トップ :: A 生活必需品 :: A61 医学または獣医学;衛生学




【発明の名称】 キチン・キトサンによる５−フルオロウラシルの副作用防止方法及びそのための配合剤
【発明者】 【氏名】奥田 拓道

【氏名】木村 善行
【要約】 【課題】適当なｍｏｄｕｌａｔｏｒと併用することにより、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の経口投与によって発生する副作用を防止する方法及びそのための配合剤を提供すいる。

【解決手段】５−ＦＵとキチン・キトサンを併用投与する際に、少なくともキチン・キトサンを溶腸形態であるカプセル剤として患者に経口投与し、５−ＦＵの経口投与による副作用である白血球減少及び小腸粘膜酵素活性の低下を防止すると共に、下痢の出現も遅延させる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ５−フルオロウラシルとキチン・キトサンを併用して経口投与する制癌方法であって、少なくともキチン・キトサンを溶腸形態で投与することを特徴とするシスプラチンの副作用防止方法。
【請求項２】 前記溶腸形態がカプセル剤である請求項１記載の方法。
【請求項３】 前記カプセル剤が硬カプセル剤又は軟カプセル剤のいずれかである請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】 前記カプセル剤が二重カプセル剤であって、内部カプセル剤に５−フルオロウラシルを、内部カプセル剤を包囲する外部カプセル剤にキチン・キトサンを充填する請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】 前記カプセル剤が２室分画方式カプセル剤であって、各区画に５−フルオロウラシル又はキチン・キトサンをそれぞれ別個に充填する請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】 前記溶腸形態が錠剤である請求項１記載の方法。
【請求項７】 前記溶腸形態がレジネートである請求項１記載の方法。
【請求項８】 ５−フルオロウラシルとキチン・キトサンを同時投与する請求項１記載の方法。
【請求項９】 キチン・キトサン経口投与後５−フルオロウラシルを経口投与する請求項１記載の方法。
【請求項１０】 キチン・キトサンを５−フルオロウラシルに対し重量比で３倍〜２４０倍併用する請求項１記載の方法。
【請求項１１】 キチン・キトサンを５−フルオロウラシルに対し重量比で１２倍〜６０倍併用する請求項１記載の方法。
【請求項１２】 請求項１記載の５−フルオロウラシルの副作用防止法に使用するための溶腸形態に作製された５−フルオロウラシルとキチン・キトサンの配合剤。
【請求項１３】 前記溶腸形態の５−フルオロウラシルとキチン・キトサンの配合剤がカプセル剤である請求項１２記載の配合剤。
【請求項１４】 前記カプセル剤が硬カプセル剤又は軟カプセル剤のいずれかである請求項１２又は１３記載の配合剤。
【請求項１５】 前記カプセル剤が内部カプセル剤が５−フルオロウラシル充填カプセル剤で、内部カプセル剤を包囲する外部カプセル剤がキチン・キトサン充填カプセル剤である請求項１２〜１４のいずれか１項記載の配合剤。
【請求項１６】 前記カプセル剤が一方の区画に５−フルオロウラシルが他方の区画にキチン・キトサンがそれぞれ別個に充填されている２室分画カプセル剤である請求項１２〜１４のいずれか１項記載の配合剤。
【請求項１７】 前記溶腸形態の５−フルオロウラシルとキチン・キトサンの配合剤が錠剤である請求項１２記載の配合剤。
【請求項１８】 前記溶腸形態の５−フルオロウラシルとキチン・キトサンの配合剤がレジネートである請求項１２記載の配合剤。
【請求項１９】 前記溶腸形態の配合剤中に、キチン・キトサンを５−フルオロウラシルに対し重量比で２４倍〜３０００倍添加する請求項１２記載の配合剤。
【請求項２０】 前記溶腸形態の配合剤中に、キチン・キトサンを５−フルオロウラシルに対し重量比で１２０倍〜６００倍添加する請求項１２記載の配合剤。
【請求項２１】 前記５−フルオロウラシル及びキチン・キトサンとも粉末である請求項１２〜２０のいずれか１項記載の配合剤。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、５−フルオロウラシル（以後５−ＦＵと略記する）とキチン・キトサンの併用制癌方法に関し、詳細には、５−ＦＵの経口投与法におけるキチン・キトサンの併用による５−ＦＵの副作用防止方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に、抗癌剤の歴史は、第一次世界大戦でドイツ軍によって使用された毒ガス（イペリット）に骨髄の造血作用を抑える動きがあるという発見に始まったことが知られている。
