| 【発明の名称】 |
マウス精子凍結保存用キット |
| 【発明者】 |
【氏名】中潟直己
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| 【要約】 |
【課題】凍結保存した精子の融解後の生存率および運動性が高く、それゆえ高い体外受精率が得られるマウス精子凍結保存用キットを提供すること。
【解決手段】ラフィノースおよび蛋白源を含有するマウス精子の凍結保存用液、ストローおよびシャーレを含むマウス精子凍結保存用キット。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ラフィノースおよび蛋白源を含有するマウス精子の凍結保存用液、ストローおよびシャーレを含むマウス精子凍結保存用キット。
【請求項２】 マウス精子の凍結保存用液中のラフィノースおよび蛋白源の含有量が、それぞれ１重量％〜３０重量％および０．１重量％〜２０重量％である請求項１に記載のマウス精子凍結保存用キット。
【請求項３】 蛋白源が、スキムミルク、ウシ血清アルブミンおよび血清からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１または２に記載のマウス精子凍結保存用キット。
【請求項４】 マウス精子の凍結保存用液が水溶液の形態である請求項１〜３のいずれかに記載のマウス精子凍結保存用キット。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、体外受精用のマウス精子の凍結保存に関し、より詳細には、凍結保存した精子の融解後の生存率および運動性が高く、それゆえ高い体外受精率が得られるマウス精子凍結保存用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、遺伝子改変雄マウスと市販の雌マウスとの間で体外受精を行い、大量に作出した胚を凍結保存することが行われている。胚の大量作出には高い体外受精率を得ることが必須である。このような体外受精には、凍結保存された雄マウス精子がしばしば用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の保存用液を用いてマウス精子を凍結保存した場合、融解後の精子の生存率および運動性が低く、それゆえ体外受精率が低くなるという問題があった。
【０００４】本発明は、上記問題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、融解後の精子の生存率および運動性が高く、それゆえ高い体外受精率が得られるマウス精子凍結保存用キットを提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に対し、鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００６】本発明のマウス精子凍結保存用キットは、マウス精子の凍結保存用液、ストローおよびシャーレを含む。そのことにより、上記目的が達成される。
【０００７】本発明のマウス精子の凍結保存用液は、ラフィノースおよび蛋白源を含有する。
【０００８】好適な実施態様において、マウス精子の凍結保存用液中のラフィノースおよび蛋白源の含有量は、それぞれ１重量％〜３０重量％および０．１重量％〜２０重量％である。
【０００９】好適な実施態様において、蛋白源は、スキムミルク、ウシ血清アルブミンおよび血清からなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１０】好適な実施態様において、マウス精子の凍結保存用液は水溶液の形態である。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。
【００１２】本発明において、凍結保存された精子の融解後の生存率は、全精子数に対する運動性を呈している精子数の割合により決定される。
【００１３】本発明において、凍結保存された精子の融解後の運動性は、全精子数に対する前進運動を呈している精子数の割合により決定される。
【００１４】本発明において、凍結保存された精子の体外受精率は、体外受精後、２細胞期に発生した胚および未受精卵の数を計測し、以下の式に代入することにより算出される：体外受精率（％）＝｛２細胞期胚の数／（２細胞期胚の数＋未受精卵の数）｝×１００。
【００１５】本発明のマウス精子の凍結保存用液は、ラフィノースおよび蛋白源を含有する。
