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【発明の名称】 変異型ミトコンドリアＤＮＡの生殖細胞への導入方法
【発明者】 【氏名】林 純一
【要約】 【課題】変異型ミトコンドリアDNAを生殖細胞へ導入するのに有効な方法の提供。

【解決手段】変異型ミトコンドリアDNAを有する脱核した細胞をミトコンドリアDNA欠損細胞と融合させてサイブリッドを作製し、該サイブリッドを脱核した後、生殖細胞と融合させることを特徴とする、変異型ミトコンドリアDNAの生殖細胞への導入方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 変異型ミトコンドリアDNAを有する脱核した細胞をミトコンドリアDNA欠損細胞と融合させてサイブリッドを作製し、該サイブリッドを脱核した後、生殖細胞と融合させることを特徴とする、変異型ミトコンドリアDNAの生殖細胞への導入方法。
【請求項２】 変異型ミトコンドリアDNAが欠失突然変異ミトコンドリアDNA4696である、請求項１記載の導入方法。
【請求項３】 請求項２記載の方法により作製された生殖細胞を仮親マウスに移植して得られるミトコンドリアDNAノックアウトマウス。
【請求項４】 生殖細胞が前核期の胚である、請求項３記載のミトコンドリアDNAノックアウトマウス。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、変異型ミトコンドリアDNAの生殖細胞への導入方法、および該方法を利用して作製されたミトコンドリアDNAノックアウトマウスに関する。
【０００２】
【従来の技術】突然変異ミトコンドリアDNAは、ミトコンドリア病、老化、そして様々な老化関連疾患と深い関係にあることが示唆されてきた(Wallace,D.C. Mitochondrialdiseases in man and mouse. Science283,1482-1488(1999)；Larsson,N.-G. & Clayton,D.A. Molecular genetic aspects of human mitochondrial disorders.Annu.Rev.Genet. 29, 151-178(1995)) が、両者の因果関係を説明できる確かな証拠は未だ見つかっていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ミトコンドリアDNA(以下、「mtDNA」と記載する)ノックアウトマウスを作製できれば、突然変異mtDNAがどのように子孫に伝わり、組織に分配されそこで様々な病気を発症するかを明らかにしていく上で理想的な実験系が提供されることになる。しかし、現在のところ、突然変異を誘発させたmtDNAを他の細胞のミトコンドリア内に導入するのに有効な方法は開発されていないため、上記マウスの作製に成功した例はない。本発明は、以上のような技術的背景のもとに為されたものであり、その目的は変異型mtDNAを生殖細胞のミトコンドリア内に導入する手段を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、変異型mtDNAを有する脱核した細胞をmtDNA欠損細胞と融合させてサイブリッドを作製し、該サイブリッドを脱核した後に生殖細胞と融合させることにより、変異型mtDNAをもつミトコンドリアを生殖細胞内にうまく導入できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、変異型mtDNAを有する細胞を脱核してmtDNA欠損細胞と融合させてサイブリッドを作製し、該サイブリッドを脱核した後、生殖細胞と融合させることを特徴とする、変異型mtDNAの生殖細胞への導入方法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の変異型mtDNAの生殖細胞への導入方法は、変異型mtDNAを有する細胞を脱核してmtDNA欠損細胞と融合させてサイブリッドを作製し、該サイブリッドを脱核した後、生殖細胞と融合させることを特徴とするものである。
【０００６】変異型mtDNAを有する細胞としては、例えば、欠失突然変異mtDNA4696を有する細胞を使用することができるが、これに限定されない。欠失突然変異mtDNA4696を有する細胞は本発明者らにより樹立された。変異型mtDNAを有する細胞の脱核は、例えばHayashi,J-I.ら、J.Biol.Chem 269,19060-19066(1994)の記載に従って、サイトカラシンB処理と高速遠心操作することにより実施することができる。