【０００３】その後、毒ガスの生体に及ぼす研究が盛んになり、第二次世界大戦中の１９４２年に、ナイトロジェン・マスタードが癌に効くことが発見された。この毒ガスは、遺伝子−ＤＮＡのグアニアンに結合し、ＤＮＡの鎖を切断する。癌細胞が分裂するためには、ＤＮＡが増加する必要があるが、ＤＮＡの鎖が切断されるとその合成ができなくなり、増殖が抑えられたり、癌細胞の死を招いたりすることがわかった。
【０００４】その後、多くの抗癌剤が開発されたが、その中の代表の一つに５−ＦＵがある。１９５７年、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒらが５−ＦＵを発見して以来４０年が経過している。しかし現在でも、５−ＦＵは単剤または併用剤として進行・再発消化器癌をはじめ、種々の固形癌の治療に欠かすことのできない薬剤となっている。５−ＦＵは、白色の結晶で、水にやや溶けにくい。ウラシルと競合してＤＮＡの生合成を阻害し抗腫瘍効果を示す。胃癌、直腸癌、結腸癌などの消化器癌、乳癌、子宮癌、肺癌、皮膚癌、その他の各種癌腫、及び細網肉腫、ホジキン病などに注射薬、ドライシロップ、親水軟膏として用いる。毒薬。極量：１日０．８ｇ（径口、静脈内）。その構造式を下記に示す。
【０００５】
【化１】

【０００６】一方、キチン・キトサンも試験内試験でＮＫ（リンパ球の癌細胞を殺す作用）やＬＡＫ（ＹＡＣ−１癌細胞を殺す作用）活性に対する増強効果があることが知られている（奥田拓道著：キチン・キトサン 基礎と薬理、８５−８６頁、（１９９８）、薬局新聞社刊）。
【０００７】しかして、キチン・キトサンは、キチンとキトサンの混合物である。キチンは、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン残基が５０００以上も１→４結合した分子量１００万以上の多糖である。このキチンは、カニ、エビなどの甲殻類、オキアミの皮殻、カブトムシ、バッタなどの昆虫類の甲皮、ハマグリ、カキなどの貝類、イカの骨、菌類の細胞壁など生物中に存在する多糖で、生物界で年間１０００億トンつくられていると推測されている。
【０００８】現在のところ、カニやエビの甲殻からキチン・キトサンが単離されている。カニやエビの甲殻に約５％塩酸溶液を加えると、甲殻に含まれるＣａＣＯ３ がＣａＣｌ２ とＣＯ２ に変わり、炭酸ガスが発生する。このようにして脱灰した甲殻を約５％水酸化ナトリウム中に浸すと、タンパク質が溶け出す。残った不溶物がキチンである。このキチンに４０〜４５％水酸化ナトリウム溶液を加え８０〜１２０℃で処理すると、下記の化学構造式で示すように、キチンのアミノ基に結合したアセチル基がはずれてキトサンに変わる。カニ、エビの甲殻からの収量は１５〜３０％である。
【０００９】
【化２】

【００１０】しかし、このような処理で調製したキトサンも１００％の純度ではなく、通常１０〜２０％のキチンを含んでいる。キチンには、毒性はないといわれている。また、キトサンもブドウ糖や砂糖の毒性に比べて著しく低いとされている。ブドウ糖や砂糖の致死量は犬で８〜１２ｇ／ｋｇといわれるが、平野教授は、マウスにキトサンを体重１ｋｇ当たり１８ｇ経口投与しても何ら毒性は認められなかったと報告している（平野茂博、「別冊フードケミカル」Ｉ、ｐｐ．１−４（１９８７））。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】ナイトロジェン・マスタードが癌の治療に有効なことの発見以後、多くの抗癌剤が発見されたが、その中の代表が「５−フルオロウラシル」（５−ＦＵ）である。これは、ウラシルが癌組織に集まりやすい事実に注目して、１９５８年、ハイデルバーガーなどによって発見されたものである（ウラシルは塩基であるがＤＮＡに含まれているわけではなく、ＲＮＡに存在する塩基である）。
【００１２】ＤＮＡは、４種類のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）からつくられるが、この中で量が最も少ないのがｄＴＴＰである。したがって、ｄＴＴＰがなければ、他のヌクレオチドがいくらあってもＤＮＡは合成されないことになる。５−ＦＵは、このｄＴＴＰの合成を阻害することを通じて、ＤＮＡの合成を低下させ、抗癌作用を発揮するのである。
【００１３】次の反応図式１に示すように、５−ＦＵはリン酸化され、Ｆ−ｄＵＭＰとなり、これが葉酸とともにｄＴＭＰ合成酵素と結合することで、この酵素が作用できないようにする。ｄＴＭＰ合成酵素は、ｄＴＴＰがつくられる際の鍵となる重要な酵素である。
【００１４】
【化３】

【００１５】前述のようにウラシルはＲＮＡを構成する塩基の一つであるが、ウラシルにフッ素が結合した５−ＦＵもＲＮＡに取り込まれる。細胞内のＲＮＡは、主としてタンパク質の合成に関与する。タンパク質はアミノ酸が連なったものであるが、その連なり方を指示するＤＮＡの指令を、細胞核から細胞質へと運ぶ（伝達する）のがメッセンジャーＲＮＡである。メッセンジャーＲＮＡの指令に基づいて、アミノ酸からタンパク質をつくる場を提供しているのがリボゾームであり、このリゾームには大量のＲＮＡが存在する。
