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【発明の名称】 グリホセート耐性植物
【発明者】 【氏名】ガネシュ，マーシィ，キショア

【氏名】ジェラード，フランシス，バリー
【要約】 【課題】グリホセート酸化還元酵素をコードする遺伝子を開示する。

【解決手段】該遺伝子は、除草剤グリホセートを分解する形質転換微生物及び植物の他、除草剤グリホセートに対して耐性の栽培植物を創出するのにも有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 下記工程：ａ）
ｉ）ＲＮＡ配列を生成させるように植物細胞中で機能するプロモーター；
ｉｉ）配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列を有するグリホセート酸化還元酵素か、或いは配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が除去されているか、又は１以上の他のアミノ酸により置換されているか、又は配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列を有し且つ配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列を有するグリホセート酸化還元酵素の活性を有する上記酵素のアレル又は他の変異体をコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列；及びｉｉｉ）ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加させるように植物細胞中で機能する３′非翻訳領域を含み、ただし、前記プロモーターは構造ＤＮＡ配列に関して異種であり、分裂組織を包含する植物組織中において酵素を十分に発現させてその遺伝子により形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を高めるように適合されているものである、組換え二本鎖ＤＮＡ分子を植物細胞中のゲノム中に挿入し；
ｂ）形質転換された植物細胞を得て、；次いでｃ）前記形質転換された植物細胞から、グリホセート殺草剤に対する高められた耐性を有する遺伝学的に形質転換された植物を再生するを含む、グリホセート殺草剤に対して耐性の遺伝学的に形質転換された単子葉植物の生産方法。
【請求項２】 アミノ酸配列が配列番号：５又は配列番号：１８であってその３３４位のアミノ酸残基がアルギニン、リジン、グルタミン、アラニン及びグルタミン酸からなる群から選択されるものである請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】 構造ＤＮＡ配列が配列番号：１７である請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項４】 構造ＤＮＡ配列が、アミノ末端葉緑体トランジットペプチド及びグリホセート酸化還元酵素を含む融合ポリペプチドをコードする請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項５】 構造ＤＮＡ配列が、配列番号：９に示されている葉緑体トランジットペプチドと配列番号：８又は配列番号：１７に示されているグリホセート酸化還元酵素をコードするＤＮＡからなる請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】 プロモーターが、植物ＤＮＡウィルスプロモーターである請求の範囲第１ないし５項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】 プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターからなる群から選択される請求の範囲第６項に記載の方法。
【請求項８】 ３’非翻訳領域がノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子由来である請求の範囲第１ないし７項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】 配列中に：ａ）ＲＮＡ配列を生成させるように植物中で機能するプロモーター；
ｂ）配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列を有するグリホセート酸化還元酵素か、或いは配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が除去されているか、又は１以上の他のアミノ酸により置換されているか、又は配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列を有し且つ配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列を有するグリホセート酸化還元酵素の活性を有する上記酵素のアレル又は他の変異体をコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列；及びｃ）ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加させるように植物中で機能する３′非翻訳領域を含み、ただし、前記プロモーターは構造ＤＮＡ配列に関して異種であり、かつ前記構造ＤＮＡ配列が、アミノ末端葉緑体トランジットペプチド及びグリホセート還元酵素を含む融合ポリペプチドをコードするものである二本鎖ＤＮＡ分子を含むグリホセート耐性単子葉植物細胞。
【請求項１０】 アミノ酸配列が配列番号：５又は配列番号：１８であってその３３４位のアミノ酸残基がアルギニン、リジン、グルタミン、アラニン及びグルタミン酸からなる群から選択されるものである請求の範囲第９項に記載のグリホセート耐性単子葉植物細胞。
【請求項１１】 構造ＤＮＡ配列が配列番号：１７である請求の範囲第９項に記載のグリホセート耐性単子葉植物細胞。