【０００７】マウスmtDNA欠損細胞、すなわちマウスρ0細胞としては、例えばρ0 C2C12細胞を使用することができるが、これに限定されない。マウスρ0細胞は本発明者らにより樹立されている(詳細については、Inoue,K.ら、Isolation of mitochondrial DNA-less mouse cell lines and their application for trapping mousesynaptosomal mitochondrial DNA with deletion mutations. J.Biol.Chem. 272,15510-15515；Inoue,K.ら、Isolation and characterization of mitochondrial DNA-less lines from various mammalian cell lines by application of ananticancer drug, ditercalinium. Biochem.Biophys.Res. Commun. 239,257-260(1997)参照)。
【０００８】変異型mtDNAを有する脱核した細胞とmtDNA欠損細胞との融合は、例えば、Hayashi,J-I.ら、J.Biol.Chem 269,19060-19066(1944)の記載に従って、ポリエチレングリコール処理することにより実施することができる。上記融合により作製したサイブリッドの脱核は、変異型mtDNAを有する細胞の脱核と同様に行なうことができる。生殖細胞としては、例えば前核期の胚を使用することができるが、これに限定されない。
【０００９】サイブリッドと前核期の胚との融合は、電気融合を用いる。以上のようにして作製された変異型mtDNAを導入された生殖細胞を利用して、マウス個体を作製することができる。この場合、該mtDNAを導入した胚を培養により4細胞期胚にまで発生させ、これを雌マウス(仮親)の輸卵管に移植してF0世代のマウスを得る。mtDNAは完全な母性遺伝をすることから、これらのF0世代の雌と正常なmtDNAを有する雄マウスとを交配することにより子孫マウスを作製することができる。
【００１０】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕 欠失突然変異mtDNAの前核期の胚への導入（１）欠失突然変異mtDNA(以下、「△mtDNA」と記載する)を有するサイブリッドの調製■ △mtDNAのmtDNA欠損細胞(ρ0細胞)への導入核を除いた培養細胞(NIH3T3細胞)を、マウスのmtDNA欠損細胞(すなわちρ0細胞)とポリエチレングリコール(PEG)処理により融合し、２６個のサイブリッドクローンを得た。
【００１１】■ △mtDNAを有するサイブリッドの選択△mtDNAがうまく導入されたサイブリッドを選択するため、下記のプライマーセットを用いてPCR(PCR条件：94℃で60秒、45℃で60秒、45℃で120秒を30サイクル)を行った。
（プライマーセット）
順方向プライマー：5'−aagaaaggaaggaatcgaaccccct−3'（配列番号１：正常型mtDNAの塩基配列6871−6895に相当)逆方向プライマー：5'−tatgttggaaggagggattggggta−3'（配列番号２：正常型mtDNAの塩基配列13666−13642に相当）
【００１２】２６個のサイブリッドクローンのうち8個のクローンにPCRで増幅されるシグナルを認めたので、これら８個のクローンの△mtDNA量をサザンブロット法により定量した。この中のほとんどのクローンはサザンブロット法で検出できるだけの△mtDNAを含んでいなかったが、クローンCy4696だけが30％の△mtDNAを有していた。この変異はマウスの培養細胞由来のものであった。
【００１３】このサイブリッドクローンCy4696の有する△mtDNA(以下、「△mtDNA 4696」と記載する)は、PCR産物の塩基配列の解析から、正常型mtDNAの4459番から12454番目に相当する4696bpを欠失しており、その欠失部分には6つのtRNA遺伝子と7つの構造遺伝子が含まれていた(△mtDNA4696の遺伝子地図を図 1aに示す)。この△mtDNA4696は、他に報告されているマウスの△mtDNA と異なり、欠失を起こした領域の周辺にダイレクトリピートは存在しない(△mtDNA4696のL鎖における欠失領域周辺の塩基配列を図 1bに示す)。
【００１４】Cy4696サイブリッドに含まれる△mtDNA4696の割合は、この細胞を37℃で30月培養している間に30%から83%にまで増加し、その後それ以上の増加は見られなかった。この挙動は、ミトコンドリア病のひとつであるKearns-Sayre症候群の原因とされてる△mtDNAを導入したヒトのサイブリッドで認められたそれと類似していた。おそらく△mtDNAはサイズが小さいため複製の際有利であり、長期の培養の間に正常型mtDNAを席巻したものと思われる。
