発明の別の局面において、遺伝子導入のための不活性化ウイルスエンベロープベクターの調製方法であって、以下；ウイルスを不活性化する工程、不活性化ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および混合液を凍結融解する工程、を包含する、方法が提供される。
【００２５】本発明のさらなる局面において、遺伝子導入のための不活性化ウイルスエンベロープベクターの調製方法であって、以下；ウイルスを不活性化する工程、および不活性化ウイルスを界面活性剤の存在下で外来遺伝子と混合する工程、を包含する、方法が提供される。
【００２６】本発明のさらなる局面において、使用される界面活性剤は、オクチルグルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＣＨＡＰＳおよびＮＰ−４０からなる群から選択される。
【００２７】本発明の特定の局面において、不活性化ウイルスエンベロープとの混合前に、硫酸プロタミンを外来遺伝子に添加する工程をさらに包含する、不活性化ウイルスエンベロープベクターの調製方法が提供される。
【００２８】本発明のさらなる局面において、単離された動物組織に遺伝子を導入する方法であって、以下；所望の遺伝子を含有する遺伝子導入ベクターを調製する工程、遺伝子導入ベクターによって、該動物組織に遺伝子を導入する工程、を包含する、方法が提供される。
【００２９】本発明の別の局面において、浮遊細胞に外来遺伝子を導入する方法が提供され、この方法は、以下：浮遊細胞と遺伝子導入ベクターとを、硫酸プロタミン存在下で混合する工程、混合液を遠心する工程を包含する。
【００３０】本発明のさらに別の局面において、本発明の遺伝子導入ベクターを含有する、遺伝子治療のための薬学的組成物が提供される。
【００３１】
【発明の実施の形態】（定義）本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
【００３２】本明細書で使用される場合、「遺伝子導入ベクター」、「遺伝子ベクター」または「ウイルスエンベロープベクター」とは、ウイルスエンベロープ中に外来遺伝子を封入したベクターをいう。遺伝子導入ベクターの調製のために使用されるウイルスとしては、野生型ウイルスであっても、組換え型ウイルスであってもよい。
【００３３】本発明の１つの局面において、使用されるウイルスは、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスである。また、本発明の特定の局面において、使用されるウイルスは、ＨＶＪである。
【００３４】本明細書で使用される場合、「遺伝子導入活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をいい、導入された遺伝子の機能（例えば、発現ベクターの場合、コードされるタンパク質の発現および／またはそのタンパク質の活性など）を指標として検出され得る。
【００３５】本明細書で使用される場合、「不活性化」とは、ゲノムを不活性化したウイルスをいう。この不活性化ウイルスは、複製欠損である。好ましくは、この不活性化は、ＵＶ処理またはアルキル化剤による処理によって、なされる。
【００３６】本明細書で使用される場合、「外来遺伝子」とは、遺伝子導入ベクター内に含まれる、ウイルス以外の起源の核酸配列をいう。本発明の１つの局面において、この外来遺伝子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど）と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。本発明のさらなる局面において、外来遺伝子は、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸である。
【００３７】遺伝子導入ベクター内に含まれる外来遺伝子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子であるが、導入される核酸分子は、核酸アナログ分子を含んでもよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単一の遺伝子分子種であっても、複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。
【００３８】本明細書で使用される場合、「遺伝子ライブラリー」とは、天然より単離された核酸配列または合成の核酸配列を含む、核酸ライブラリーである。天然より単離された核酸配列の供給源としては、真核生物細胞、原核生物細胞、またはウイルス由来の、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されない。天然より単離された配列に、任意の配列（例えば、シグナル、タグなど）を付加したライブラリーもまた、本発明の遺伝子ライブラリーに含まれる。１つの実施態様において、遺伝子ライブラリーは、その中に含まれる核酸配列の、転写および／または翻訳をもたらすプロモーターなどの配列を含む。
【００３９】本明細書において、「ＨＶＪ」および「センダイウイルス」は、互換可能に用いられ得る。
【００４０】本明細書において、「ＨＡＵ」とは、ニワトリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をいい、１ ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｋｅｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ４、２０９〜２１３、１９６１）。
【００４１】（遺伝子治療）治療的な核酸構築物は、本発明の遺伝子導入ベクターを用いて局所的にまたは全身的にのいずれかで投与され得る。そのような核酸構築物がタンパク質のコード配列を包含する場合、そのタンパク質の発現は、内因性の哺乳類のプロモーターまたは異種のプロモーターの使用により誘導され得る。コード配列の発現は、構成的であり得るか、または調節され得る。
【００４２】本発明の遺伝子導入ベクターを遺伝子治療のための組成物として使用する場合、本発明のベクターの投与は、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）または生理食塩水などに懸濁したベクター懸濁液の局所（例えば、癌組織内、肝臓内、筋肉内および脳内など）への直接注入か、または血管内（例えば、動脈内、静脈内および門脈内）への投与によりなされる。
【００４３】１つの実施態様において、遺伝子導入ベクターは、一般には、この遺伝子導入ベクターを単位用量注入可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして処方物の他の成分と適合性であるもの）とを混合することによって処方され得る。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤および遺伝子導入ベクターにとって有害であることが公知である他の化合物を含まない。
【００４４】キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような微量の添加物を適宜含む。このような物質は、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；単糖、二糖および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー）、またはＰＥＧを含み得る。
【００４５】遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は、代表的には、単位または多用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルにおいて、水溶液として貯蔵され得る。