【００１６】ラフィノースは、非還元性三糖の１種であり、メリトース、メリトリオース、ゴシポースまたは６G−α−Ｄ−ガラクトシルスクロースとも呼ばれる。ラフィノースは、本発明のマウス精子の凍結保存用液において、精子細胞膜を保護し、凍結・融解による細胞膜の損傷を防ぐ作用を奏する。
【００１７】本発明のマウス精子の凍結保存用液中のラフィノースの含有量は、好ましくは１重量％〜３０重量％、より好ましくは１０重量％〜２５重量％、最も好ましくは１５重量％〜２１重量％である。含有量が１重量％より少ない場合、融解後の精子の運動性が極端に低下するという問題があり、３０重量％より多い場合、短時間の保存でも、作製した凍結保存用液中にラフィノースの結晶が析出してくるという問題がある。
【００１８】蛋白源は、本発明のマウス精子の凍結保存用液において、ラフィノースの精子細胞膜に対する保護効果をより高める作用を奏する。蛋白源の例としては、例えば、スキムミルク、ウシ血清アルブミン、血清などが挙げられる。カゼイン、アルブミン、グロブリン、プロテオース、ペプトンなど種々の蛋白を含有し、それゆえ複合的保護効果を奏する理由から、スキムミルクが好ましい。これらの蛋白源は、単独で使用してもよく、また組み合わせて使用してもよい。
【００１９】本発明のマウス精子の凍結保存用液中の蛋白源の含有量は、好ましくは０．１重量％〜２０重量％、より好ましくは１重量％〜１０重量％、最も好ましくは２重量％〜４重量％である。含有量が０．１重量％より少ない場合、保護効果がほとんど認められないという問題があり、２０重量％より多い場合、凍結保存用液中の浸透圧が高くなることにより、精子の生存性が低下するという問題がある。
【００２０】本発明のマウス精子の凍結保存用液の形態は、特に限定されないが、好ましくは溶液であり、より好ましくは水溶液である。水溶液に用いる水としては、蒸留水、注射用蒸留水などが好ましい。
【００２１】本発明のマウス精子の凍結保存用液は、ラフィノースおよび蛋白源を、例えば水に溶解することにより調製され、次いで、例えばミリポアろ過装置を用いてろ過滅菌され、容器（例えば、アンプル、バイアルなど）に注入され、そして封入される。もっとも、ラフィノースおよび蛋白源は、一緒に、または両者を別個に容器（例えば、アンプル、バイアル等）に保存してもよい。その際、少なくとも一方を水溶液としてもよく、また両者を水溶液としてもよく、さらには下記に説明するキットの構成として水のみを容器、例えばアンプル等に充填して保存し、用時に水溶液としてもよい。
【００２２】本発明のマウス精子の凍結保存用液は、ラフィノースおよび蛋白源を含有することにより、凍結保存した精子の融解後の生存率および運動性が高く、それゆえ高い体外受精率が得られるという効果を奏する。
【００２３】本発明のマウス精子凍結保存用キットは、上記マウス精子の凍結保存用液、ストローおよびシャーレを含む。
【００２４】ストローは、凍結保存用液に懸濁させたマウス精子を充填し、凍結保存するためのいわゆる凍結保存容器として機能する。ストローの内径および長さは特に限定されないが、精子凍結時の温度における均一性の理由から、内径０．５ｍｍ〜３ｍｍが好ましい。
【００２５】シャーレは、凍結保存用液中のマウス精子懸濁液を作製するために使用される。本発明の凍結保存用キットに用いられるシャーレの一実施態様を図１に斜視図にて示す。図１はシャーレ１の上面図であり、シャーレ１にはウェル２が好適には４つ設けられている。シャーレ１はフタ（図示せず）を有する。なお、図１には４つのウェル２が図示されているが、ウェル２の数は特に４つに限定されない。しかしながら、摘出した精巣上体尾部上の血液を取り除くために、ラフィノースを含む凍結保存用液で洗浄しなければならないため、ウェル２の数は偶数が好ましい。
【００２６】上記ストローおよびシャーレは、エチレンオキシドグリコール（ＥＯＧ）滅菌された後包装される。
【００２７】本発明のマウス精子凍結保存用キットはまた、必要に応じて外箱および／または取扱説明書を含み得る。
【００２８】次に、本発明のマウス精子凍結保存用キットを用いてマウス精子を凍結保存する手順の一例を説明する。
【００２９】（精子の凍結保存）
１．成熟雄マウス（１２週齢以上）の精巣上体尾部２個をシャーレ（４ウェルマルチディッシュ）内の４つのウェル内の１００μｌの凍結保存用液中に移し、精巣上体管を細切後、シャーレを１分間振盪させ、精子を凍結保存用液中に懸濁する。