【００１５】■ △mtDNA4696の病原性の確認次に、△mtDNA4696の病原性を以下の方法により確認した。まず、種々の割合(50〜90％)で△mtDNA4696を有するサイブリッドCy4696クローンについて、その呼吸活性(すなわちチトクロームcオキシダーゼ(COX)活性)を還元型チトクロムｃのシアン化合物感受性酸化の割合(％)として宮林らによる手法(Miyabayashi,S.ら、(1984) Brain Dev.6, 362-372)に従って測定し、△mtDNA4696の割合がCOX活性に及ぼす影響について分析した。結果を図 1cに示す。
【００１６】また、５個のCy4696サイブリット株(それぞれ、△mtDNA4696を56、67、82、84、85％有する）、マウスρ0細胞およびB82細胞(ρ0細胞親株)を制限酵素XhoIで消化し、得られた断片をサザンブロット法により検出した。結果を図 1dに示す。
【００１７】さらに、上記と同じ5個のCy4696サイブリッド株、マウスρ0細胞およびB82細胞それぞれのミトコンドリア内翻訳産物に[35S]メチオニンを取り込ませて標識し、ミトコンドリア画分を分離し、SDS電気泳動パターンをBAS2000で解析することによりそのミトコンドリア内翻訳系活性を分析した。結果を図 1eに示す。
【００１８】（結果）図１c〜eを比較することより、△mtDNA4696の割合の多いサイブリッドではCOX活性とミトコンドリア内翻訳系の活性が共に低下することがわかり、△mtDNA4696の病原性が立証された。試験したすべてのサイブリッドは親株であるρ0細胞と同じ核のバックグラウンドを持っていることから、ミトコンドリア内翻訳系全体の活性低下とその結果生じる呼吸(COX)活性の低下は、6つのtRNA遺伝子を欠失している△mtDNA46 96の蓄積が原因であると考えられる。
【００１９】■ Cy4696サイブリッドのマウス前核期胚への導入Cy4696サイブリッドからサイトカラシンB処理および高速遠心処理により核を除き、サイトプラスト数個を得た。8〜10週齢の雑種F1雌マウス（B6D2F1）300個体に、48時間の間隔をおいて妊馬血清性生殖腺刺激ホルモン(PMSG) 5IUとヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン(hCG)5IUとを続けて腹腔内注射することにより、過排卵を誘発した。
【００２０】それらの雌マウスを、生殖能力のあるB6D2F1雄マウスと一晩同居させた。hCGの注射15〜18時間後に、雌マウスの卵管を破って前核期の胚を採集した。採集した胚をCZB培地内に移し、ヒアルロニダーゼ（SIGMA）を含む該CZB培地中で静置することにより卵丘細胞を取り除いた。
【００２１】ピエゾ駆動のマイクロマニピュレーターを用い、上記で得た約10個のサイトプラストを、卵丘細胞を取り除いた胚の囲卵腔に注入した。次いで、交流電場（融合前・後ともに 100V/cm, 2MHz, 30sec）の存在下で、パルス刺激（3000 or 3500V/cm, 10μsec）を与え、サイトプラストと胚とを融合させた。（注：融合前後の交流電場は、細胞同士を接着させておくための誘電泳動用の電場である）
【００２２】（結果）ほとんどの（95％以上）胚が電気融合後も生存し、Cy4696由来のサイトプラストと融合した前核期の胚をシャーレで培養したところ、1142個の胚が24時間の培養で2細胞期胚、48時間の培養で4細胞期胚にまで発生した。
【００２３】〔実施例２〕 mtDNAノックアウトマウスの作製実施例１で調製した△mtDNA4696を有する胚を用いて、mtDNAノックアウトマウスを作製した。
■ F0世代マウスの作製まず、実施例１で得た1142個の４細胞期胚(△mtDNA4696を有する)を、偽妊娠処理後1日目のICR雌マウス(8〜12週齢)（仮親）の輸卵管に移植した（処理後１日目とは、精管結紮した雄マウスと交配(偽妊娠)させた次の日を指す）。偽妊娠処理後２０日目に、仮親雌マウスの子宮を帝王切開して検査し、生存している仔マウス(F0世代)は授乳能力のあるICR雌マウス(里親)に育てさせた。実施例１の操作■(Cy4696サイブリッドのマウス前核期胚への導入)からの一連の操作の概略を図 1fに示す。
【００２４】仮親マウスより取り出した111個体の新生マウスのうち、98個体が成体まで発育した。これらのマウスの尾から抽出したDNAを用いて、△mtDNA4696の有無をPCR法で調べたところ、98個体中31個体がその体細胞中に△mtDNA4696を有することがわかった。PCRで使用したプライマー対および条件は以下の通りである。
【００２５】（プライマー対）