【００１６】そこで５−ＦＵがＲＮＡに取り込まれると、メッセンジャーＲＮＡやリボゾームとしての機能が果たせなくなり、タンパク質の合成が阻害され、ひいては癌細胞が生きてゆけなくなる。すなわち５−ＦＵは、ＤＮＡとタンパク質の合成を阻害することによって、抗癌作用を発揮している。癌細胞は、盛んに分裂を繰り返して増殖する。細胞が分裂して二つの細胞になる前に、ＤＮＡは２倍にならなくてはならず、タンパク質や脂質なども増加する必要がある。そのとき、５−ＦＵがＤＮＡやタンパク質の増量を阻止すると、癌細胞は分裂できなくなる。
【００１７】ところで、癌患者に５−ＦＵを投与すると、脱毛、白血球減少、下痢などの副作用が起こることはよく知られている。毛根細胞、骨髄細胞、腸粘膜細胞などは、体の中では癌細胞と同じように細胞分裂の盛んな細胞であるから、分裂の盛んな細胞を攻撃する５−ＦＵによって毛根細胞の細胞分裂が阻害されれば脱毛が、骨髄細胞の場合なら白血球減少が、腸粘膜細胞の分裂障害なら下痢が引き起こされる。この場合、とくに白血球の減少は癌に対する抵抗力を低下させるとともに、５−ＦＵは生き残った細胞の復活力を損ない、感染に対する抵抗力を低下させることで、肺炎などにかかりやすくなるという危険をもたらす。
【００１８】本発明は、このような従来の欠点に鑑みてなされたもので、その目的は適当なｍｏｄｕｌａｔｏｒを配合することにより、５−ＦＵの経口投与によって発生する副作用を防止する方法を提供することである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、５−ＦＵの経口投与によって発生する副作用を防止する方法について鋭意研究を行い、キチン・キトサンと併用することにより、白血球減少及び小腸粘膜酵素活性の低下という５−ＦＵ投与による副作用の防止が効果的に達成できることを見出して本発明を完成するに至った。
【００２０】すなわち、本発明によれば、下記のキトサンによる５−ＦＵの副作用防止方法及びそのための配合剤が提供されて、本発明の上記目的が達成された。
【００２１】（１） ５−ＦＵとキチン・キトサンを併用して経口投与する制癌方法であって、少なくともキチン・キトサンを溶腸形態で投与することを特徴とする５−ＦＵの副作用防止方法。
（２） 前記溶腸形態がカプセル剤である前記（１）記載の方法。
（３） 前記カプセル剤が硬カプセル剤又は軟カプセル剤のいずれかである前記（１）又は（２）記載の方法。
（４） 前記カプセル剤が二重カプセル剤であって、内部カプセル剤に５−ＦＵを、内部カプセル剤を包囲する外部カブセル剤にキチン・キトサンを充填する前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 前記カプセル剤が２室分画方式カプセル剤であって、各区画に５−ＦＵ又はキチン・キトサンをそれぞれ別個に充填する前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（６） 前記溶腸形態が錠剤である前記（１）記載の方法。
（７） 前記溶腸形態がレジネートである前記（１）記載の方法。
（８） ５−ＦＵとキチン・キトサンを同時投与する前記（１）記載の方法。
（９） キチン・キトサン経口投与後５−ＦＵを経口投与する前記（１）記載の方法。
（１０） キチン・キトサンを５−ＦＵに対し重量比で３倍〜２４０倍併用する前記（１）記載の方法。
（１１） キチン・キトサンを５−ＦＵに対し重量比で１２倍〜６０倍併用する前記（１）記載の方法。
【００２２】（１２） 前記（１）記載の５−ＦＵの副作用防止方法に使用するための溶腸形態に作製された５−ＦＵとキチン・キトサンの配合剤。
（１３） 前記溶腸形態の５−ＦＵとキチン・キトサンの配合剤がカプセル剤である前記（１２）記載の配合剤。
（１４） 前記カプセル剤が硬カプセル剤又は軟カプセル剤のいずれかである前記（１２）又は（１３）記載の配合剤。
（１５） 前記カプセル剤が内部カプセル剤が５−ＦＵ充填カプセル剤で、内部カプセル剤を包囲する外部カプセル剤がキチン・キトサン充填カプセル剤である前記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の配合剤。
（１６） 前記カプセル剤が一方の区画に５−ＦＵが、他方の区画にキチン・キトサンがそれぞれ別個に充填されている２室分画カプセル剤である前記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の配合剤。
（１７） 前記溶腸形態の５−ＦＵとキチン・キトサンの配合剤が錠剤である前記（１２）記載の配合剤。
（１８） 前記溶腸形態の５−ＦＵとキチン・キトサンの配合剤がレジネートである前記（１２）記載の配合剤。
（１９） 前記溶腸形態の配合剤中に、キチン・キトサンを５−ＦＵチンに対し重量比で３倍〜２４０倍添加する前記（１２）記載の配合剤。
（２０） 前記溶腸形態の配合剤中に、キチン・キトサンを５−ＦＵに対し、重量比で１２倍〜６０倍添加する前記（１２）記載の配合剤。
