| 【発明の名称】 |
フィブリノーゲンを含有する溶液のウイルス除去法 |
| 【発明者】 |
【氏名】松尾 宇人
【氏名】金子 健二
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| 【要約】 |
【課題】ウイルス夾雑の危惧のあるフィブリノゲン溶液のウイルス除去法において、より濾過効率がよく、工業的に有利なウイルス除去方法の提供。
【解決手段】フィブリノゲン溶液に塩基性アミノ酸および塩化ナトリウムを共存させることにより前記課題を解決した。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲンを含有する溶液からウイルス除去膜を用いてウイルスを除去する方法において、フィブリノーゲンを含有する溶液に塩基性アミノ酸またはその塩類及び塩化ナトリウムを含有させることを特徴とするウイルス除去法。
【請求項２】塩基性アミノ酸がリジンまたはアルギニンである請求項１記載のウイルス除去法。
【請求項３】フィブリノーゲンを含有する溶液中の塩基性アミノ酸またはその塩の濃度が０.０1〜１０．0ｗ／ｖ％であり、塩化ナトリウムの濃度が０.０１〜１０.０ｗ／ｖ％である請求項１記載のウイルス除去法。
【請求項４】フィブリノーゲンを含有する溶液中の塩基性アミノ酸またはその塩の濃度が０.２５〜３.０ｗ／ｖ％であり、塩化ナトリウムの濃度が０.２５〜３.０ｗ／ｖ％である請求項１記載のウイルス除去法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲンを含有する溶液からウイルス除去膜を用いてウイルスを除去する方法において、溶液中に塩基性アミノ酸あるいはその塩類及び塩化ナトリウムを含有せしめることにより、より効率的にウイルスを除去する方法の提供に関する。
【０００２】
【従来技術】フィブリノーゲン製剤など、ヒト血漿、その誘導画分等の血液製剤は、エイズウイルス、各種肝炎ウイルス、ヒトパルボウイルスＢ１９などのウイルスに汚染されている可能性が否定できない。従ってこれらを使用した薬剤の製造に際しては、ウイルスを十分に不活化及び／又は除去する工程を組み込むことが必須である。血液製剤に夾雑してくる危惧のあるウイルスを不活化する方法としては、水溶液状態での加熱処理法（以下、液状加熱という。）がMurrayら(The New York Academy of Medicine,３１巻（５）３４１〜３５８（１９５５）により提案され、それ以来この方法は血液製剤のウイルス不活化法として広く採用されている。一方ウイルスを除去する方法としては、特開平２−１６７２３２において血液凝固VIII因子製剤中に意図的に添加したウイルスを再生セルロース製多孔性中空糸フィルターで濾過することにより除去する方法が記載されている。また免疫グロブリン製剤製造工程中にウイルス除去用中空糸フィルターによるウイルス除去工程を導入する方法が関口らによって報告されている(Japanese Journal of Transfusion Medicine，３４巻（６）６１５〜６１７(１９８８)。しかしながら、これらのウイルス除去フィルターを用いたウイルス除去法は蛋白質がフィブリノーゲンである場合は特に濾過性が悪く、収率の低下及び使用膜量の増大などの問題点があり、工業的生産性の点で大きな課題となっている。また、血漿蛋白質のなかでもフィブリノーゲンは他の蛋白質製剤に比べてウイルス夾雑の危険性が高いと言われている。このためウイルスの不活化や除去については他の蛋白製剤より更に厳重に行う必要がある。ウイルスの不活化法としては、液状加熱法、乾燥加熱法、ソルベントデタージェント（ＳＤ）法などがあり、ウイルス除去法としてはウイルス除去フィルターによるウイルス除去法がある。またエタノール沈澱法及びカラムクロマトグラフィー法においてもウイルス除去が可能であることが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】以上述べた各種の方法を複数組み合わせることはウイルスの不活化、除去の完璧を期すための有効な手段であると考えられるが、そのためには各処理工程においてフィブリノーゲンの収率低下を最小限に抑え、効率的に処理することが産業上重要となってくる。