順方向プライマー：5'−AACAGTAACATCAAACCGACCAGG−3' (配列番号３：正常型mtDNAの塩基配列7558−7581に相当)逆方向プライマー：5'−CTATTATCAGGCCTAGTTGGC−3' (配列番号４：正常型mtDNAの塩基配列12678−12658に相当)PCR条件：94℃で1分、45℃で1分、72℃で1分を30サイクル【００２６】そこで、△mtDNA4696を有する31個体のF0マウスの前脛骨筋(M.tibialis anterior)の筋生検を行い、サザンブロット法でΔmtDNA4696の割合を測定したところ、24個体が5.7〜41.8%の△mtDNA4696を有していることが示された(結果を図 2aに示す)。
【００２７】■ △mtDNA4696を有する子孫マウスの作出mtDNAは完全に母性遺伝することから、これらのF0世代の中から△mtDNA4696をそれぞれ5.7、6.1、10.8、11.2、13.0％有する雌マウス5個体を母親に選び、雄(BDF1)と交配してF1世代のマウスを産出させた。同様にして、F1世代の雌からF2世代を、さらにF2世代の雌からF3世代の個体を産出させた。
【００２８】■ △mtDNA4696の世代伝達割合およびその組織間分布■で得られたF0〜F3世代のマウス個体間(母親と仔マウス)において、伝達されたΔmtDNA4696の割合を比較した。tibialis anteriorの筋生検サンプルを用いて、F0とF1、F1とF2、F2とF3世代の個体間で△mtDNA4696の割合の比較を行った。F0の5個体、F1の4個体、F2の7個体の雌マウスを、次の世代を作出するための母親マウスとしてそれぞれ用いた。F0の5個体はそれぞれ、ΔmtDNA4696を5.7、6.1、10.8、11.2、13.0%有していた。結果を図 2bに示す。
【００２９】（結果）F1の4個体はΔmtDNA4696を27.4、38.0、47.0、48.7%有していた。F2の7個体はΔmtDNA4696を19.6、39.1、41.3、63.9、73.2、73.5、74.8%有していた。このことから、△mtDNA4696はF0の母親マウスから雌の生殖細胞系列を経て次の世代へと伝わることが示された。尚、筋肉中に△mtDNA4696を90%以上有するマウスが得られなかったのは、それらが致死であったためと思われる。また、継代を重ねることにより、△mtDNA4696を多く含有する個体を得ることができた。
【００３０】■ 同一個体の各組織間における△mtDNA4696量の比較次に、５個体の雄マウス(5週齡のF1が2個体、17週齡のF2が1個体、21週齡のF2が2個体）を用いて、同一個体の組織ごとのΔmtDNA4696の割合を比較した。比較に用いた組織は脳、肺、心臓、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、精巣、骨格筋および血液の10種類である。結果を図2cのヒストグラムで示す。
（結果）同一個体の組織間におけるΔmtDNA4696の分布に有意差は認められなかった。
【００３１】■ 単一筋繊維における△mtDNA4696の割合とCOX活性との関係F2世代の中から、筋生検により47.3、70.0、79.0、82.8、84.8％の△mtDNA4696を持つ21週齢の雄マウス5個体を選び、各マウスの骨格筋(ヒラメ筋(M.soleus))からの二枚の連続凍結切片(10μm、20μmの厚さ)を作製して、COX活性の低下と△mtDNA4696の割合との間に関連があるかどうかを調べた。
【００３２】まず、84.8％の△mtDNA4696を持つマウスのヒラメ筋から作製した10μmの切片を反応液(DAB 60mg、0.1M 酢酸緩衝液(pH5.6) 27ml、1％ MnCl2(pH5.5) 3ml、0.1％ H2O2 0.3ml)中37℃で30分間インキュベートすることによりCOX染色を行い、この染色結果を元に、20μmの切片からCOX非染性繊維とCOX染性繊維の細胞質を切り出し、それぞれの細胞質に含まれる△mtDNA4696の割合を以下の３個のプライマー：プライマー１：5'−ACCAGGGTTATTCTATGGCC−3'（配列番号５：マウス正常型mtDNAの7576〜7595に相当)、プライマー２：5'−CCGCATCGGAGACATCGGATT−3' (配列番号６：マウス正常型mtDNAの12260〜12280に相当)、プライマー３：5'−GTGTAGTAGTGCTGAAACTGG−3' (配列番号７：マウス正常型mtDNAの12479〜12459に相当。FAMで標識されている)、を用いて定量PCR分析した。
【００３３】PCR条件は、1st PCR：94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分を30サイクル、2nd PCR：94℃で1分、48℃で1分、72℃で3分を10サイクル、であった。