【請求項１２】 構造ＤＮＡ配列が、配列番号：９に示されている葉緑体トランジットペプチドと配列番号：８又は配列番号：１７に示されているグリホセート酸化還元酵素をコードするＤＮＡからなる請求の範囲第９項に記載のグリホセート耐性単子葉植物細胞。
【請求項１３】 プロモーターが植物ＤＮＡウィルスプロモーターである請求の範囲第９ないし１２項のいずれかに記載のグリホセート耐性単子葉植物細胞。
【請求項１４】 プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターからなる群から選択される請求の範囲第１３項に記載のグリホセート耐性単子葉植物細胞。
【請求項１５】 ３’非翻訳領域がノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子由来である請求の範囲第９ないし１４項のいずれかに記載のグリホセート耐性単子葉植物細胞。
【請求項１６】 コ−ン、小麦及び米からなる群から選択される請求の範囲第９ないし１５項のいずれかに記載のグリホセート耐性単子葉植物細胞。
【請求項１７】 請求の範囲第９項に記載の植物細胞を含むグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項１８】 アミノ酸配列が配列番号：５又は配列番号：１８であってその３３４位のアミノ酸残基がアルギニン、リジン、グルタミン、アラニン及びグルタミン酸からなる群から選択されるものである請求の範囲第１７項に記載のグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項１９】 構造ＤＮＡ配列が配列番号：１７である請求の範囲第１７項に記載のグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項２０】 構造ＤＮＡ配列が、配列番号：９に示されている葉緑体トランジットペプチドと配列番号：８又は配列番号：１７に示されているグリホセート酸化還元酵素をコードするＤＮＡからなる請求の範囲第１７項に記載のグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項２１】 プロモーターが植物ＤＮＡウィルスプロモーターである請求の範囲第１７ないし２０項のいずれかに記載のグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項２２】 プロモーターがＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターからなる群から選択される請求の範囲第２１項に記載のグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項２３】 ３’非翻訳領域がノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子由来である請求の範囲第１７ないし２２項のいずれかに記載のグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項２４】 コーン、小麦及び米からなる群から選択される請求の範囲第１７ないし２３項のいずれかに記載のグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項２５】 下記工程：ａ）組換え二本鎖ＤＮＡ分子を作物種子または植物中に挿入した結果グリホセート耐性を有するようになった単子葉類の作物または植物を植え、前記ＤＮＡ分子は：ｉ）ＲＮＡ配列を生成させるように植物細胞中で機能するプロモーター；
ｉｉ）配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列を有するグリホセート酸化還元酵素、或いは配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が除去されているか、又は１以上の他のアミノ酸により置換されているか、又は配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列を有し且つ配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列を有するグリホセート酸化還元酵素の活性を有する上記酵素のアレル又は他の変異体をコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列；及びｉｉｉ）ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加させるように植物細胞中で機能する３′非翻訳領域を含み、ただし、前記プロモーターは構造ＤＮＡ配列に関して異種であり、分裂組織を包含する植物組織中において酵素を十分に発現させてその遺伝子により形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を高めるように適合されているものであるＤＮＡ分子であり；
ｂ）圃場中の前記作物及び雑草に、前記作物には著しい影響を与えずに前記雑草をコントロールするために十分な量のグリホセート殺草剤を与える、を含む植えられた作物種子を有する作物または植物を含む、圃場の雑草を選択的にコントロールする方法。
【請求項２６】 アミノ酸配列が配列番号：５又は配列番号：１８であってその３３４位のアミノ酸残基がアルギニン、リジン、グルタミン、アラニン及びグルタミン酸からなる群から選択されるものである請求の範囲第２５項に記載の方法。
【請求項２７】 構造ＤＮＡ配列が配列番号：１７である請求の範囲第２５項に記載の方法。
【請求項２８】 構造ＤＮＡ配列が、アミノ末端葉緑体トランジットペプチド及びグリホセート酸化還元酵素からなる融合ポリペプチドをコードする請求の範囲第２５項に記載の方法。
【請求項２９】 構造ＤＮＡ配列が、配列番号：９に示されている葉緑体トランジットペプチドと配列番号：８又は配列番号：１７に示されているグリホセート酸化還元酵素をコードするＤＮＡからなる請求の範囲第２８項に記載の方法。