【００３０】２．ストローへの精子懸濁液の充填（ａ）まず、ストローを１ｍｌのシリンジに装着し、培養液（ＨＴＦ）を約１００μｌ吸引する。すなわち、精子懸濁液は１本のストローに少量しか充填されないため、そのまま凍結に使用される液体窒素中に保存するとストローが液体窒素表面に浮いてしまうので、ストローの容積の約半分の培養液を「おもり」として充填する。培養液としては、ＨＴＦ、ＴＹＨ、ｍＷＭおよびＲ１８Ｓ３が例示される。
【００３１】（ｂ）シャーレのフタに１０μｌの精子懸濁液を取り、充填した培養液との間に１０ｍｍの空気相を挟んで精子懸濁液をストローに充填する。
【００３２】（ｃ）ストローの両端部に１０ｍｍの空気相を作製し、シーラーで封止する。
【００３３】上記（ｂ）および（ｃ）において、空気相は、培養液および精子懸濁液が凍結することにより膨張するため、そのクッションとして設けられる。
【００３４】３．凍結用フロートに精子を充填したストローを入れ、液体窒素保管器内の液体窒素表面に静置する。
【００３５】４．約１５分間静置後、フロートを液体窒素中に浸漬し、精子を凍結保存する。
【００３６】上記のようにして凍結保存されたマウス精子は、用時に融解され、そして例えば、凍結保存された未受精卵または透明帯切開卵子と共に体外受精に供され得る。未受精卵の凍結保存、精子の融解、未受精卵の融解、透明帯切開術および体外受精は、当該分野で公知の従来の手順に従って行われ得る。参考のために以下にそれらの手順を示す。
【００３７】（未受精卵の凍結保存）
１．成熟雌マウスに、５単位／匹の妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳ）を腹腔内注射し、その４８時間後に５単位／匹のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）を腹腔内注射して過排卵処理を施す。ｈＣＧ注射１４時間後、過排卵処理を施した雌マウスの卵管膨大部より卵子塊を採取し、ヒアルロニダーゼ処理により卵丘細胞を除去して未受精卵を得る。得られた未受精卵を２０％牛胎仔血清（ＦＣＳ）を含む培養液（ＨＴＦ）内で１０分間培養する。
【００３８】２．室温にて１Ｍ ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）を含むリン酸緩衝液溶液のドロップ（１００μｌ）をシャーレに作製する。作製するドロップの数は、凍結チューブの本数＋１（例えば、凍結チューブが３本の場合、４個のドロップ）である。
【００３９】３．上記１．で培養した未受精卵を１Ｍ ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液溶液の１つのドロップへ静かに移す。
【００４０】４．未受精卵がシャーレの底に沈んだら、残りの１Ｍ ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液溶液のドロップに未受精卵を均等に分けて移す（通常、１ドロップ当り４０個の未受精卵）。
【００４１】５．２０μｌ用のオートピペッターを用いて、５μｌの１Ｍ ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液溶液と共に未受精卵を凍結チューブに移し、予め０℃にしておいた冷却装置に移す。なお、冷却装置は、ブロッククーラー（ＣＨＴ−１００、ＩＷＡＫＩ）あるいはラブトップクーラー（５１１５−００１２、ナルゲン）を用いる。あるいは、氷水を用いて冷却してもよい。
【００４２】６．５分後、予め０℃に冷却しておいた簡易ガラス化保存用液（ＤＡＰ２１３：２Ｍ ＤＭＳＯ、１Ｍアセトアミドおよび３Ｍプロピレングリコールを含むリン酸緩衝液）９５μｌを凍結チューブの管壁を伝わらせて静かに添加する。なお、上記４．における０℃、１Ｍ ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝液溶液での平衡時間が多少延びても、融解後の未受精卵の生存性には影響しない。従って、数本の凍結チューブを同時に凍結する場合は、最後の凍結チューブを０℃の冷却装置に移してから５分後に、ＤＡＰ２１３を添加する。
【００４３】７．さらに５分後、凍結チューブをケーンに装着し、直ちに液体窒素中に浸漬し、未受精卵を凍結保存する。なお、ケーンは液体窒素中で予め冷却しておく。また、数本の凍結チューブを同時に凍結する場合は、上記６．の操作時と同様、最後の凍結チューブにＤＡＰ２１３を添加してから５分後に、凍結チューブをケーンに装着し、液体窒素内に浸漬する。