本発明の課題はウイルス夾雑の危惧のあるフィブリノーゲン溶液のウイルス除去工程に於いて、より効率的にウイルスを除去し、工業的に有利に、安全なフィブリノーゲン製剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題を解決するため種々の研究を重ねた結果、フィブリノーゲンを含有する溶液をウイルス除去膜処理する際に、塩基性アミノ酸またはその塩類、特にリジン及び／又はアルギニン、及び塩化ナトリウムを共存させておくとフィブリノーゲンの高い安定性と優れた濾過性を示し、且つウイルス除去膜処理によりウイルス除去されたフィブリノーゲンは、その後に行われる各種膜濾過工程においても優れた濾過性を示すことを見いだし、さらに検討を重ねて本発明を完成した。すなわち本発明は（１）ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲンを含有する溶液からウイルス除去膜を用いてウイルスを除去する方法において、フィブリノーゲンを含有する溶液に塩基性アミノ酸またはその塩類及び塩化ナトリウムを含有させることを特徴とするウイルス除去法、（２）塩基性アミノ酸がリジンまたはアルギニンである前記（１）記載のウイルス除去法、（３）フィブリノーゲンを含有する溶液中の塩基性アミノ酸またはその塩の濃度が０.０1〜１０．0ｗ／ｖ％であり、塩化ナトリウムの濃度が０.０１〜１０.０ｗ／ｖ％である前記（１）記載のウイルス除去法、および（４）フィブリノーゲンを含有する溶液中の塩基性アミノ酸またはその塩の濃度が０.２５〜３.０ｗ／ｖ％であり、塩化ナトリウムの濃度が０.２５〜３.０ｗ／ｖ％である前記（１）記載のウイルス除去法、である。
【０００５】
【発明実施の形態】本発明のウイルス除去の対象となるフィブリノーゲンは、ヒト血漿由来のコーンフラクションＩまたはクリオペーストをクエン酸ナトリウム水溶液に溶解し、必要により濾過助剤を使用した濾過、濃度の異なるエタノールによる精製によって得られたものが好ましい。本発明においてはフィブリノーゲンを含有する溶液に塩基性アミノ酸あるいはその塩類及び塩化ナトリウムを添加し種々の予備濾過を施した後ウイルス除去膜処理を施す。塩基性アミノ酸あるいはその塩類としてはリジン、リジン塩酸塩、アルギニン、アルギニン塩酸塩等があげられる。塩基性アミノ酸あるいはその塩類の添加量は通常フィブリノーゲンを含む溶液中０.０1〜１０.０ｗ／ｖ％であり、好ましくは０.２５〜３.０ｗ／ｖ％である。また塩化ナトリウムの添加量は通常０.０1〜１０.０ｗ／ｖ％であり、好ましくは０.２５〜３.０ｗ／ｖ％である。塩基性アミノ酸を添加する時期はウイルス除去膜処理をする前であればどの工程でも構わないが、好ましくは予備濾過処理をする前に添加することが望ましい。
【０００６】このようにして調製したフィブリノーゲンを含有する溶液は、従来にない高い濾過性並びにフィブリノーゲン回収性を示す。さらに塩基性アミノ酸あるいはその塩類及び塩化ナトリウムを添加したフィブリノーゲンを含有する溶液は高い膜濾過性を持つため、例えば、限外濾過膜等を使用する際にも従来にない高濃度まで安定的に濃縮することが可能となり、また従来にない高い回収性を得ることができ、ウイルス除去膜処理後の工程に於いて種々の濾過工程を継続して導入することが可能となる。
【０００７】
【実施例】以下に実施例、比較例および試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１ヒト血漿由来のコーンフラクションＩ １．６ｋｇを５５ｍＭのクエン酸ソーダ水溶液（ｐＨ７．０）３３リットルに溶解して得られた溶液（Ａ２８０の吸光度＝１４）に硫酸バリウム３．８ｋｇを添加し、２５℃で９０分間撹拌した後不溶物を除去した。得られた液に５５ｍＭクエン酸水溶液を加えてｐＨを６．４に調整し、更に塩化ナトリウムを濃度が０．９ｗ／ｖ％となるように添加した。ついで液を０℃まで冷却し、エタノール濃度が７．５ｖ／ｖ％となるようにエタノールを添加した。遠心分離で得られた沈澱を０．