（２１） 前記５−ＦＵ及びキチン・キトサンとも粉末である前記（１２）〜（２０）のいずれかに記載の配合剤。
【００２３】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態について詳しく説明する。本発明に用いられる抗癌剤５−ＦＵは、上記に説明した化学構造及び副作用を有するものであるが、その抗腫瘍活性及び副作用のメカニズムは次のように考えられる。
【００２４】５−ＦＵは時間依存生の強い代謝拮抗剤であり、その抗腫瘍活性および副作用のメカニズムが基礎的に解明され、臨床での位置づけが明確になってきたと思われる。反応図式２に示すように、５−ＦＵの主たる作用は、生体内で同化代謝されたＦｄＵＭＰと還元型葉酸（５，１０−ＣＨ２ −ＴＨＦ）とがＤＮＡ合成の律速酵素であるｄＴＭＰ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＴＳ）に結合し、三者共有結合体を形成することによりＴＳを阻害し、それによりＤＮＡ合成を阻止し、その結果殺細胞活性を示すことである。ピリミジンヌクレオチジと５−ＦＵの物質代謝を次の反応図式２に示す。
【００２５】
【化４】

【００２６】そもそも５−ＦＵの開発の根拠となったものは腫瘍組織のウラシル利用率が正常組織より高いことや、フッ素の導入により生物学的活性が増強されるという、２つの知見に基づくものといわれる。５−ＦＵの特徴は抗癌スペクトルが広く、胃癌、大腸癌、肝臓癌、乳癌などの固形癌から悪性リンパ腫にいたるまで多岐にわたるが、ことに有効な抗癌剤に乏しいといわれる消化器癌（腺癌）に対しても臨床効果を示すことである。しかし本剤が活性物質のため、副作用も強く、骨髄抑制や胃腸障害のほか脱毛、色素沈着、また長期投与の場合に神経症を呈することもある。とくにドライシロップは口内炎、下痢、食欲不振、食道炎、胃炎などを生じやすい欠点がある。そこで現在は、このような副作用軽減のため錠剤が製剤化され使用されている。
【００２７】このような副作用を抑えながら制癌作用を持続させるためには、５−ＦＵを低濃度でより長く血液中に存在させることが必要であることが容易に考えられる。ところで、キチン・キトサンが食塩中の塩素と結合して、糞中に排泄され、血清塩素が上昇しないため、血圧の上昇が阻止されることが知見された（奥田拓道著、キチン・キトサン 基礎と薬理、１８−３５頁、１９９４年６月２０日、株式会社薬局新聞発行）。
【００２８】そこで、本発明者等は、Ｎａ＋ Ｃｌ− と同様にその構造中にハロゲンであるＦを有する５−ＦＵのｍｏｄｕｌａｔｏｒとしてのキチン・キトサンの可能性について検討を行った。両者の間の相互作用は下記の化学式に示す如く考えられる。
【００２９】
【化５】

【００３０】上記反応図式に５−ＦＵの化学構造を示したが、フッ素はウラシルの５番目の炭素に結合しているので、そのマイナスの荷電のほとんどは失われていると思われる。しかし、残ったわずかなマイナス荷電によって、プラスに荷電しているキトサンがゆるく結合する可能性がある。これはゆるい結合なので、食塩の場合の如くフッ素単独のときのように固く結合することはなく、糞中に排泄されることがなく、せいぜい、５−ＦＵを腸管内に止めおく程度である。そしてこのことが、５−ＦＵを低濃度でより長く血液中に存在させること、そして副作用を抑えながら制癌作用を持続させることに連なると考えられる。
【００３１】本発明で使用するキチン・キトサンは、経口投与する際に胃の中の塩素により無駄に消費されることを防止するために溶腸形態にする必要がある。この溶腸形態にしたキチン・キトサンとしては、カプセル剤、錠剤及びレジネートが挙げられる。更にカプセル剤としては、処方箋による硬カプセル剤と、製薬工場であらかじめ製造される軟カプセル剤の両方を包含する。
【００３２】また、カプセルの形状もｃａｐとｂｏｄｙからなる単純なカプセル、小形の内部カプセルに５−ＦＵを充填し、これをキチン・キトサンを充填した大形の外部カプセル中に小形内部カプセルを図８に示すように包囲するように形成すれば、先ずキチン・キトサンが腸内で溶解し、その後５−ＦＵが溶解するので、５−ＦＵを腸管内に止めておくために好都合である。しかしながら、図９に示すように、カプセルｂｏｄｙを適宜隔壁により２分し、各区画に５−ＦＵとキチン・キトサンを別個に充填するように形成してもよい。なお、単純なカプセル内に適切な重量比で５−ＦＵとキチン・キトサンを配合充填することや、後者のみをカプセルに入れ前者をそのまま、又はオブラートで包む等して同時又は適宜時間差を設けて、好ましくは５−ＦＵを後から経口投与するなど、患者の好みに合わせて投与することは何等限定を受けることなく実施できる。
【００３３】錠剤としては、圧縮錠剤及び湿性錠剤のいずれでもよく、要は剤皮をかけることにより溶腸形態にできるものであれば、何等の制限なく使用できる。また、徐放製剤を形成するものとして、薬物とイオン交換樹脂を結合したもので、腸液中のアルカリで徐々にイオン交換が行われて、薬物を放出し、その除放出性を利用して持続性製剤に応用されるものであれば、何等の制限なく使用できる。