【請求項３０】 プロモーターが、植物ＤＮＡウィルスプロモーターである請求の範囲第２５ないし２９項のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】 プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓからなる群から選択される請求の範囲第３０項に記載の方法。
【請求項３２】 ３’非翻訳領域がノーパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子由来である請求の範囲第２５ないし３１項のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】 作物植物が、コーン、小麦及び米からなる群から選択される請求の範囲第２５ないし３２項のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】 配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列を有するグリホセート酸化還元酵素か、或いは配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が除去されているか、又は１以上の他のアミノ酸により置換されているか、又は配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列を有し且つ配列番号：５又は配列番号：１８のアミノ酸配列を有するグリホセート酸化還元酵素の活性を有する上記酵素のアレル又は他の変異体をコードする構造ＤＮＡ配列を植物組織中に導入し；グリホセートを含む植物生育培地上に植物組織を置き；グリホセートを含む培地上での発育を示す植物組織を選択することを含む形質転換された単子葉植物組織の選択方法。
【請求項３５】 さらに、グリホセートを含む培地上での発育を示す植物組織の断片をグリホセート上で再カルス生成することによって、植物組織中のグリホセート酸化還元酵素遺伝子の存在を確認する工程を含む請求の範囲第３４項に記載の方法。
【請求項３６】 配列番号：５又は配列番号：１８の３３４位のアミノ酸残基がアルギニン、リジン、グルタミン、アラニン及びグルタミン酸からなる群から選択されるものである請求の範囲第３４項に記載の方法。
【請求項３７】 構造ＤＮＡ配列が配列番号：１７である請求の範囲第３４項に記載の方法。
【請求項３８】 構造ＤＮＡ配列が、配列番号：９に示されている葉緑体トランジットペプチドと配列番号：８又は配列番号：１７に示されているグリホセート酸化還元酵素をコードするＤＮＡからなる請求の範囲第３４項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】【０００１】この出願は、１９９０年６月２５日に出願された出願番号０７／５４３，２３６号の本出願人らによる同時継続中の出願の一部継続出願である。
【０００２】本発明の背景遺伝子工学の近年の進歩は、外来遺伝子を含むように植物を形質転換するための必須の手段を提供することとなった。今や、農業経済上重要である特異の特徴を有する植物を生産することが可能である。１つのこのような有利な特徴は、コスト的に効果的で環境を汚染することもない、殺草剤耐性による雑草制御である。殺草剤耐性の植物は、耕作のために雑草を制御する必要性を軽減し、それにより、土壌浸食を有効に軽減することができる。
【０００３】この点に関して多くの研究の対象とされている一つの殺草剤は、通常グリホセートと称されるＮ−ホスホノメチル−グリシンである。グリホセートは、アミノ酸及びビタミンを含む芳香族化合物の生合成をもたらすシキミ酸経路を阻害する。
【０００４】特に、グリホセートは、酵素５−エノピルビル−３−ホスホシキミ酸シンターゼ（ＥＰＳＰシンターゼまたはＥＰＳＰＳ）を阻害することにより、ホスホエノールピルビン酸及び３−ホスホシキミ酸の、５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸への転化を阻害する。
【０００５】グリホセート耐性植物は、好ましくはグリホセート耐性である高レベルのＥＰＳＰシンターゼを生成する能力を、植物のゲノム中に挿入することにより、生産することができることが示されている（シャーら、１９８６）。植物中へのグリホセート分解遺伝子の導入は、植物にグリホセート耐性を与え、及び／または分解生成物の生理学的効果に応じてグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼを既に発現しうるトランスジェニック植物の耐性を増加させる手段を提供することができる。
【０００６】グリホセート代謝（分解）は、広範囲の植物について調査されており、それらの多くの研究において、ほとんど分解が報告されていない。分解が報告された場合において、初期の分解生成物は通常アミノメチルホスホネート（ＡＭＰＡ）である（クープランド、１９８５；マーシャルら、１９８７）。これらの例では、グリホセートが施された植物によってかまたはその植物の葉の表面の汚染微生物によってグリホセートが代謝されたのか明らかでない。ＡＭＰＡは、ほとんどの植物種に対してグリホセートよりも植物に対する薬毒が非常に低いが（フランツ、１９８５）、全ての植物種に対してそうという訳ではない（マイアー、１９８３；タナカら、１９８８）。土中のグリホセート分解は、非常に大規模で迅速である（トーステンソン、１９８５）。同定された主要な分解生成物は、ＡＭＰＡ（レッペルら、１９７７；ノムラ及びヒルトン、１９７７）；広範囲の微生物により代謝されることができるリン酸塩（ゼレツニックら、１９６３；マスタレーツら、１９６５；クックら、１９７８；ドートンら、１９７９ａ；１９７９ｂ；１９７９ｃ；ワケットら、１９８７ａ）である。２つの知られた経路の一つによりグリホセートを分解する多くの細菌純粋培養物が同定されている（ムーアら、１９８３；タルボットら、１９８４；シナバーガー及びブレイマー、１９８６；バルタゾール及びハラス、１９８６；キショア及びジェイコブ、１９８７；ワケットら、１９８７ａ；ピプケら、１９８７ａ；ピプケら、１９８７ｂ；ハラスら、１９８８；ジェイコブら、１９８５及び１９８８；ピプケ及びアムハイン、１９８８；クインら、１９８８及び１９８９；ラーブスら、１９９０；ショワネック及びバーストレート、１９９０；ワイドヘーズら、１９９０；リウら、１９９１）。