【００４６】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分を満たした１以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。さらに、本発明のポリペプチドは、他の治療化合物とともに使用され得る。
【００４７】本発明の遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は医療実施基準（ｇｏｏｄｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）に一致した様式で、個々の患者の臨床状態（例えば、予防または処置されるべき状態）、遺伝子導入ベクターを含む組成物の送達部位、標的組織、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮しつつ処方され、そして投与される。従って、本明細書の遺伝子導入ベクターの「有効量」または適切な投与量は、このような考慮事項によって決定される。
【００４８】例えば、マウスに本発明の遺伝子ベクターを投与する場合、マウス一匹あたり、２０〜２０，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは６０〜６，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは２００〜２，０００ＨＡＵ相当の遺伝子ベクターが投与される。投与される遺伝子ベクター中に含有される外来遺伝子の量は、マウス一匹あたり、０．１〜１００μｇ、好ましくは０．３〜３０μｇ、より好ましくは１〜１０μｇである。
【００４９】また、ヒトに本発明の遺伝子ベクターを投与する場合、被験体あたり、４００〜４００，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは１，２００〜１２０，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは４，０００〜４０，０００ＨＡＵ相当の遺伝子ベクターが投与される。投与される遺伝子ベクター中に含有される外来遺伝子の量は、被験体あたり、２〜２，０００μｇ、好ましくは６〜６００μｇ、より好ましくは２０〜２００μｇである。
【００５０】以下の実施例は、例示であって、本発明を限定しないことが意図される。
【００５１】
【実施例】（１．凍結融解を使用する遺伝子導入ベクターの調製およびその使用）
（実施例１：凍結融解によるＨＶＪエンベロープベクターの調製）外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用い、組換えＨＶＪウイルスを様々な回数で凍結融解した後、培養細胞に遺伝子導入した。
【００５２】ＴＥ５００μ１に、７５０μｇのルシフェラーゼ発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃ（ＳａｅｋｉおよびＫａｎｅｄａら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１１、４７１〜４７９（２０００））と様々な濃度のＨＶＪウイルスを混合した。ＨＶＪウイルス濃度は、１０、２５、５０、１００ＨＡＵ／μｌに調製した。この溶液を１２分割し、それぞれをドライアイスによって４℃に保存して凍結させた後、融解することを最大３０回まで繰り返した。所定回数の凍結融解を終えた溶液を、ＢＨＫ−２１細胞（２４ウェルディッシュ、４×１０4細胞／ディッシュ、０．５ｍｌ ＤＭＥＭ，１０％ＦＣＳ）の培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ2にて２０分間反応後、ＰＢＳにより洗浄し、新たに培養液を０．５ｍｌ加えて２４時間培養した。
【００５３】培地を除去し、１×Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）５００μｌを細胞上に加えて細胞を溶解した後、マイクロチューブに移して遠心し、得られた上清２０μｌから、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ＳｙｓｔｅｍとＬｕｍａｔ ＬＢ９５０１ Ｌｕｍｉｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。測定は各溶液について３回行い、平均値を求めた。
【００５４】結果は図１に示したとおりである。組換えＨＶＪウイルスの凍結融解の回数が増加するに従ってルシフェラーゼ活性が上昇し、３回の凍結融解に比べ２０回の凍結融解では１０倍以上のルシフェラーゼ発現が観察された。この結果から、この実施例に用いた条件では、組換えＨＶＪウイルスの凍結融解の回数は好ましくは５回以上、さらに好ましくは１５〜２０回程度であることが確認された。
【００５５】（実施例２：凍結融解により調製されたＨＶＪエンベロープベクターの遺伝子導入効率）実施例１と同様の組換えＨＶＪウイルスを３０回凍結融解した後、宿主細胞に添加するウイルス数を同一条件として、細胞への遺伝子導入効率を調べた。
【００５６】結果は図２に示したとおりである。この図２において、例えばＸ軸が５００ＨＡＵの場合では、ウイルス濃度１０ＨＡＵ／μｌの溶液の添加量は５０μｌであり、１００ＨＡＵ／μｌの溶液は５μｌとなる。この図２に示したとおり、ウイルス濃度が１００ＨＡＵ／μｌの溶液は１０〜５０ＨＡＵ／μｌ濃度の場合に比較して遺伝子発現の効率が約５０％低下した。この結果から、この実施例の条件では、組換えウイルス濃度はｌ０〜５０ＨＡＵ／μｌの範囲とすることが好ましいことが確認された。
【００５７】また、組換えＨＶＪウイルスを２９回凍結融解した後、３０回目の凍結を行い、その凍結状態で１週間保存した後、融解して細胞に添加した。その結果、この１週間冷凍保存した組換えＨＶＪウイルスも、３０回の凍結融解を連続で行ったウイルスと同程度のルシフェラーゼ遺伝子発現を示した。
【００５８】（実施例３：ルシフェラーゼ発現ベクターを用いる遺伝子導入効率の測定）ルシフェラーゼ発現ベクターの量を様々に変えてＨＶＪエンベロープベクターを調製し、宿主細胞への遺伝子導入効率を調べた。
【００５９】ＨＶＪウイルス量は１μｌ ＴＥ当たり５０ＨＡＵとした。ルシフェラーゼ発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃの量は、１μｌのＴＥ当たり０．０５、０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、３．０、５．５μｇとした。最終溶液量を１００μｌとして２０回の凍結融解を行った後、実施例１と同一の方法によりルシフェラーゼ活性を測定した。
【００６０】結果は図３に示したとおりである。外来遺伝子である発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃ（約９．５ｋｂ）の添加量が１．５μｇまでは量依存的に発現量が増加し、これ以降は発現量にはほとんど変化はなかった。以上の結果から、この実施例で用いた条件では、１．５μｇ／μｌ以上の外来遺伝子ＤＮＡを遺伝子導入に用いることが好ましいことが確認された。
【００６１】（実施例４：遺伝子導入効率に対する緩衝液の種類の影響）ＨＶＪエンベロープベクター調製に用いる緩衝液の種類を変えて、宿主細胞への遺伝子導入効率を調べた。
【００６２】ＨＶＪウイルス量は緩衝液１μｌ当たり５０ＨＡＵ、ルシフェラーゼ発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃ量は１５μｇ／μｌとした。緩衝液はＴＥ、ＰＢＳ、ＢＳＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）、並びにこれらの緩衝液に最終濃度０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭのショ糖を添加したものを使用した。最終溶液量を１００μｌとして２０回の凍結融解を行った後、実施例１と同一の方法によりルシフェラーゼ活性を測定した。