【００４４】（精子の融解）
１．凍結保存しているストローを液体窒素中から取り出し、３７℃の温水中に浸漬する。
【００４５】２．１５分間放置後、温水からストローを引き上げ、ストローの表面の水分を紙でぬぐった後、精子懸濁液側のシール部を切り取って精子懸濁液のみをシャーレに取り出す。
【００４６】３．精子懸濁液１〜２μｌを、マイクロピペッターを用いて、予め作製しておいた２００μｌの受精用培地（ＨＴＦ）のドロップに移し、このドロップをパラフィンオイルで被覆し、１時間前培養する。この精子懸濁液を体外受精に供する。
【００４７】（体外受精）
１．１時間前培養した精子懸濁液の濃度を算定する。
【００４８】２．未受精卵の入ったドロップの精子濃度が１μｌあたり２００精子になるように、精子懸濁液の一部を未受精卵のドロップに導入する。
【００４９】３．３時間後に卵子を新鮮な培養液（ＨＴＦ）で洗浄し、２細胞期へ発生した胚のみを選別する。
【００５０】（透明帯切開術）凍結保存した精子の運動性が低い場合は、透明帯切開卵子を用いて体外受精を行う。
【００５１】１．シャーレの中央に１００μｌの０．３Ｍスクロースを含むリン酸緩衝液溶液（ＢＳＡを含まないもの）のドロップを作製し、ドロップ上部に３０〜４０個の卵丘除去卵子を少量の培養液と共に移す。
【００５２】２．すべての卵子が完全に沈み、シャーレの底に付着したら、ドロップを流動パラフィンで被覆する。
【００５３】３．３０Ｇの注射針で透明帯の一部を切開する。すなわち、ゆっくりと針先を下ろして、卵子の上部に触れたら針先を透明帯に押し付け、シャーレの底を傷つけるように手前に引くことにより透明帯を切開する。
【００５４】４．すべての卵子の透明帯を切開し終えたら、４％ＢＳＡおよび０．３Ｍスクロースを含むリン酸緩衝液溶液を２０μｌ加え、透明帯切開側とは逆の方向からピペッティングすることにより、卵子をシャーレの底から剥がす。
【００５５】５．卵子を注意深く回収し、ＨＴＦで洗浄後、体外受精に供する。
【００５６】得られた２細胞期胚は、上記（未受精卵の凍結保存）と同様の手順を用いて凍結保存され得、そして凍結保存された胚は、当該分野で公知の従来の手順を用いて融解され、例えば、当該分野で公知の経卵管壁卵管内移植法により雌マウスに移植され得る。参考のために以下にその手順を示す。
【００５７】（経卵管壁卵管内移植法）
（ａ）受容雌の準備１．受容雌には、Ｊｃｌ：ＭＣＨ（ＩＣＲ）を用いる。移植前日の夕方３時〜５時に雌マウスの外陰部を観察して発情前期にあるものを選び、精管結紮雄マウスと同居させる。
【００５８】２．雄マウスと同居させた翌日、膣栓を確認した雌マウスを受容雌として用いる。
【００５９】３．ネンブタールで麻酔をした受容雌の側面中央の毛を刈り、腹壁を切開する。
【００６０】４．卵巣・卵管・子宮を体外に露出させ、卵巣に付着した脂肪をクレンメで固定する。
【００６１】（ｂ）胚とキャピラリーの準備１．２００μｌのｍＷＭのドロップをシャーレの中央に作製し、２０個の胚を入れる。
【００６２】２．キャピラリー（外径２００〜２５０μｍ）に空気と培養液とを２〜３ｍｍ間隔で交互に吸引し、その先端に約１０個の胚を吸引する。
【００６３】（ｃ）移植１．卵管采および膨大部を確認し、両者間の卵管壁の一部をノエス剪刀で直径の約１／２〜２／３程度切開する。
【００６４】２．膨大部側卵管壁を細胞用マイクロピンセットでつまみあげ、その開口部から胚を含むキャピラリーを膨大部側の卵管内に挿入する。
【００６５】３．膨大部に空気の泡が２〜３個入るまで静かに息を吹き込む。空気の泡を一緒に吹き込むことにより、胚が膨大部に到着したことを確認する。
【００６６】４．クレンメを外し、卵巣・卵管・子宮を静かに体内に戻す。
【００６７】５．皮膚をオートクリップで止めて、麻酔がさめるまでマウスを保温する。
【００６８】以上のように、本発明のマウス精子凍結保存用キットを用いてマウス精子を凍結保存することにより、高い体外受精率で体外受精を行うことができる。
【００６９】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。
【００７０】（実施例１）ラフィノースおよびスキムミルクを、それらの含有量がそれぞれ１８重量％および３重量％となるように蒸留水に溶解し、凍結保存用液を調製した。