９ｗ／ｖ％の塩化ナトリウムを含む５５ｍＭクエン酸ソーダ水溶液（ｐＨ６．４）２２リットルに溶解した。その後エタノール濃度が２ｖ／ｖ％となるようにエタノールを添加し、沈澱を除去した。ついでエタノール濃度が８ｖ／ｖ％となるようにエタノールを添加し、沈殿物として精製フィブリノーゲン画分を得た。上記フィブリノーゲン画分沈殿物０．６ｋｇを０．２w/v％アルギニン及び０．２５％塩化ナトリウムを含んだ溶液６．４リットルで溶解して得られたフィブリノーゲン溶液を１０μｍ、１．２μｍ、０．５μｍ及び０．１μｍのフィルターで順次濾過した後、０．８ｋｇｆ／ｃｍ２の一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成（株）製）を通過させた。濾液中のフィブリノーゲン量を測定し、得られた数値に容量を乗じた数値と濾過前のフィブリノーゲン量に容量を乗じた数値から、濾過前に対する濾過後のフィブリノーゲンの収率を算出した。その結果を〔表１〕に示す。
【０００８】実施例２実施例１と同様にして得られた精製フィブリノゲンの８ｖ／ｖ％エタノール沈殿物０．６ｋｇを０．０４w/v％アルギニン及び０．０５％塩化ナトリウムを含んだ溶液６．４リットルで溶解して得られたフィブリノーゲン溶液を１０μｍ、１．２μｍ、０．５μｍ及び０．１μｍのフィルターで順次濾過した後、０．８ｋｇｆ／ｃｍ２の一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成（株）製）を通過させた。濾液中のフィブリノーゲン量を測定し得られた数値に容量を乗じた数値と濾過前のフィブリノーゲン量に容量を乗じた数値より、濾過前に対する濾過後のフィブリノーゲンの収率を算出した。その結果を〔表１〕に示す。
【０００９】実施例３実施例１と同様にして得られた精製フィブリノゲンの８ｖ／ｖ％エタノール沈澱物０．６ｋｇを１．２ｗ／ｖ％アルギニン及び０．９％塩化ナトリウムを含んだ溶液１２リットルで溶解して得られたフィブリノーゲン溶液を１０μｍ、１．２μｍ、０．５μｍ及び０．１μｍのフィルターで順次濾過した後、０．８ｋｇｆ／ｃｍ２の一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成（株）製）を通過させた。濾液に得られたフィブリノーゲン量を測定し得られた数値に容量を乗じた数値と濾過前のフィブリノーゲン量に容量を乗じた数値より、濾過前に対する濾過後のフィブリノーゲンの収率を算出した。その結果を〔表１〕に示す。
【００１０】実施例４実施例１と同様にして得られた精製フィブリノゲンの８ｖ／ｖ％エタノール沈殿物０．６ｋｇを１．２％塩酸アルギニン及び０．９％塩化ナトリウムを含んだ溶液２１リットルで溶解して得られたフィブリノーゲン溶液を１０μｍ、１．２μｍ、０．５μｍ及び０．１μｍのフィルターで順次濾過した後、０．８ｋｇｆ／ｃｍ２の一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成（株）製）を通過させた。濾液中のフィブリノーゲン量を測定し得られた数値に容量を乗じた数値と濾過前のフィブリノーゲン量に容量を乗じた数値より、濾過前に対する濾過後フィブリノーゲンの収率を算出した。また本溶液全てを通過させたときに必要なウイルス除去フィルターの面積を算出した。その結果を〔表１〕および〔表２〕に示す【００１１】比較例１実施例１と同様にして得られた精製フィブリノゲンの８ｖ／ｖ％エタノール沈殿物０．６ｋｇを０．２５％塩化ナトリウム溶液６．４リットルで溶解して得られたフィブリノーゲン溶液を１０μｍ、１．２μｍ、０．５μｍ及び０．１μｍのフィルターで順次濾過した後、０．８ｋｇｆ／ｃｍ２の一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成（株）製）を通過させた。濾液中のフィブリノーゲン量を測定し得られた数値に容量を乗じた数値と濾過前のフィブリノーゲン量に容量を乗じた数値より、濾過前に対する濾過後のフィブリノーゲンの収率を算出した。その結果を〔表１〕に示す。