【００６３】結果は図４に示したとおりであり、この実施例で用いた条件では、組換えＨＶＪウイルスの調製のための緩衝液としてはＴＥ単独が好ましいことが確認された。
【００６４】（実施例５：ＡＶＥ（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｖｉｒａｌ Ｅｎｖｅｌｏｐ）型のベクターと本願発明のＨＶＪエンベロープベクターとの比較）従来の遺伝子導入ベクターである不活性化ＨＶＪ−リポソーム（最も遺伝子導入効率の優れたＡＶＥ型（Ｓａｅｋｉ，Ｙ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、８、２１３３〜２１４１（１９９７））を用いた遺伝子導入と、この発明の方法とを比較した。
【００６５】ＨＶＪ一リポソームまたはＨＶＪウイルス量はＴＥ １μｌ当たり５０ＨＡＵ、ルシフェラーゼ発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃの量は１．５μｇ／μｌとした。また、組換えＨＶＪウイルスの凍結融解の回数は２回または１５回とした。その他の条件は、宿主細胞をヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３とした以外は実施例１と同様とした。
【００６６】結果は図５に示したとおりである。ＨＶＪエンベロープベクターの凍結融解を１５回繰り返すこの発明の方法は、遺伝子導入効率においてＨＶＪ一リポソームを用いた従来方法よりはるかに優れていることが確認された。
【００６７】（実施例６：合成オリゴヌクレオチドの導入効率）ＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレッセイン）で蛍光標識した合成オリゴヌクレオチド（２０ｂｐ）を１ｍｇ／ｍ１の濃度で不活性化ＨＶＪウイルスと混合し、この溶液を２０回凍結融解した後、ＢＨＫ−２１細胞と２０分間反応させた。１７時間後に蛍光シグナルを観察した結果、ほぼ１００％の細胞の核内に蛍光の集積が認められた。この結果から、この発明の方法は、合成核酸の細胞内導入にも有効であることが確認された。
【００６８】（実施例７：ＧＦＰ遺伝子の導入効率）ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）遺伝子と不活性化ＨＶＪウイルスの混合溶液を２０回凍結融解した後、２ｎｇ−５μ１をラット大脳に注入した。その結果、注入部位に蛍光シグナルが観察された。また、ＧＦＰ遺伝子によるＨＶＪエンベロープベクターを凍結して３ヶ月保存した後、ラット大脳に注入したが、同じく注入部位にＧＦＰ遺伝子発現による蛍光シグナルが観察された。
【００６９】以上の結果から、この発明の方法は、生体内においても確実に遺伝子導入が可能であることが確認された。また、ＨＶＪエンベロープベクターの凍結保存が可能であることも確認された。
【００７０】（２．界面活性剤を使用する遺伝子導入ベクターの調製およびその使用）
（実施例８：界面活性剤を用いる不活性化ＨＶＪエンベロープベクターの調製）界面活性剤を用いる不活性化ＨＶＪエンベロープベクターの調製方法の概略を図６に示す。
【００７１】（１：ＨＶＪの増殖）ＨＶＪは鶏の受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織へのウイルスの持続感染系（トリプシンなどの加水分解酵素を培養液中に添加）を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたもの、全てが利用可能である。
【００７２】本実施例において、ＨＶＪの増殖を以下のようにおこなった。
【００７３】ＨＶＪの種ウイルスを、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）の受精卵を使って増殖させ分離・精製したＨＶＪ（Ｚ種）を細胞保存用チューブに分注し、１０％ ＤＭＳＯを加えて液体窒素中に保存し、調製した。
【００７４】受精直後のニワトリ卵を入荷し、インキュベーター（ＳＨＯＷＡ−ＦＵＲＡＮＫＩ Ｐ−０３型；約３００鶏卵収容）にいれ、３６．５℃，湿度４０％以上の条件で１０〜１４日飼育した。暗室中で、検卵器（電球の光が口径約１．５ｃｍの窓を通して出るようになっているもの）を用いて、胚の生存及び気室と漿尿膜を確認し、漿尿膜の約５ｍｍ上方に鉛筆でウイルス注入箇所の記しをつけた（太い血管を除いた場所を選定する）。ポリペプトン溶液（１％ポリペプトン、０．２％ ＮａＣｌを混合し、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整してオートクレーブ滅菌し、４℃保存したもの）で種ウイルス（液体窒素からとりだしたもの）を５００倍に希釈し、４℃においた。卵をイソジン及びアルコールで消毒し、ウイルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウイルス０．ｌｍｌを２６ゲージの針付き１ｍｌシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。溶かしたパラフィン（融点５０〜５２℃）をパスツールピペットを用いて孔の上に置きこれをふさいだ。卵をインキュベーターにいれ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で３日飼育した。次に、接種卵を一晩４℃においた。翌日、卵の気室部分をピンセットで割り、１８ゲージの針を付けた１０ｍｌシリンジを漿尿膜の中にいれて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、４℃に保存した。
【００７５】（２：ＨＶＪの精製）ＨＶＪは、遠心分離による精製方法、カラムによる精製方法、または当該分野において公知のその他の精製方法によって、精製され得る。
（２．１：遠心分離による精製方法）手短には、増殖させたウイルス液を回収し低速遠心で培養液や漿尿液中の組織・細胞片を除去した。その上清を高速遠心（２７，５００×ｇ，３０分間）とショ糖密度勾配（３０〜６０％ｗ／ｖ）を利用した超遠心（６２，８００×ｇ，９０分間）により精製した。精製の間にウイルスをできるだけ穏和に扱い、４℃で保存することに注意すべきである。
【００７６】本実施例において、具体的には、以下の方法によってＨＶＪを精製した。
【００７７】ＨＶＪ含有漿尿液（ＨＶＪ含有のニワトリ卵の漿尿液を集め４℃にて保存）の約１００ｍ１を広ロの駒込ピペットで５０ｍｌの遠心チューブ２本に入れ（Ｓａｅｋｉ，Ｙ．，およびＫａｎｅｄａ，Ｙ：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｅｄｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ＨＶＪ−１ｉｐｏｓｏｍｅｓ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ，ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｈａｎｄｂｏｏｋ（第２版）Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（Ａｃａｄｃｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ）第４巻、１２７〜１３５，１９９８を参照のこと）、低速遠心機で３０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、卵の組織片を除去した。