【００３４】本発明においては、キチン・キトサンを５−ＦＵに対し重量比で３倍〜２４０倍配合併用することが好ましく、１２倍〜６０倍配合併用することが更に好ましい。キチン・キトサンの５−ＦＵに対する重量比が３倍以下では、５−ＦＵを腸管内に止めておくこと、ひいては５−ＦＵを低濃度でより長く血液中に存在させる能力が低下して、５−ＦＵの副作用を防止する観点からは好ましくない。一方、２４０倍以上では、副作用防止の点に限定するならば、無駄になるキチン・キトサンの量が増加するだけで好ましくない。但し、高血圧症、高脂血症、食欲増進、肥満対策、肩こり・腰痛の改善などの健康食品としての効果も併せ望むならば、この限りではない。
【００３５】本発明で使用する５−ＦＵ及びキチン・キトサンの形状は特に限定されないが、カプセル剤、錠剤等の徐放性の持続製剤にして使用するためには、両者とも粉末であることが便利で好都合である。
【００３６】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限定されるものではない。また実施例及び比較例を通じてパーセントは格別の指示なき限り、すべて重量表示による。
【００３７】実験材料：キチン・キトサンは、富士バイオ（株）の製品を使用したが、キトサンは塩酸塩に転換されて、固有粘度が約１００ｃＰであった。粘度法による平均分子量は約１００〜２００キロダルトンで、アセチル化度は１４％であった。以後簡単化のために単にキトサンと略記するが、正確にはキトサン８６％とキチン１４％からなるものである。キトサンを蒸留水に懸濁し、そのまま使用した。５−ＦＵは和光純薬の製品を使用した。〔６− ３Ｈ〕５−ＦＵ（比活性：４６２．５ＧＢｑ／ミリモル）はＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社（ボストン、米国、マサチューセッツ州）の薬品を使用した。マウスリンパ球分離媒質（Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅｓ−Ｍｏｕｓｅ）は大日本製薬の製品を使用した。フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗・マウスＣＤ８及びフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗・マウスＮＫ１．１はＳｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ．（英国、オックスホード）の製品を使用した。その他の化学薬品は試薬級の物を使用した。ザルコーマ１８０癌細胞は、愛媛大学、医学部、医化学第二教室に保存しているものを使用した。
【００３８】実験動物：雄のＩＣＲ系統マウス（生後６週間）及び雄のＣ５７ＢＬ／６系統マウス（生後５週間）をクレア ジャパン社及びチャールス リバー ジャパン社から購入した。両方のマウスを２５±１℃、６０％ＲＨに維持した部屋で１週間飼育し、自由に水と食料を摂取させた。部屋は朝７時に点灯して１日に１２時間照明を行った。
【００３９】抗悪性腫瘍活性及び副作用の測定：固形型のザルコーマ１８０癌細胞を０日目にマウスの背部に１．５×１０６個を皮下移植して作った。癌細胞の移植１２時間後から、比較例として５−ＦＵ（１．２５ｍｇ／ｋｇ体重）あるいは実施例として５−ＦＵ（１．２５ｍｇ／ｋｇ）＋キトサン（１５０ｍｇ／ｋｇ、３７５ｍｇ／ｋｇ又は７５０ｍｇ／ｋｇ体重）を、それぞれ蒸留水に溶解及び懸濁し、朝夕２回（午前７時と午後７時）、８日間継続して投与した。対照マウスには蒸留水だけを同一計画表によって経口投与した。
【００４０】９日目にジエチルエーテル麻酔下静脈からヘパリン採血し、次いで癌、小腸、肝臓、脂肪組織及び脾臓を切除し、抗腫瘍活性及び副作用の評価のために重量を測定した。ヘパリンを含有する試験管中で血液サンプルを冷蔵し、白血球の数をクールター計数管（日本科学機器（株）製）を使用して測定した。
【００４１】ザルコーマ１８０担癌マウスの小腸粘膜のスクラーゼ活性の測定小腸を冷０．９％ＮａＣｌで洗浄して内容物を取り除いた。次いで粘膜をスライドガラスで削り取り、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザー（スイス、キネマチカ社製）を使用して、最終容積２ｍｌになるように８０ミリモル（ｍＭ）のリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と共に均一化した。スクロース活性を木村等の方法（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３０，４４４４−４４４７（１９８２）及びＰｌａｎｔａ Ｍｅｄ．，５０，４６５−４６８（１９８４）参照）により測定した。要するに、検定は全容積０．５ミリリットル中の５ｍＭスクロース、８０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）中にホモゲネート（５０マイクロリットル）を含有する反応混合物について３７℃で３０分行った。遊離したグルコースをグルコースオキシダーゼ試薬を使用して定量した。