【００３４】変異型mtDNA(△mtDNA4696)は210bp、正常型mtDNAは220bpの断片としてそれぞれ検出された。次に、それぞれの繊維に含まれる変異型・正常型mtDNA断片の割合を、FM-BIOイメージ アナライザー(HITACHI) を用いて定量した。観察された組織学的、形態学的な異常を図3に示す。尚、図 3aおよびcは正常な21週齢の雄マウス(ICR)について得られた所見である(比較対照)。
【００３５】（結果）△mtDNA4696を47.3％および70.0％有するマウスの骨格筋ではCOX活性のない筋線維を認めなかったが、△mtDNA4696を79.0％、82.8％および84.8％有するマウスの骨格筋ではCOX活性の有る(すなわちCOX染性)と無い線維(COX非染性)がモザイク状に分布していた。図 3bに△mtDNA4696を84.8％有するマウスの骨格筋について得られた所見を示す。図 3b中の番号を付した繊維1〜7はそれぞれ95.6、90.0、86.5、81.9、82.2、83.2、77.3％のΔmtDNA4696を有しており、COX非染性の繊維(1,2,3)のΔmtDNA4696の含有平均値は90.7±3.8％、一方COX染性の繊維(4,5,6,7)の平均値は81.2±2.3％であった。さらに、骨格筋においてCOX非染性の繊維が認められたマウスでは、その心筋組織においてもCOX活性の有る細胞と無い細胞がモザイク状に分布していた。図3dに△mtDNA4696を84.8％有するマウスの心筋について得られた所見を示す。
【００３６】これらの結果より、COX活性の低下と△mtDNA4696の割合の間には良い相関関係が見られることがわかる：すなわち、85%以上の割合で△mtDNA4696を含む筋線維のすべてはCOX活性が無く、それ以下の筋線維ではCOX活性が認められる。また、△mtDNA4696を多く有するF1〜F2世代のマウスの多くは衰弱の結果死亡した。このようなマウスの肉眼的主要所見は、貧血と腎の粒状肥大である。図3eに示す38週齡のF1の雄マウスは、耳と尾部の蒼白色の色調から深刻な貧血症であることがわかる。このマウスは7週齡時の筋生検サンプルにおいて58.7%のΔmtDNA4696を有していたが、撮影の次の日に腎不全により死亡した。
【００３７】図3fにはこのマウス(右)と同じ週齢の正常雄マウス(左)由来の腎臓を示す。△mtDNAを有するマウスの腎臓の表面(写真右)は顆粒状を呈し、88.2%のΔmtDNA4696を有していた。他のF1〜F3マウスは筋生検サンプルにおいて大量にΔmtDNA4696を有し(64.0±10.4%、n=5)、21週齡から38週齡間に腎不全で死亡した。死亡時におけるこれらのマウスの腎組織は、80％以上(85.4±5.4％、ｎ=5)の△mtDNA4696を有していた。
【００３８】さらに、94.0％の△mtDNA4696を有する24週齢の雄マウスの腎組織の所見を図3hに、同じ週齡の正常雄マウスの腎臓を図 3gに示す。△mtDNAを有するマウスの腎組織においては、皮質の近位および遠位尿細管の顕著な拡張が観察され、部分的にエオシン染性の物質を含んでいた。
【００３９】■ △mtDNA4696がマウス血中成分に及ぼす影響△mtDNA4696を有する12週齢の雄マウス12個体の尾部より末梢血を採取し、1.5g／kg体重のグルコースを経口で投与した前後の血中ピルビン酸レベル(mg／dL)および乳酸レベル(mg／dL)を測定し、そのレベルの変動と△mtDNA4696の割合との関係を調べた。血中ピルビン酸レベルおよび乳酸レベルはNAD−NADH間の濃度変化により測定した。結果を図 4aおよびbに示す。
【００４０】さらに、■と同じ47.3、70.0、79.0、82.8、84.8％の△mtDNA4696を持つ21週齢のF2雄マウス5個体から上記同様に末梢血を採取し、ドライケム(Fuji Film)により測定した血中尿素窒素レベルおよびクレアチンレベルを、正常型のmtDNAを有するマウスの末梢血について得られた数値と比較した。結果を図 4cに示す。
【００４１】（結果）図 4bからわかるように、筋組織中の△mtDNA4696の割合が多いマウスほど末梢血中の乳酸値が増加していた(図中、菱形(白)はグルコース投与の前、菱形(黒)は投与後の値を示す)。この結果と■で得られた△mtDNA4696を有する心筋における所見(図3d)から、△mtDNA4696を有するマウスはミトコンドリア病の疾患モデルとして利用できることが明らかとなった。