【００７８】遠心後、上清を３５ｍｌ遠心チューブ４本（高速遠心用）に分注し、アングルローターで２７，０００ｇ，３０分遠心した（アクセル、ブレーキはオン）。上清を除き、沈殿にＢＳＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ ＮａＣ１、５．４ｍＭ ＫＣ１；オートクレーブし、４℃保存）（ＢＳＳのかわりにＰＢＳでも可能）をチューブ当たり約５ｍｌ加え、そのまま４℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐし１本のチューブに集め、同様にアングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心した。上清をのぞき沈殿にＢＳＳ約１０ｍｌを加え、同様に４℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐし、低速遠心機で３０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、除ききれなかった組織片やウイルスの凝集塊をのぞいた。上清を新しい滅菌済みチューブに入れ精製ウイルスとして４℃で保存する。
【００７９】このウイルス液０．ｌｍｌにＢＳＳを０．９ｍｌ加え、分光光度計で５４０ｎｍの吸収を測定し、ウイルス力価を赤血球凝集活性（ＨＡＵ）に換算した。５４０ｎｍの吸収値１がほぼ１５，０００ＨＡＵに相当した。ＨＡＵは融合活性とほぼ比例すると考えられる。また実際にニワトリ赤血球液（０．５％）を用いて、赤血球凝集活性を測定してもよい（動物細胞利用実用化マニュアル、ＲＥＡＬＩＺＥ ＩＮＣ．（内田、大石、古沢編集）Ｐ２５９〜２６８、１９８４を参照のこと）。
【００８０】さらにショ糖密度勾配を用いたＨＶＪの精製も必要に応じて行い得る。具体的には、ウイルス懸濁液を６０％、３０％のショ糖溶液（オートクレーブ滅菌）を重層した遠心チューブにのせ、６２，８００×ｇで１２０分間密度勾配遠心を行う。遠心後、６０％ショ糖溶液層上にみられるバンドを回収する。回収したウイルス懸濁液をＢＳＳもしくはＰＢＳを外液として４℃で透析を一晩行い、ショ糖を除去する。すぐに使用しない場合は、ウイルス懸濁液にグリセロール（オートクレーブ滅菌）と０．５Ｍ ＥＤＴＡ液（オートクレーブ滅菌）をそれぞれ最終濃度が１０％と２〜１０ｍＭになるように加えて−８０℃で穏やかに凍結し、最終的に液体窒素中で保存する（凍結保存はグリセロ一ルと０．５Ｍ ＥＤＴＡ液の代わりに１０ｍＭ ＤＭＳＯでも可能）。
（２．２：カラムおよび限外濾過による精製方法）遠心分離による精製方法に代えて、カラムによるＨＶＪの精製も本発明に適用可能である。
【００８１】手短には、分子量カットオフが５０，０００のフィルターによる限外濾過による濃縮（約１０倍）とイオン交換クロマトグラフィー（０．３Ｍ〜ｌＭ ＮａＣｌ）による溶出を用いて精製した。
【００８２】具体的には、本実施例において、以下の方法を使用して、ＨＶＪをカラムによって精製した。
【００８３】漿尿液を採集した後、８０μｍ〜１０μｍのメンブランフィルターにてろ過した。０．００６〜０．００８％ ＢＰＬ（最終濃度）を漿尿液に加え（４℃、１時間）、ＨＶＪを不活性化した。漿尿液を３７℃、２時間インキュベートすることによって、ＢＰＬを不活性化した。
【００８４】５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法により約１０倍濃縮した。緩衝液として、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２％マンニトール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）を用いた。ＨＡＵアッセイにより、ほぼ１００％のＨＶＪ回収率であり優れた結果がえられた。
【００８５】ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテクＫＫ、Ｔｏｋｙｏ）によるカラムクロマトグラフィー法（緩衝液：２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２〜１Ｍ ＮａＣｌ）でＨＶＪを精製した。４０〜５０％の回収率であり、純度は９９％以上であった。
【００８６】５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法によりＨＶＪの画分を濃縮した。
【００８７】（３：ＨＶＪの不活性化）ＨＶＪの不活性化が必要な場合、以下に記載するように、紫外線照射またはアルキル化剤処理により行った。
【００８８】（３．１：紫外線照射法）ＨＶＪ懸濁液１ｍｌを３０ｍｍ径のシャーレにとり、９９または１９８ミリジュール／ｃｍ2を照射した。ガンマー線照射も利用可能である（５〜２０グレイ）が完全な不活性化がおこらない。
【００８９】（３．２：アルキル化剤による処理）使用直前に、１０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ中に０．０１％ β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温下に保ち素早く作業を行った。
【００９０】精製直後のＨＶＪの懸濁液に最終０．０１％になるようにβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で６０分間でインキュベートした。その後２時間、３７℃でインキュベートした。エッペンドルフチューブにチューブあたり１０，０００ＨＡＵ分ずつ分注し、１５，０００ｒｐｍ，１５分遠心し、沈殿を−２０℃で保存する。上記の不活性化法によらず、沈殿を−２０℃で保存せず、そのまま界面活性剤処理によりＤＮＡを取り込ませ、ベクターを作成することも可能である。
【００９１】（４：ＨＶＪエンベロープベクターの作成）保存してあったＨＶＪに外来ＤＮＡ２００〜８００μｇを含む溶液９２μｌを加えてピペッティングでよく懸濁した。この溶液は、−２０℃で、少なくとも、３ヶ月保存可能である。ＨＶＪとの混合前にＤＮＡに硫酸プロタミンを添加すると、発現効率が２倍以上増強した。
【００９２】この混合液を氷上に１分間置き、オクチルグルコシド（１０％）を８μｌ加えて１５秒氷上でチューブを振盪し、４５秒氷上に静置した。界面活性剤での処理時間は、１〜５分間が好ましい。オクチルグルコシド以外に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ＮＰ−４０（ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）などの界面活性剤も使用し得る。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＮＰ−４０およびＣＨＡＰＳの好ましい最終濃度は、それぞれ、０．２４〜０．８０％、０．０４〜０．１２％および１．２〜２．０％である。
【００９３】冷ＢＳＳを１ｍｌ添加し、すぐに１５，０００ｒｐｍで１５分遠心した。生じた沈殿にＰＢＳまたは生理食塩水などを３００μｌ加えて、ボルテックス、ピペッティングで懸濁した。懸濁液は直接遺伝子導入に使用することも、−２０℃で保存後に遺伝子導入に使用することも可能である。このＨＶＪエンベロープベクターは、少なくとも２ヶ月間の保存後、同程度の遺伝子導入効率を維持した。
【００９４】（実施例９：ＨＶＪエンベロープベクターにおけるＦｌとＨＮタンパク質の比率）
（１：サンプルの調製）
（ｉ）精製ＨＶＪ １０，０００ＨＡＵ相当を１５，０００ｒｐｍ，１５分間遠心し、沈殿を３００μｌのＰＢＳに懸濁し−２０℃に保存した。
（ｉｉ）精製ＨＶＪ １０，０００ＨＡＵ相当を紫外線照射（１９８ミリジュール／ｃｍ2）後、１５，０００ｒｐｍ，１５分間遠心し、沈殿を３００μｌのＰＢＳに懸濁し−２０℃で保存した。