【００１２】比較例２実施例１と同様にして得られた精製フィブリノゲンの８ｖ／ｖ％エタノール沈殿物０．６ｋｇを０．２０％アルギニン溶液６．４リットルで溶解して得られたフィブリノーゲン溶液を１０μｍ、１．２μｍ、０．５μｍ及び０．１μｍのフィルターで順次濾過した後、０．８ｋｇｆ／ｃｍ２の一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成（株）製）を通過させた。濾液中のフィブリノーゲン量を測定し得られた数値に容量を乗じた数値と濾過前のフィブリノーゲン量に容量を乗じた数値より、濾過前に対する濾過後のフィブリノーゲンの収率を算出した。その結果を〔表１〕に示す。
【００１３】実施例５ヒト血漿由来のコーンフラクションＩ １．６ｋｇを５５ｍＭのクエン酸ソーダ水溶液（ｐＨ７．０）３３リットルに溶解して得られた溶液（Ａ２８０の吸光度＝１４）に硫酸バリウム３．８ｋｇを添加し、２５℃で９０分間撹拌した後不溶物を除去した。得られた液に５５ｍＭクエン酸水溶液を加えてｐＨを６．４に調整し、更に塩化ナトリウムを濃度が０．９ｗ／ｖ％となるように添加した。ついで液を0℃まで冷却し、エタノール濃度が7．5ｖ／ｖ％となるようにエタノールを添加した。遠心分離した後生じた沈澱を0．9ｗ／ｖ％の塩化ナトリウムを含む５５ｍＭクエン酸ソーダ水溶液（ｐＨ６．４）２２リットルに溶解した。その後エタノール濃度が２ｖ／ｖ％となるようにエタノールを添加し分離し、沈澱を除去したた後、エタノール濃度が8ｖ／ｖ％となるようにエタノールを添加し、精製フィブリノーゲン画分を得た。実施例１と同様にして得られた精製フィブリノゲンの８ｖ／ｖ％エタノール沈殿物０．６ｋｇを１．２ｗ／ｖ％塩酸リジン及び０．９％塩化ナトリウムを含んだ溶液２１リットルで溶解して得られたフィブリノーゲン溶液２２リットルを１０μｍ、１．２μｍ、０．５μｍ及び０．１μｍのフィルターで順次濾過した後、０．８ｋｇｆ／ｃｍ２の一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成（株）製）を通過させた。濾液中のフィブリノーゲン量を測定し得られた数値に容量を乗じた数値と濾過前のフィブリノーゲン量に容量を乗じた数値より、濾過前に対する濾過後のフィブリノーゲンの収率を算出した。また、本溶液全てを通過させたときに必要なウイルス除去フィルターの面積を算出した。その結果を〔表２〕に示す。
【００１４】実施例６実施例１と同様にして得られた精製フィブリノゲンの８ｖ／ｖ％エタノール沈殿物０．６ｋｇを１．２w/v％塩酸リジン、１．２％塩酸アルギニン及び０．９％塩化ナトリウムを含んだ溶液２１リットルで溶解して得られたフィブリノーゲン溶液２２リットルを１０μｍ、１．２μｍ、０．５μｍ及び０．１μｍのフィルターで順次濾過した後、０．８ｋｇｆ／ｃｍ２の一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成（株）製）を通過させた。濾液中のフィブリノーゲン量を測定し得られた数値に容量を乗じた数値と濾過前のフィブリノーゲン量に容量を乗じた数値より、濾過前に対する濾過後のフィブリノーゲンの収率を算出した。また、本溶液全てを通過させたときに必要なウイルス除去フィルターの面積を算出した。その結果を〔表２〕に示す。
【００１５】実施例７実施例１と同様にして得られた精製フィブリノゲンの８ｖ／ｖ％エタノール沈殿物０．６ｋｇを１．２w/v％塩酸リジン及び０．９％塩化ナトリウムを含んだ溶液２１リットルで溶解して得られたフィブリノーゲン溶液２２リットルを１０μｍ、１．２μｍ、０．５μｍ及び０．１μｍのフィルターで順次濾過した。ここに塩酸アルギニンを１．２w/v％となるように添加した後、０．８ｋｇｆ／ｃｍ２の一次圧でウイルス除去フィルター（プラノバ３５Ｎ、旭化成（株）製）を通過させた。濾液中のフィブリノーゲン量を測定し得られた数値に容量を乗じた数値と濾過前のフィブリノーゲン量に容量を乗じた数値より、濾過前に対する濾過後のフィブリノーゲンの収率を算出した。また、本溶液全てを通過させたときに必要なウイルス除去フィルターの面積を算出した。その結果を〔表２〕に示す。