【００４２】５−ＦＵリン酸エステルの測定検定される酸素溶液をザルコーマ１８０癌細胞から調製した。癌細胞ペレットを２−メルカプトエタノールを５ｍＭ含有する５ｍＭのトリス塩酸塩（ｐＨ ８．０）の４容積と共に均一化した。ホモゲネートを４℃で６０分間１０５，０００ｇで遠心分離し、上澄液画分を池中等の方法（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７０，３５３−３５９（１９７９））による５−ＦＵリン酸エステル化の検定のために使用した。
【００４３】統計分析と薬物動力学全ての数値を平均値±標準偏差（ＳＥ）として表した。統計分析をスーパーＡＮＯＶＡソフトウエアを使用して有意性を決定するためにＤｕｎｎｅｔ試験でなし遂げた。薬物動力学パラメータをＭａｃ ｖｅｒ ２．０ソフトウエア（明治製薬 薬学研究センター）用のＰＫを使用して求めた。
【００４４】実施例及び比較例５−ＦＵ単独使用を比較例とし、５−ＦＵとキトサンの併用を実施例として、下記の諸測定を行った。
【００４５】ザルコーマ１８０担癌マウスにおける５−ＦＵ由来の下痢の出現日の測定固形型のザルコーマ１８０癌細胞を０日目にマウスの背部に１×１０６ 個皮下移植して作った。癌細胞の移植１２時間後から、５−ＦＵ（２５ｍｇ／ｋｇ体重）又は５−ＦＵ（１２．５ｍｇ／ｋｇ体重）＋キトサン（１５０ｍｇ／ｋｇ又は７５０ｍｇ／ｋｇ体重）を、それぞれ蒸留水に溶解及び懸濁し、下痢が出現するまで毎日朝夕２回（午前７時と午後７時）投与した。対照マウスには蒸留水だけを同一計画表によって経口投与した。
【００４６】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＴ細胞集団（ＣＤ８＋及びＮＫ１．１＋ Ｔ細胞）と白血球数の測定５−ＦＵ（１２．５ｍｇ／ｋｇ体重）又は５−ＦＵ（１２．５ｍｇ／ｋｇ体重）＋キトサン（１５０ｍｇ／ｋｇ又は７５０ｍｇ／ｋｇ体重）を、それぞれ蒸留水に溶解及び懸濁し、毎日朝夕２回（午前７時と午後７時）、７日間経口投与した。対照マウスには蒸留水だけを同一計画表によって経口投与した。８日目に、マウスの頸部を脱臼させて殺し、脾臓を素早く摘出した。器官を冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ ７．４）を使用して解剖鉗子により細胞を脱離させるためにおだやかに掻き裂いた。５ミリリットルの細胞懸濁液を５ミリリットルのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅｓ−Ｍｏｕｓｅ上に置き、１５００ｇで３０分間遠心分離した。界面で白血球バンドを回収し、細胞をＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で３回すすいだ。白血球の数をクールター計数管を使用して測定した。細胞濃度を２×１０６細胞／１００マイクロリットルに調整後、１０マイクロリットルのＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８又はＰＥ標識抗マウスＮＫ１．１を１００マイクロリットルの細胞懸濁液に添加した。４℃で３０分間温置後、白血球をＰＢＳ１ミリリットルで３回すすぎ、７００ｇで５分間遠心分離し、次いでＣＤ８＋及びＮＫ１．１＋Ｔ細胞集団をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎカリホルニア州、マウンテン ビュー）を使用するフローサイトメータにより分析した。
【００４７】マウスの血液中の５−ＦＵの測定５−ＦＵ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）又は５−ＦＵ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）＋キトサン（７５０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに経口投与した。５−ＦＵ及び５−ＦＵ＋キトサンの投与５、１５、３０、６０、９０及び１２０分後に麻酔下に静脈からヘパリン採血した血液を、血清を分離するために４℃で１０分間１５００ｇで遠心分離した。血清試料（１ミリリットル）をクロロホルム５ミリリットルと共に１０分間振とうした。混合物を４℃で１０分間１５００ｇで遠心分離し、有機相を除去した。残留水相中の５−ＦＵを酢酸エチル４ミリリットルで２回抽出し、酢酸エチル抽出物を窒素ガス流下に４０℃で濃縮した。次いで残留物を蒸留水に溶解し、５−ＦＵ含量を次のクロマトグラフィ条件下に逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により定量した。監視波長 ２８０ｎｍ、流量 １ミリリットル／分、移動相 ５ｍＭ希ギ酸でｐＨ５に調整したメタノール２％含有５ｍＭテトラブチルアンモニウム溶液。