（ｉｉｉ）精製ＨＶＪ １０，０００ＨＡＵ相当を紫外線照射（１９８ミリジュール／ｃｍ2）後、１５，０００ｒｐｍ，１５分間遠心し、沈殿にｐｃＬｕｃｉＤＮＡ２００μｇ（溶液９２μｌ）を加えて、ピペッテングで懸濁した。氷上に置き、オクチルグルコシド（１０％）を８μ１加えて、１５秒間、手でチューブを振盪し、４５秒間氷上静置し、冷ＢＳＳを１ｍｌ加えて、すぐに１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心後、３００μｌのＰＢＳに懸濁し−２０℃で保存した。
【００９５】（２：タンパク質電気泳動）３種類のサンプルの５、１０、２０μｌに×５のＬａｅｍｌｉサンプル緩衝液を加え１０％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳動終了後、クマシーブルーで染色し、脱染色後、セロファン紙に張り付けて乾燥させた。
【００９６】（３：タンパク質同定）電気泳動し、染色したサンプルをＬＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ）に取り込ませ（図７）、Ｆ１，ＨＮ相当のタンパク質バンドの濃度を測定した。１種類のサンプルにつき、３つの異なる量を泳動し、各々のＦ１／ＨＮ密度を算出し、サンプル毎に平均と標準偏差を求めた。
【００９７】（４：結果）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のサンプルでＦ１／ＨＮは、ほぼ１．７で一致した。Ｆ１ ５１ｋＤ、ＨＮ ６８ｋＤａの分子量を考慮すれば、モル比は約２．３となる。Ｆ１、ＨＮを用いた再構成リポソームでの融合の最適値が、Ｆ１／ＨＮが約２で与えられるという報告（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１４２、９５〜１０１、１９８５）とも矛盾しない。他の研究者から報告のある再構成型ではこの比が野生型ウイルスのものと異なる（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、３３１２〜３３１８、１９９３）。その他のタンパク質組成もＨＶＪとＨＶＪエンベロープベクターではほぼ同じであった。
【００９８】（実施例１０：ＨＶＪエンベロープベクターへのＤＮＡの封入及び封入率）
（１：ＨＶＪエンベロープベクター（ＤＮＡ封入、未封入）の電子顕微鏡像）前述のようにしてｐＳＦＶ−ＬａｃＺ（１４．５ｋｂ）１３０μｇを１０，０００ＨＡＵのＨＶＪ（紫外線不活性化）に封入しＨＶＪエンベロープベクターを作成した。
【００９９】封入後のＨＶＪエンベロープベクターを３００μｌのＰＢＳに懸濁し−２０℃で保存した。１０日後、１μｌの懸濁液をグリッド上にのせ、陰性染色法にて電子顕微鏡を用いて観察した。コントロールとしてＤＮＡ未封入のＨＶＪエンベロープベクターを用いた。
【０１００】（結果）結果を、図８に示す。ＨＶＪエンベロープベクターは、かつて観察されたＨＶＪウイルスそのものとほぼ外郭は同型のものが多かった。ＤＮＡ未封入のものに比較し、ＤＮＡを用いたものはＨＶＪエンベロープベクター内に電子密度の濃い構造物を認めた。一方、未封入のものは内部の透過性は高く、ウイルスゲノムが破壊されたか、喪失されたと推定された。
【０１０１】（２：ＨＶＪエンベロープベクターへのＤＮＡ封入率）前述のようにしてｐｃＬｕｃｉ（７．４ｋｂ）１５７μｇを６，７００ＨＡＵのＨＶＪ（紫外線不活性化）に封入して、ＨＶＪエンベロープベクターを作成した。ＨＶＪエンベロープベクターを、３００μｌのＢＳＳに懸濁し、ミクロコッカルヌクレアーゼ１５単位、ＣａＣｌ2 ２ｍＭ、ＲＮａｓｅＡ ２０μｇ／ｍｌ、２０℃、３０分間処理し、ＰＢＳ １リットルに対して透析した（４℃、オーバーナイト）。１％ＳＤＳ、３７℃で、ｌ分間処理した。５００μｌのフェノール、５００μｌクロロホルム−イソアミルアルコールで処理し、その後、エタノール沈殿した。１００μｌのＢＳＳに懸濁し、分光光度計で２６０ｎｍ，２８０ｎｍを測定した。
【０１０２】（結果）回収率が８５．７％であったので、換算すると、ＨＶＪエンベロープベクター中へのＤＮＡの取り込み効率は、３．８％であった。１０，０００ＨＡＵのＨＶＪに、２７９μｇのｐｃＬｕｃｉを取り込ませた場合の取り込み効率は、７．２％であった。
【０１０３】以上より１０，０００ＨＡＵのＨＶＪへのＤＮＡ取り込み効率は、オクチルグルコシドを用いた場合約６〜７％であろうと推定されるが、用いるＤＮＡ量によって多少変化する可能性がある。また硫酸プロタミンをＤＮＡ、ＨＶＪエンベロープベクターと共存させると導入効率が上昇することがわかっているが、これはＨＶＪエンベロープベクターへのＤＮＡ封入効率が上昇したためではないかと考えられる。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００，ＮＰ−４０ではさらに効率が上がり１０〜４０％程度と推定される。
【０１０４】（実施例１１：ＨＶＪエンベロープベクターによる細胞内への遺伝子導入）
（１：遺伝子導入方法）１，０００ＨＡＵ分をエッペンドルフチューブにとり（３０μｌ）、硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）５μ１を加えた。ＢＨＫ−２１細胞（前日に、ウェルあたり２００，０００個で、６つのウェルにまいたもの）の培地を交換し、１ウェルあたり０．５ｍｌの培地（１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）を添加した。各ウェルに、上記のベクター（１，０００ＨＡＵ相当）と硫酸プロタミンの混合液を加え、プレートを前後左右にふってベクターと細胞を良く混ぜ合わせ、３７℃で、５％ＣＯ2インキュベーター中に１０分間放置した。
【０１０５】培地交換し、３７℃で、５％ＣＯ2インキュベーター中でオーバーナイト（１６ｈｒ〜２４ｈｒ）放置し、遺伝子発現を調べた。ルシフェラーゼ（ｐｃＬｕｃｉ；ＣＭＶプロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子）の場合は、ＣｅｌｌＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５ｍｌで細胞を溶解し、その２０μｌ溶液中の活性をルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。グリーン蛍光タンパク質（ｐＣＭＶ−ＧＦＰＥ；Ｐｒｏｍｅｇａ）の場合は、そのまま蛍光顕微鏡で観察し、４００倍率で５〜８視野を観察し、蛍光を発する細胞の割合を算出した。
【０１０６】（２：培養細胞における導入効率に与える条件の検討）培養細胞はＢＨＫ−２１細胞を用いた。
【０１０７】（２．１：ＨＶＪエンベロープベクター作成におけるオクチルグルコシド（ＯＧ）濃度の検討）（１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＨＶＪエンベロープベクターによる遺伝子導入に対する、各濃度（ＨＶＪエンベロープベクターの作成時に用いたＯＧの最終濃度）のオクチルグルコシド（ＯＧ）の影響を調べた：（Ａ）オクチルグルコシド濃度：１、２、３％；
ＨＶＪエンベロープベクター作成時に、不活性化ＨＶＪをＯＧによって処理した時間：１分間、５分間、１０分間；
超音波処理を行ったか（ｓｏｎｉｃ）、または行わなかった。
（Ｂ）オクチルグルコシド濃度：０．１２５〜１．２５％；
トランスフェクションに用いたベクターの容量：１０μｌ、１００μｌ。
（Ｃ）オクチルグルコシド：０．５５〜０．８％；
トランスフェクションの時間：３０分間、オーバーナイト（Ｏ／Ｎ）。
結果を図９に示す。
【０１０８】（２．２：細胞への遺伝子導入条件、硫酸プロタミン（ＰＳ）の濃度・処理時間）