【００１６】試験例１フィブリノーゲン濃度の測定Ｌａｋｉ法及びＢｌｏｍｂａｃｋ法を組み合わせて比較例１及び実施例１から７で得られた濾過前後の試料に含まれるフィブリノーゲン濃度を測定した。すなわち、各試料を希釈してフィブリノーゲン濃度３〜５ｍｇ／ｍｌに調整し、これを試料液とした。試料液２．０ｍｌに０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．１ｍｌ、０．２Ｍ塩化カリウム溶液を１．２５ｍｌ及び精製水を０．２５ｍｌ加えた。次いで２５０ＮＩＨ ＵＮＩＴＳ／ｍｌトロンビン（生理食塩水）溶液を０．１ｍｌ加えて混和し、３７℃で１時間静置すると凝集塊が生成した。この凝集塊を濾取し精製水で２回洗浄し、２．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液２．０ｍｌを含んだ２０ｍｌ容メスフラスコに加え、６０℃に加温して溶解後、精製水で正確に２０ｍｌとし、２７８ｎｍ及び３２５ｎｍの吸光度を測定し、それぞれの値をＡ２７８及びＡ３２５とした。得られた各値から、以下の計算式にしたがって各試料中のフィブリノーゲン濃度（ｍｇ／ｍｌ）を算出した。
【数１】
（なお数値１６．１７はフィブリノーゲン１％溶液の分子吸光係数である。）
【００１７】
【表１】
〔表１〕に示すように、アルギニンおよび塩化ナトリウムを添加した実施例１の高濃度のフィブリノーゲン溶液は、同条件で同濃度の塩化ナトリウムのみを添加した比較例１の溶液、およびアルギニンのみを添加した比較例２の溶液に比してウイルス除去膜を用いた濾過後のフィブリノーゲン収率は数倍以上向上した。また、アルギニン濃度を１．２％とし、塩化ナトリウム濃度を０．９％としたものはフィブリノーゲンの濃度を９％にしてもウイルス除去膜を用いた濾過後の収率は１００％であった。このことからアルギニンおよび塩化ナトリウムを添加することによりフィブリノーゲンの高い濾過収率を得られることが明らかになった。
【００１８】
【表２】
〔表２〕の結果から明らかなように、実施例４のアルギニン添加だけではなく実施例５のリジンを単独で添加することによっても収率は著しく高められることが証明された。更に、両アミノ酸を混合して添加することによって使用する膜面積を著しく低減することが実施例６から明らかとなり、産業上極めて有用な発明であることを示している。また、実施例７の結果から明らかなようにアミノ酸を添加する工程がウイルス除去膜処理前であればいずれも高い濾過性を示すことを示している。
【００１９】
【発明の効果】本発明によれば、ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン溶液からウイルス除去膜を用いてウイルスを除去する方法において、より効率の良いウイルス除去が可能となる。すなわち、本法によりフィブリノーゲン溶液は高い膜濾過性を持つため、ウイルス除去膜処理が極めて円滑に進行し、且つその処理後の工程に於いても種々の濾過工程を有利に進行させることができる。
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| 【出願人】 |
【識別番号】０００２３１６４８
【氏名又は名称】日本製薬株式会社
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| 【出願日】 |
平成１２年５月３１日（２０００．５．３１） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００７１９７３
【弁理士】
【氏名又は名称】谷 良隆
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| 【公開番号】 |
特開２００１−３３５５０９（Ｐ２００１−３３５５０９Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１３年１２月４日（２００１．１２．４） |
| 【出願番号】 |
特願２０００−１６１７７５（Ｐ２０００−１６１７７５） |
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