【００４２】さらに、図4cからわかるように、△mtDNA4696を多く有するマウスは、正常型mtDNAを有するマウスと比較して非常に高いレベルの血中尿素窒素とクレアチニンを有していた。この結果と■で得られた△mtDNA4696を有する腎組織における所見(図3fおよびh)から、△mtDNA4696を多く有するマウスの死亡の原因は尿細管原性の腎機能障害であると推察された。腎機能障害はミトコンドリア病で共通に認められる症状ではないが、腎臓のミトコンドリア機能異常の報告例もあることから、本発明者らはこれまで原因不明であった腎臓病のいくつかは突然変異mtDNAの蓄積にその原因があることをここで提案したい。
【００４３】筋線維の中で85%以下の△mtDNA4696を含むものが正常なミトコンドリアの呼吸機能を示す理由としては、△mtDNA4696の受容体となった受精卵中の正常型mtDNAを有するミトコンドリアと、導入された△mtDNA4696を有するミトコンドリアとの間に相互作用があることを考慮すると良く説明することができる。すなわち、哺乳類のミトコンドリアが機能的に単一であり、互いの相互作用の結果中身を交換することができる、という本発明者らが以前提唱した考え方を支持するものである。
【００４４】さらに、本発明者らは、受精の際に卵に導入された精子のmtDNAが2細胞期になる前に完全に排除されることを以前報告している。しかし今回の研究では、△mtDNA4696を持つ体細胞のミトコンドリアは、受精卵に導入してもそこからの排除をまぬがれる事を見いだした。したがって、わずか２世代を経ることで外から導入した△mtDNA4696を大量に含むマウスを樹立できたのは以下の二つの理由：一つは導入された△mtDNA4696を有する体細胞由来ミトコンドリアは胚からの除外を免れることができたこと、もう一つは該△mtDNA4696が正常型mtDNAより複製に有利であって、その結果△mtDNA4696は次の世代に伝わり正常型mtDNAを席巻できたことによると思われる。
【００４５】これまで、△mtDNAが雌の生殖細胞系列を通して次の世代に伝わることはショウジョウバエで報告されているが、欠失突然変異が原因であるヒトのKearns-Sayre症候群では報告がない。しかし、点突然変異mtDNAが母性遺伝することについては他のミトコンドリア病の患者で認められている。この病原性を持つ点突然変異mtDNAが呼吸活性低下を引き起こすためには90%以上の蓄積が必要であるのに対し、欠失突然変異mtDNAの場合は70%であった。
【００４６】したがって、本発明により提供されるマウスの△mtDNA4696の毒性はヒトの欠失突然変異mtDNAによるそれよりは少なく、ヒトの点突然変異mtDNAの毒性と同程度のものであると思われる。またヒトの分裂組織では△mtDNAが蓄積されないのに対し、本発明のマウスの△mtDNA4696が分裂組織にも大量に蓄積していた(図2c)。これは、マウスの分裂細胞は△mtDNA4696を蓄積しても生存できる事を示している。
【００４７】これらのことから、本発明のマウスとヒトの△mtDNAの間に認められた子孫への伝達と組織への分布状況の違いは、本発明のマウスの△mtDNA4696がヒトのそれよりも毒性が弱いこと、またはマウスの細胞がエネルギー欠損に耐性であるために、マウスの卵細胞、胚、そして分裂組織に△mtDNA4696が大量に含まれても生存することができ、最終的にはマウスの△mtDNA4696の母性遺伝と分裂組織における大量の分布が可能になったと考えられる。
【００４８】これまでに、核DNAにコードされている因子で、ミトコンドリアの機能に関わる遺伝子のノックアウトによってミトコンドリア機能に異常を持つマウスの報告例は多いが、これらはmtDNA突然変異によって引き起こされる疾患のモデルにはなり得ない。
【００４９】また、最近、非常に少量のクロラムフェニコール耐性mtDNAを持つキメラマウスが報告されている。しかしながら、このようなキメラマウスは、大量にクロラムフェニコール耐性mtDNAを持つ雌のタイプのES細胞を正常な胚盤胞期の胚に移植することによって得られるもので、このようなキメラマウスをクロラムフェニコールを用いて選択することが不可能なので、クロラムフェニコール耐性mtDNAの割合が急激に減少し、最終的には生殖細胞を通して次の世代に伝達されることはなかった。
【００５０】
【発明の効果】本発明により、変異型mtDNAを細胞へ導入するための有効な方法の提供が可能となった。また、△mtDNA4696を変異型mtDNAとして使用することにより、△mtDNA4696を有するmtDNAノックアウトマウスの作出が可能となった。このマウスは△mtDNAの伝達と様々な組織での発現の機構を詳細に研究する上で有効なことから、ミトコンドリア病の病態モデルとして活用できる。このマウスはさらに、突然変異mtDNAの蓄積が老化や老化関連疾患の原因になっているという仮説を検証するのにも利用できる。多くのミトコンドリア病は老化に伴って発症することから、われわれはこのマウスが老化するのを待ってさらに研究をすすめる予定である。さらに、すべての年齢のすべての病状の進行段階の検体が様々な割合の△mtDNAを持ったすべての組織から提供できることから、これまでに予想し得なかった原因不明の病気がmtDNAの突然変異によるものであることを証明できる可能性もある。そして、モデル動物でのみ可能な治療薬のスクリーニングや遺伝子治療法の確立にも活用できる。