（１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＨＶＪエンベロープベクターによる遺伝子導入に対する、硫酸プロタミンの影響を調べた：（Ａ）硫酸プロタミン：０〜１００μｇ／ｍｌ培地；
トランスフェクションの時間：２０、４０、６０分間。
（Ｂ）硫酸プロタミン：０〜４０μｇ／ｍｌ培地；
トランスフェクションの時間：５、１０、２０分間。
結果を図１０に示す。
【０１０９】（２．３：ＨＶＪエンベロープベクターに封入するＤＮＡ濃度の遺伝子発現量に対する効果）（１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＨＶＪエンベロープベクターによる遺伝子発現量に対する、実験に使用したＤＮＡ量の影響を調べた：（Ａ）ＤＮＡ量：２０〜２００μｇ；ＨＶＪエンベロープベクターを−２０℃または−８０℃で５日間保存した。
（Ｂ）ＤＮＡ量：１８０〜３６０μｇ／ＨＶＪ １０，０００ＨＡＵ。
結果を図１１に示す。
【０１１０】（２．４：遺伝子導入に用いるＨＶＪ力価の、遺伝子発現量に対する影響）（１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＨＶＪエンベロープベクターによる遺伝子発現量に対する、遺伝子導入に用いるＨＶＪ力価の影響を調べた：５，０００、１０，０００、２０，０００ＨＡＵの力価のＨＶＪを用いてＨＶＪエンベロープベクターを調製し、その各々の、２５０、５００、１，０００、２，０００ＨＡＵに相当する量を用いて、ＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした。結果を図１２に示す。
【０１１１】（２．５：ＨＶＪエンベロープベクター遺伝子導入効率に対する、ＨＶＪ不活性化条件の影響）（１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＢＨＫ−２１細胞中でのルシフェラーゼ遺伝子発現に対する、ＨＶＪの不活性化方法（ＵＶまたはβ−プロピオラクトン）の効果を調べた。
（Ａ）ＵＶ不活性化のための照射量：０〜２３１ミリジュール／ｃｍ2。
（Ｂ）ＨＶＪ処理に用いたβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）濃度：０〜０．０２５％。
結果を図１３に示す。
【０１１２】（実施例１２：ＨＶＪエンベロープベクターの各種細胞への遺伝子導入）ヒト舌部の扁平上皮癌（ＳＡＳ）へ、実施例１１に記載の方法により遺伝子導入を行った。結果を図１４に示す。遺伝子導入の際の、硫酸プロタミン濃度およびトランスフェクション時のインキュベーション時間を、図１４に記載のように変化させ、遺伝子導入の効率を、ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって測定した。トランスフェクションを行った条件の範囲内では、２００μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンを使用し、６０分間のトランスフェクション処理をした場合に遺伝子導入効率が最大であったが、硫酸プロタミン濃度をさらに増加させれば、遺伝子導入効率のさらなる増加が予測される。
【０１１３】ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）へ、実施例１１に記載の方法により遺伝子導入を行った。結果を図１５に示す。遺伝子導入の際の、硫酸プロタミン濃度およびトランスフェクション時のインキュベーション時間を、図１５に記載のように変化させ、遺伝子導入の効率を、ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって測定した。トランスフェクションを行った条件の範囲内では、１００μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンを使用し、６０分間のトランスフェクション処理をした場合に遺伝子導入効率が最大であったが、硫酸プロタミン濃度をさらに増加させれば、遺伝子導入効率のさらなる増加が予測される。
【０１１４】（実施例１３：ＨＶＪエンベロープベクターの各種生体組織内への遺伝子導入）本実施例では、実施例１１に記載のＨＶＪエンベロープベクターを用いる、種々の生体内組織への遺伝子導入を例示する。
【０１１５】（１３．１：マウス肝臓）ＨＶＪエンベロープベクターを、０．８％のオクチルグルコシドおよび２００μｇのｐｃＬｕｃｉを氷上に１分間放置し、そして３００μｌのＰＢＳに懸濁することによって調製した。調製懸濁液の１／１０量（１，０００ＨＡＵに相当）３０μｌを、７０μｌのＰＢＳで希釈し（全量１００μｌ）、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）肝臓の葉（ｌｏｂｅ）の１つに注入した。
【０１１６】ＨＶＪ−ＡＶＥ（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｖｉｒａｌ Ｅｎｖｅｌｏｐ）リポソームを、２００μｇのｐｃＬｕｃｉを用いて、ボルテックス／排出（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ／ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）、その後のスクロース勾配遠心分離（６２，０００ｇ、９０分間）によって調製した。次に、この調製物を、遠心分離（２７，０００ｇ、３０分間）によってペッレトとし、そして５００μｌのＰＢＳ中に懸濁した。このサンプルの１００μｌをマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）肝臓の葉（ｌｏｂｅ）の１つに注入した。
【０１１７】２４時間後、注入された肝臓葉を単離して、その葉のルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａ社のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いてアッセイした。結果を図１６Ａに示す。この結果から、明らかなように、本発明のＨＶＪエンベロープベクターは、従来のＨＶＪ−ＡＶＥリポソームと比べて約２倍の顕著に高い遺伝子導入効率を示した。
【０１１８】（１３．２：マウス子宮）１３．１と同様にＨＶＪエンベロープベクターを調製した。５０μｌと１００μｌのサンプルを、ＰＢＳで希釈して５００μｌとし、マウスのファローピウス管に注入し、子宮頸を１０分間結紮した。２４時間後、マウス子宮を単離して、葉および子宮のルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いてアッセイした。結果を図１６Ｂに示す。本発明のＨＶＪエンベロープベクターによって、マウス子宮への遺伝子導入が可能であったが、ＨＶＪ−ＡＶＥリポソームを用いた方法では、検出可能な程度の子宮組織への遺伝子導入が見出されなかった。
【０１１９】ｐｃＬｕｃｉを含有するＨＶＪエンベロープベクターを１３．１と同様に調製した。ＬａｃＺ発現のために、ｐＥＢ−ＣＭＶ−ＬａｃＺ（１３ｋｂ）を含有するＨＶＪエンベロープベクターを、２００μｇのプラスミドを使用して調製した。これら各ベクターを含有するＨＶＪエンベロープベクターを上記のように子宮に注入した。結果を、図１６Ｃに示す。ＬａｃＺ染色によって、主に子宮内膜の腺上皮でのＬａｃＺ遺伝子の発現が検出された。