【００７１】（実施例２）上記実施例１で調製した凍結保存用液を、ミリポアろ過装置を用いてろ過滅菌し、アンプルに注入し、そして封入した。次いで、内径１．２ｍｍのストローおよび４ウェルシャーレをエチレンオキシドグリコール滅菌し、それぞれ別個に包装した。これらアンプル、ストローおよびシャーレを組み合わせ、凍結保存用キットを作製した。
【００７２】（実施例３）内径１．８ｍｍのストローを用いたこと以外は、実施例２と同様にして凍結保存用キットを作製した。
【００７３】〔試験例〕上記実施例２および３で作製した凍結保存用キットを用いてマウス精子を凍結保存し、融解後の生存率および運動性、ならびに体外受精率を評価した。
【００７４】（凍結保存した精子の融解後の生存率）凍結保存した精子の融解後の生存率を、融解した精子懸濁液を精子活力検査板に滴下し、顕微鏡下で５視野を観察して、全精子数に対する運動性を呈している（少しでも動きのある）精子数の割合、すなわち、（運動性を呈している（少しでも動きのある）精子数）÷（全精子数）×１００により決定した。
【００７５】（凍結保存した精子の融解後の運動性）凍結保存した精子の融解後の運動性を、上記（凍結保存した精子の融解後の生存率）と同様の検査法により、全精子数に対する前進運動を呈している精子数の割合、すなわち、（前進運動を呈している精子数）÷（全精子数）×１００により決定した。
【００７６】（体外受精率の決定）体外受精後、２細胞期へ発生した胚および未受精卵を回収し、それらの数を計測した。得られた数を以下の式に代入し、体外受精率を計算した：体外受精率（％）＝｛２細胞期胚の数／（２細胞期胚の数＋未受精卵の数）｝×１００。
【００７７】（試験例１〜１０）上記実施例２および３で作製した凍結保存用キットを用いてマウス精子を凍結保存し、融解後の生存率および運動性、ならびに体外受精率を評価した：５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（１２週齢）の精巣上体尾部を摘出して切開し、漏出した精子塊を凍結保存用液（試験例１〜４：１２０μＬ、試験例５〜１０：１００μＬ）中に懸濁した。得られた懸濁液（試験例１〜４：９μＬ、試験例５〜１０：５μＬ）をストロー内に封入した。このストローを前処理した後、液体窒素内に１時間浸置した。その後、ストローを液体窒素内より取り出し、３７℃の温水中に１５分間放置し、精子を融解した。次いで、融解した精子をストローから取り出し、ＨＴＦ培地（１００μＬ）に懸濁し、上記方法に従って直ちに精子生存率および運動性を決定した。その結果を表１に示す。
【００７８】なお、上記前処理とは、（１）ストローを液体窒素液表面（気層）に１５分間放置する；あるいは（２）ストローをディープフリーザー内にアルミブロックをスタンドとして１時間放置する、のいずれかである。
【００７９】
【表１】
【００８０】表１から分かるように、本発明の凍結保存用キットを用いた試験例では、凍結保存した精子の融解後の生存率および運動性は高かった。
【００８１】
【発明の効果】本発明によれば、凍結保存した精子の融解後の生存率および運動性が高く、それゆえ高い体外受精率が得られるマウス精子凍結保存用キットを提供することができる。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５９６１５６９９０
【氏名又は名称】セアック吉富株式会社
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| 【出願日】 |
平成１２年５月１９日（２０００．５．１９） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００８０７９１
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
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| 【公開番号】 |
特開２００１−３２８９０１（Ｐ２００１−３２８９０１Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１３年１１月２７日（２００１．１１．２７） |
| 【出願番号】 |
特願２０００−１４９０３９（Ｐ２０００−１４９０３９） |
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