【００５１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING<110> Institute of Tsukuba Liaison Co.,Ltd<120> Method for introducing mutant mitochondrial DNA into germ cell. <130> P99-0588<160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.0<210> 1<211> 25<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:a forward primer:this sequence corresponds to nucleotides 6871-6895 of normal mitochondrial DNA.<400> 1aagaaaggaa ggaatcgaac cccct 25<210> 2<211> 25<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence: a reverse primer:this sequence corresponds to nucleotides 13666-13642 of normal mitochondrial DNA.<400> 2tatgttggaa ggagggattg gggta 25<210> 3<211> 24<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence: a forward primer:this sequence corresponds to nucleotides 7558-7581 of normal mitochondrial DNA.<400> 3aacagtaaca tcaaaccgac cagg 24<210> 4<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence: a reverse primer:this sequence corresponds to nucleotides 12678-12658 of normal mitochondrial DNA.<400> 4ctattatcag gcctagttgg c 21<210> 5<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 1 :this sequence corresponds to nucleotides 7576-7595 of normal mitochondrial DNA.<400> 5accagggtta ttctatggcc 20<210> 6<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 2 :this sequence corresponds to nucleotides 12260-12280 of normal mitochondrial DNA.<400> 6ccgcatcgga gacatcggat t 21<210> 7<211> 21<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence: primer 3 :this sequence corresponds to nucleotides 12479-12459 of normal mitochondrial DNA.<400> 7gtgtagtagt gctgaaactg g 21
【出願人】 【識別番号】８９９００００８０
【氏名又は名称】株式会社筑波リエゾン研究所
【出願日】 平成１２年１月１８日（２０００．１．１８）
【代理人】 【識別番号】１０００９１０９６
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔 （外１名）
【公開番号】 特開２００１−１９７８４５（Ｐ２００１−１９７８４５Ａ）
【公開日】 平成１３年７月２４日（２００１．７．２４）
【出願番号】 特願２０００−９１９４（Ｐ２０００−９１９４）