【０１２０】（１３．３：ラット脳）上記に記載のｐｃＬｕｃｉを含有するＨＶＪエンベロープベクターを調製したのと同様の方法によって、ｐＥＧＦＰ−１（クラゲのグリーン蛍光タンパク質遺伝子（約０．７ｋｂ）を、サイトメガロウイルスプロモーターを有する発現ベクターに組み込んだベクター；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡより入手可能）を含有するＨＶＪエンベロープベクターを調製した。３０μｌのベクター（調製物の１／１０であり、１，０００ＨＡＵに相当）をＳＤラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）に、頸動脈注入、または大槽より髄腔内注入した。遺伝子導入の３〜４日後、ラットを屠殺し、脳切片を固定化することなく調製し、そして蛍光顕微鏡下で蛍光を観察した。図１６Ｄに示される結果のように、頚動脈注入及び大槽より髄腔内注入のいずれの場合も、脳内におけるグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現が認められた。これに対して、ＨＶＪ−ＡＶＥリポソームを用いて、同様の遺伝子導入をラット頚動脈より行った場合、脳内でのＧＦＰ発現は、認められなかった。
【０１２１】（１３．４：ウサギ眼）ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位にヒトＨＧＦ（肝細胞増殖因子）遺伝子の変異体であるＮＫ４ ｃＤＮＡ（１．４ｋｂ）をクローニングして構築されたｐＣＭＶ−ＮＫ４を、大阪大学医学系研究科の中村敏一教授らより分与していただいた。
【０１２２】４００μｇまたは８００μｇいずれかのｐＣＭＶ−ＮＫ４を用いて、１０，０００ＨＡＵの不活性化ＨＶＪを用いた以外は、上記に記載のｐｃＬｕｃｉを含有するＨＶＪエンベロープベクターを調製したのと同様の方法によって、ＨＶＪエンベロープベクターを調製した。ｐＣＭＶ−ＮＫ４は、ＨＧＦ機能を阻害する変異型ＨＧＦを発現するベクターである。５０μｌのベクター（調製物の１／６）を、新血管形成を誘導するために組換えＶＥＧＦのペレットで処理した、ウサギの角膜組織中に注入した。処置の７日後、ウサギを、屠殺し、目の中の新血管形成を観察した。結果を図１６Ｅに示す。ｐＣＭＶ−ＮＫ４が容量依存的にＶＥＧＦによって誘導された血管新生を抑制した。
【０１２３】（１３．５：ラット肺動脈）上記に記載のｐｃＬｕｃｉを含有するＨＶＪエンベロープベクターを調製したのと同様の方法によって、ＳＶ４０プロモーターの制御下のＬａｃＺ遺伝子を有するｐＳＶ−ＬａｃＺ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含有するＨＶＪエンベロープベクターを調製した。５０μｌのベクター（調製物の１／６）をラットの気管に注入した。遺伝子導入の３日後、ラットを屠殺し、組織を１％のグルタルアルデヒドを用いて固定化し、動脈中のＬａｃＺの発現を、Ｘ−ｇａｌを用いて可視化した。結果を図１６Ｆに示す。気管支上皮にＬａｃＺ染色を認めた。また、肺動脈からＨＶＪエンベロープベクターを導入したときも気管支上皮に遺伝子発現を認めた（データを示さず）。
【０１２４】（実施例１４：ウイルスエンベロープベクターのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）としての機能）本発明の遺伝子導入ベクターは、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸治療のためのドラッグデリバリーシステムとしても有用である。
【０１２５】（１４．１：蛍光オリゴヌクレオチドの導入）本発明のウイルスエンベロープベクターを使用して、細胞への蛍光標識オリゴヌクレオチドの導入を行った。
【０１２６】ＦＩＴＣで５’をラベルした２０マーのオリゴヌクレオチド（５’−ＣＣＴＴｇＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’）１９４μｇ／９２μ１ ＢＳＳを１０，０００ＨＡＵのＨＶＪ（紫外線１９８ミリジュール／ｃｍ2で不活性化）の沈殿と混合し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２４％、最終濃度）を添加し、氷上で１分間処理し、１ｍｌのＢＳＳを加えて、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した。沈殿に１００μｌのＰＢＳを加えて、−２０℃保存した。１ヶ月後、融解し、１０μｌ分を５μｇの硫酸プロタミンと混合し、５００万個のＢＨＫ−２１細胞（０．５ｍｌ倍地中）とインキュベート（１０分、６０分）した。導入翌日に蛍光顕微鏡で細胞の蛍光を観察したところ、図１７Ｂに示すように、１０分では１０％程度のオリゴヌクレオチド導入効率であったが、図１７Ａに示すように、６０分では８０％以上の細胞にオリゴヌクレオチドが導入されていた。
【０１２７】（１４．２：Ｓｔａｔ６デコイ核酸による接触性皮膚炎の治療）本発明のウイルスエンベロープベクターを使用して、細胞へのデコイ核酸の導入を行った。
【０１２８】Ｓｔａｔ６のＤＮＡ結合配列をもつ二重鎖核酸（５’−ＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＴＣＴＡＴ−３’および３’−ＣＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＴＴＣＴＴＡＧＡＴＡ−５’、（Ｗａｎｇ，ＬＨら、：Ｂｌｏｏｄ ９５、１２４９〜１２５７、 ２０００））２５０μｇ／３００μｌ ＢＳＳを３０，０００ＨＡＵのＨＶＪ（紫外線９９ミリジュール／ｃｍ2で不活性化）の沈殿と混合し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（最終濃度 ０．２４％）を添加し、氷上で１分間処理し、ｌｍｌのＢＳＳを加えて、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）した。沈殿に３００μｌのＰＢＳを加えて−２０℃保存した。このＨＶＪエンベロープベクターを、マウスの皮下注入に用いたところ、ＩｇＥ誘発のアレルギーと遅延型皮膚反応を抑制した。
【０１２９】（実施例１５：浮遊系細胞への遺伝子導入）ヒト白血病細胞様であるＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＮＡＬＭ−６、Ｋ−５６２を対象として遺伝子導入実験を行った。
【０１３０】ｐＣＭＶ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ２００μｇ（９２μｌ）を１０，０００ＨＡＵの不活性化ＨＶＪ（紫外線９９ミリジュール／ｃｍ2）の沈殿と混合し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２４％、最終濃度）を加え、氷上で１分間処理し、１ｍｌのＢＳＳを加えて、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した。沈殿に３００μｌのＰＢＳを加えてＨＶＪエンベロープベクターを調製した。ベクター６０μｌ（２，０００ＨＡＵ相当）、硫酸プロタミン、および４００万個の浮遊系細胞を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で混合し、１０，０００〜１５，０００ｒｐｍ、１０分、２０℃の遠心を行った。その後、沈殿に培養液を加え、培養皿に移し、１日後に細胞のルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１３１】使用した細胞株は、ＨＶＪ−リポソームや既存のリポソーム試薬（ＧｉｂｃＢＲＬのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅなど）を用いた場合には導入効率が極めて低い細胞株（特にＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＮＡＬＭ−６）であるが、図１８に示すように、これら細胞株に対する高効率の遺伝子導入が観察された。