【００４８】ザルコーマ１８０担癌マウスにおける癌、小腸並びに脾臓組織のＰＣＡ可溶及びＲＮＡ画分への５−ＦＵ取り込みの測定〔６− ３Ｈ〕５−ＦＵ（１２．５ｍｇ／ｋｇ、１８．５ＭＢｑ／ｋｇ）又は〔６− ３Ｈ〕５−ＦＵ（１２．５ｍｇ／ｋｇ、１８．５ＭＢｑ／ｋｇ）＋キトサン（１５０ｍｇ／ｋｇ又は７５０ｍｇ／ｋｇ）を癌細胞内移植後９日目にザルコーマ１８０担癌マウスに投与した。１又は４時間後、マウスを犠牲にして癌、小腸及び脾臓組織を摘出して敏速に凍結し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。癌組織（５００ｍｇ）、小腸（１．０ｇ）及び脾臓（１００ｍｇ）を１０％過塩素酸（ＰＣＡ）５容積で均一化し、４℃で１０分間１５００ｇで遠心分離した。癌、小腸及び脾臓のＰＣＡ可溶画分中に取り込まれた、５−ＦＵとそのヌクレオシド及びヌクレオチドの混合物である、５−ＦＵの放射能を液体シンチレーション計数管を使用して測定した。ＰＣＡ沈殿性材料中に存在するＲＮＡ画分中へ取り込まれた放射能を、ＲＮＡ中に取り込まれた５−ＦＵの量の定量のために僅かに改変したシュナイダー等の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，１６４，７４７−７５１（１９４６）参照）を使用して抽出した。
【００４９】ザルコーマ１８０担癌マウスにおける５−ＦＵとキトサン併用の抗腫瘍活性図１は、実験期間中の各群の体重の変化を示す。ザルコーマ１８０担癌マウス（対照群）、５−ＦＵ治療群と５−ＦＵ＋キトサン治療群の間には有意差がなかった（図１参照）。図２に示すように、５−ＦＵはザルコーマ１８０担癌マウスの癌重量を減少させた。５−ＦＵ＋キトサン（１５０ｍｇ、３７５ｍｇ及び７５０ｍｇ／体重×２回／日）もまた癌の成長を抑制した（図２参照）。しかしながら、５−ＦＵ治療群と５−ＦＵ＋キトサン（１５０ｍｇ、３７５ｍｇ及び７５０ｍｇ／ｋｇ×２回／日）群の間には有意差がなかった。これらの結果は、キトサンが５−ＦＵの抗腫瘍活性を維持することを示す。
【００５０】ザルコーマ１８０担癌マウスにおける５−ＦＵ由来の骨髄障害及び胃腸障害に対するキトサンの効果次に、５−ＦＵ由来のいくつかの副作用：骨髄障害、胃腸障害及び免疫機能の低下に対するキトサンの効果を試験した。５−ＦＵによる治療は、白血球数と小腸の重量を減少させた（図３及び図４参照）。これらの事実は、５−ＦＵは骨髄障害と胃腸障害をひき起こすことを示した。図３に示すように、５−ＦＵ投与によりひき起こされた白血球の減少は、キトサン（１５０ｍｇ又は７５０ｍｇ／ｋｇ×２回／日）の経口投与により有意的に抑制された。５−ＦＵによりもたらされた小腸の重量の減少もまた、キトサン（７５０ｍｇ／ｋｇ×２回／日）により抑制された（図４参照）。小腸粘膜のスクラーゼ活性は、ザルコーマ１８０担癌マウスにおける５−ＦＵの経口投与により低下し（図５参照）、５−ＦＵが小腸粘膜を損傷することを示した。５−ＦＵ＋キトサン（１５０ｍｇ、３７５ｍｇ又は７５０ｍｇ／ｋｇ×２回／日）は、小腸粘膜のスクラーゼ活性の低下を有意的に抑制した。更に、表１に示すように、２倍高い用量（２５ｍｇ／ｋｇ×２回／日）の５−ＦＵの投与は、５日後に下痢の発生をもたらした。５−ＦＵ（２５ｍｇ／ｋｇ×２回／日）によりひき起こされた下痢の発生は、キトサン（１５０ｍｇ又は７５０ｍｇ／ｋｇ×２回／日）の経口投与により遅らされた（表１参照）。
【００５１】
【表１】

【００５２】５−ＦＵ由来の脾臓の免疫機の低下に対するキトサンの影響５−ＦＵは、脾臓と胸線の重量減少と共に免疫抑制と免疫障害をひき起こすことを多くの研究者が報告している。図６に示すように、５−ＦＵ（１２．５ｍｇ／ｋｇ×２回／日）によりもたらされた脾臓の重量減少は、ザルコーマ１８０担癌マウスにおけるキトサン（７５０ｍｇ／ｋｇ×２回／日）の経口投与により抑制された。したがって、５−ＦＵによりもたらされた免疫機能障害のキトサンによる防止を明らかにするために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける７日間の５−ＦＵ（１２．５ｍｇ／ｋｇ×２回／日）投与後の脾臓のＣＤ８＋とＮＫ．１．１＋Ｔ細胞とリンパ球の数に対するキトサンの影響を研究した。表２に示すように、キトサン（１５０ｍｇ及び７５０ｍｇ／ｋｇ×２回／日）は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるリンパ球、ＣＤ８＋及びＮＫ．１．１＋ Ｔ細胞の数及び脾臓の重量に影響がなかった。他方、脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞とリンパ球の数は、５−ＦＵの投与により有意的に減少した。脾臓の重量とＮ．Ｋ．１．１＋ Ｔ細胞の数もまた、減少は有意的でないが、５−ＦＵの投与により減少する傾向がある。キトサンは、５−ＦＵによりもたらされたリンパ球、ＣＤ８＋細胞及びＮ．Ｋ．１．１＋ Ｔ細胞の数の減少を抑制した（表２参照）。更に、脾臓の重量及びリンパ球、ＣＤ８＋及びＮ．Ｋ．１．１＋ Ｔ細胞の数は、増加は有意的でないが、キトサン（７５０ｍｇ／ｋｇ×２回／日）により増加する傾向があった（表２参照）。