【０１３２】好ましい遺伝子導入の条件は、硫酸プロタミン６００〜１，０００μｇ／ｍｌを添加し、遠心は１０，０００ｒｐｍまたは１５，０００ｒｐｍで、１０分間、２０℃での遠心をする条件であった。ＨＶＪエンベロープベクターによる有意な細胞毒性は認められなかった。また、遠心と硫酸プロタミンの添加の両方が、遺伝子導入に必要であった。
【０１３３】（実施例１６：癌組織への遺伝子導入）ｐＣＭＶ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ３５４μｇ（９２μｌ）を３４，０００ＨＡＵの不活性化ＨＶＪ（紫外線９９ミリジュール／ｃｍ2）の沈殿と混合し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２４％、最終濃度）を添加して、氷上で１分間処理し、１ｍｌのＢＳＳを加えて、遠心（１０，０００〜１５，０００ｒｐｍ、１０分間、２０℃）した。沈殿に３００μｌのＰＢＳを加えて、−２０℃で保存した。１日後、硫酸プロタミン５００μｇ／ｍｌ、または１０００μｇ／ｍｌと混合し、その１００μ１をマウスメラノーマＢ１６−Ｆｌの腫瘍塊（径７〜８ｍｍ）に注入し、１日後にルシフェラーゼ活性を測定した。図１９に示すように、腫瘍塊での遺伝子発現がみられた。好ましい硫酸プロタミン濃度は、５００μｇ／ｍｌであった。しかし、これより低い硫酸プロタミン濃度では、遺伝子発現を検出できなかった。
【０１３４】（実施例１７：ヘルペスウイルスエンベロープベクターの調製）
（１７．１：不活性化ウイルスの調製）１型単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ−１）（１０10プラーク形成単位／ｍ１）を大阪大学医学系研究科細菌学講座の山西教授より供与された。このウイルスの不活性化条件を培養サル細胞（Ｖｅｒｏ細胞）におけるウイルスのプラーク形成により検討した。β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）０．０５％を用いたウイルスの不活性化では、Ｖｅｒｏ細胞でのプラークの出現頻度が、９．ｌ×ｌ０-4（プラーク／Ｖｅｒｏ細胞）であった。一方、紫外線２００および４００ミリジュール／ｃｍ2照射でのウイルスの不活性化は、それぞれ４．３×１０-4、２．２×１０-6（プラーク／Ｖｅｒｏ細胞）であった。
【０１３５】（１７．２：不活性化ウイルスを用いる遺伝子導入）１００μ１のＨＳＶ−１（１０9粒子）を６２０μ１のＰＢＳで希釈後、紫外線４００ミリジュール／ｃｍ2照射し、その１０％量（７２μ１）とＤＮＡ（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ８．８３μｇ／μｌ）と混合し、氷上で３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を８μ１加え（最終濃度、０．２４％）、その１、２、３、４、５、６分後に１ｍｌのＰＢＳを添加して希釈した。各サンプルの１００μ１をそのままＢＨＫ−２１細胞（６ウェルプレート中）に導入した。細胞は１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥ）０．５ｍ１／ウェルで培養した。また、別の実験において、各サンプルの１００μｌを硫酸プロタミン５μｇと混合後、ＢＨＫ−２１に導入した。３７℃、５％ ＣＯ2のインキュベーター中で６０分問放置後、培養液を１０％ＦＣＳ−ＤＭＥと交換した。２２時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。図２０に示すように、本発明の方法を用いて調製されたヘルペスウイルスエンベロープベクターによる高効率の遺伝子導入が確認された。各サンプルとも形態学的な観察による細胞毒性は認められなかった。
【０１３６】次に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で５分間処理したヘルペスウイルスエンベロープベクターを−８０℃で２日間保存後、解凍し、再度ＢＨＫ−２１細胞に添加して導入効率を測定した。今回は導入６０分後に１０％ＦＣＳ−ＤＭＥ ２．５ｍｌ／ウェルを加えて一晩培養して活性を測定した。血清の影響、ベクター量について検討した。
【０１３７】図２１に示すように、−８０℃で２日間保存後であっても、なお高効率の遺伝子導入が確認された。血清１０％を加えた培地を用いたものが、無血清培地よりも導入効率が高く、ベクター溶液２００μ１（推定量：２．８×１０7ウイルス粒子／ウェル）が１００μ１溶液（推定量：１．４×１０7ウイルス粒子／ウェル）より遺伝子導入活性が高かった。
【０１３８】（１７．３：不活性化ウイルスを用いる遺伝子導入）上記の開示より、この界面活性剤を用いてエンベロ一プベクターを作成する技術はＨＶＪのみでなく、広く脂質膜を有するエンベロープウイルスに適用可能であることが当業者に明らかである。従って、当業者が本発明の開示に従って、他のエンベロープウイルスを用いて、容易に遺伝子導入のためのエンベロ一プベクターを調製し得ることが明らかである。従って、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、ヘパドナウイルス科などのウイルスのエンベロープベクターが作成可能である。これによりウイルスの有する組織指向性を利用した特定の臓器への標的導入が実現可能と考えられる。たとえば単純疱疹ウイルスのエンベロープベクターは神経指向性のベクターとして、エプスタイン−バーウイルスのエンベロープベクターはＢリンパ球指向性のベクターとして、インフルエンザのエンベロープベクターは呼吸器指向性ベクターとして応用し得る。
【０１３９】上記から、本発明の特定の実施態様が例示の目的について本明細書に記載されるが、種々の改変が、本発明の意図および範囲から逸脱せずに行われ得ることは、明らかである。具体的には、本明細書の実施例は、不活性化ＨＶＪを用いた遺伝子導入ベクターについて記載されてきたが、同様の調製方法を用いて、ＨＶＪ以外のウイルスを不活性化して本発明の遺伝子導入ベクターを調製すること、および不活性化工程を行わずに本発明の遺伝子導入ベクターを調製することは、本明細書の開示から当業者に明らかである。したがって、本発明は、添付の請求の範囲以外によっては限定されない。
【０１４０】
【発明の効果】操作が簡便で、しかも遺伝子導入効率の優れた新しい遺伝子導入方法が提供される。これにより、遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングが可能になると考えられる。本発明のウイルスエンベロープベクターを含む、高スループットスクリーニングのためのキットもまた提供される。また、本出願によって提供されるウイルスエンベロープベクターは長期間の凍結保存が可能であり、要事調製の必要がないため、作業工程が大幅に簡略化できるとともに、導入ベクターの大量調製による均質な遺伝子導入が可能となる。さらに、本発明の遺伝子導入ベクターは、従来のＨＶＪを基に調製されたベクターよりも、高効率の遺伝子導入を可能にし、かつ従来の方法よりもより広範囲の生体内組織に対する遺伝子導入を可能とする。
【０１４１】本発明の遺伝子導入ベクターを含む、医薬品投与のためのドラッグデリバリーシステム、薬物のスクリーニング系、および遺伝子治療用ベクターも提供される。
【出願人】 【識別番号】３９６０２０８００
【氏名又は名称】科学技術振興事業団
【出願日】 平成１３年２月１日（２００１．２．１）
【代理人】 【識別番号】１０００７８２８２
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
【公開番号】 特開２００１−２８６２８２（Ｐ２００１−２８６２８２Ａ）
【公開日】 平成１３年１０月１６日（２００１．１０．１６）
【出願番号】 特願２００１−２６１８５（Ｐ２００１−２６１８５）