【００５３】
【表２】

【００５４】５−ＦＵとキトサンの併用経口投与後のマウスの血漿中の５−ＦＵ濃度図７に示すように、マウスの血中の５−ＦＵ濃度は、５−ＦＵ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）の経口投与後５分と１５分で、それぞれ薬１６０ｎｇ／ミリリットル及び２００ｎｇ／ミリリットルで、次いで迅速に低下した。表２は、５−ＦＵ投与に関するＴ１／２ 、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ及びＡＵＣ（０〜１２０分）が、それぞれ３０．９分、１０．１分、１９５．４ｎｇ／ミリリットル及び１６８．５ｎｇ・ｈ／ミリリットルであることを示した。他方、マウスの血中の５−ＦＵ濃度は、５−ＦＵ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）＋キトサン（７５０ｍｇ／ｋｇ）の併用投与後５、１５、３０及び６０分で、それぞれ１３２ｎｇ／ミリリットル、１２９ｎｇ／ミリリットル、１１０ｎｇ／ミリリットル及び６９ｎｇ／ミリリットルであった（図７参照）。５−ＦＵ＋キトサンに対するＴ１／２ 、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ及びＡＵＣ（０〜１２０分）のような薬物動力学パラメータは、それぞれ５９．６分、７．５分、１３６．４ｎｇ／ミリリットル及び１５９．２ｎｇ・ｈ／ミリリットルであった（表３参照）。したがって、血液の５−ＦＵ濃度のＣｍａｘは、５−ＦＵとキトサンの併用経口投与により減少したが、血液の５−ＦＵ濃度のＡＵＣ（０〜１２０分）は、影響を受けなかった。
【００５５】
【表３】

【００５６】ザルコーマ１８０担癌マウスにおける癌のＰＣＡ可溶及びＲＮＡ画分、小腸及び脾臓中への５−ＦＵの取り込みに対するキトサンの影響表４に示すように、キトサン（７５０ｍｇ／ｋｇ）は、 ３Ｈ−５−ＦＵ（１２．５ｍｇ／ｋｇ、１８．５ＭＢｑ／ｋｇ）の経口投与後１時間及び４時間の脾臓のＰＣＡ可溶及びＲＮＡ画分並びに小腸中への ３Ｈ−５−ＦＵの取り込みを抑制した。他方、癌のＰＣＡ可溶及びＲＮＡ画分中への ３Ｈ−５−ＦＵの取り込みは、キトサン（１５０ｍｇ及び７５０ｍｇ／ｋｇ）の投与により抑制されなかった（表４参照）。これらの結果は、キトサンが癌細胞中へ５−ＦＵの取り込みを抑制せずに、正常細胞への５−ＦＵの取り込みを抑制することによって、抗腫瘍活性を低下させることなく、５−ＦＵにより誘起された胃腸障害及び免疫担当器官障害を防止することを示唆する。
【００５７】
【表４】

【００５８】なお、上記の実施例を通じて、本来はキトサンは胃腸内の塩素による無駄な浪費を防止するために、カプセル剤等の溶腸形態で投与すべきであるが、被験動物が体重が３０〜４０ｇの小型のマウスであり、実施不可能であるため懸濁液の形で経口投与した。
【００５９】上記の実施例に示した結果は、キチン・キトサンの５−ＦＵとの併用は、５−ＦＵ単独の抗腫瘍効果を維持もしくは増強しながら、５−ＦＵによる白血球減少及び小腸粘膜酵素活性の低下を防止することを示した。さらに、５−ＦＵ投与による下痢の出現もキチン・キトサン投与によって遅延することを示した。また、キチン・キトサンの投与は、５−ＦＵによる免疫機能低下を阻止することを示した。先に、本発明者等はキチン・キトサンがＮＫ活性増強作用を有することを報告している。また、キチン・キトサンが小腸上皮細胞間リンパ球のＮＫ様活性増強作用を有することを見出している。それゆえ、上記の結果は、キトサンの効果が、小腸及び脾臓組織中への５−ＦＵの取り込みの選択的抑制によることを示唆している。
【００６０】
【発明の効果】本発明によれば、キチン・キトサンと５−ＦＵの組合せが５−ＦＵによる白血球減少、小腸粘膜酵素活性の低下と免疫機能低下の防止に有用であるので、キチン・キトサンは５−ＦＵからなる癌化学療法剤の副作用防止剤として可能性を有し、しかも血液中の５−ＦＵ濃度を低くすることで、癌細胞には取り込まれるが、正常細胞には取り込まれにくくなるだけでなく、より長い時間５−ＦＵが存在することで、癌細胞に対する作用が強くなる可能性も生じる。
【出願人】 【識別番号】５９９１００５０１
【氏名又は名称】富士バイオ株式会社
【出願日】 平成１１年７月１６日（１９９９．７．１６）
【代理人】 【識別番号】１０００７４１４７
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 崇
【公開番号】 特開２００１−３１５７５（Ｐ２００１−３１５７５Ａ）
【公開日】 平成１３年２月６日（２００１．２．６）
【出願番号】 特願平１１−２０３７６１