グリホセートをサルコシン及び無機オルトリン酸塩（Ｐｉ）に分解する「Ｃ−Ｐリアーゼ」を含む経路は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． について（シナバーガー及びブレイマー、１９８６；キショア及びジェイコブ、１９８７）、及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．について（ピプケら、１９８７ｂ）報告されている。グリホセートをＡＭＰＡに分解することができる純粋な培養物が、Ｆｒａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．について（バルタゾール及びハラス、１９８６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． について（ジェイコブら、１９８８）及びＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｔｒｏｃｙａｎｅｕｓについて（ピプケ及びアムハイン、１９８８）報告されている。さらに、グリホセートをＡＭＰＡに変換する多数の単離物が、グリホセート廃棄物を処理する工業的に活性化されたスラッジから同定されている（ハラスら、１９８８）。しかしながら、これらの分解の原因である細菌遺伝子の数及び性質は、現在まで測定されておらず、その遺伝子は単離されていない。
【０００７】従って、１つの観点において、本発明の目的は、グリホセートをアミノメチルホスホネート及びグリオキシレートに変換するグリホセート代謝酵素をコードする新規な遺伝子を提供することにある。
【０００８】その他の目的は、特定のアミノ酸残基を置換することによって、グリホセートに対するグリホセート代謝酵素の活性を高めることにある。
【０００９】その他の目的は、グリホセート代謝酵素をコードする遺伝子を表現し、グリホセート殺草剤に対する高められた耐性を示す遺伝的に変えられた植物を提供することにある。
【００１０】その他の目的は、グリホセート代謝酵素を葉緑体トランジットペプチドを使用してプラスチドを標的とすることができ、プラスチド標的酵素が、高レベルのグリホセート耐性を与えることを示すことにある。
【００１１】その他の目的は、阻害濃度のグリホセートの存在下において、選択可能な標識としてグリホセート代謝酵素を使用して形質転換された植物組織を選択する方法を提供することにある。
【００１２】本発明のこれらの及びその他の目的、観点及び特徴は、下記の記述及び実施例により当業者に明らかとなるであろう。
【００１３】本発明の要約本発明は、グリホセート酸化還元酵素をコードし、異種微生物（例えば、細菌及び植物）におけるグリホセート分解能力を生成しグリホセート耐性植物を生産するために有効な、構造ＤＮＡ構造物を提供する。
【００１４】上記を達成するために、本発明の１つの側面によれば、下記工程：ａ）
ｉ）ＲＮＡ配列を生じさせるように植物細胞中で機能するプロモーター；
ｉｉ）グリホセート酸化還元酵素をコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列；及びｉｉｉ）ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加させるように植物細胞中で機能する３′非翻訳化ＤＮＡ配列を含み、前記プロモーターがコード配列に対して異種であり、分裂組織を包含する植物組織中において酵素を十分に表現するように適合されて、その遺伝子により形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を高める組換え二本鎖ＤＮＡ分子を植物細胞のゲノム中に挿入し；
ｂ）形質転換された植物細胞を得て、；次いでｃ）前記形質転換された植物細胞から、グリホセート殺草剤に対する高められた耐性を有する遺伝学的に形質転換された植物を再生するを含む、グリホセート殺草剤に対して耐性を有する遺伝学的に形質転換された植物の生産方法が提供される。
【００１５】本発明のその他の側面によれば、配列中に：ａ）ＲＮＡ配列を生じさせるように植物中で機能するプロモーター；
ｂ）グリホセート酸化還元酵素をコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列；及びｃ）ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加させるように植物中で機能する３′非翻訳化領域を含む、組換え二本鎖ＤＮＡ分子が提供される。
【００１６】本発明のその他の側面によれば、上記要素（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなるＤＮＡをそれぞれ含む細菌、及び形質転換された植物の細胞が提供される。
【００１７】本発明のその他の側面によれば、グリホセート殺草剤に対して耐性を示す、上記の形質転換された植物細胞を含む分化された植物が提供される。
【００１８】本発明のその他の側面によれば、下記工程：ａ）組換え二本鎖ＤＮＡ分子を作物種子または植物中に挿入した結果グリホセート耐性を有するようになった作物種子を播種または植物を植付け、前記ＤＮＡ分子が：ｉ）ＲＮＡ配列を生じさせるように植物中で機能するプロモーター配列；
ｉｉ）グリホセート酸化還元酵素をコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列；及びｉｉｉ）ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加させるように植物中で機能するポリアデニル化シグナルをコードする３′非翻訳化配列を含み、前記プロモーターが構造ＤＮＡ配列に対して異種であり、分裂組織を包含する植物組織中において酵素を十分に発現するように適合されていて、その遺伝子により形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を高め；次いで、ｂ）前記作物及びその畑中の雑草に、前記作物には著しい影響を与えず前記雑草を制御するために十分な量のグリホセート殺草剤を与える、を含む、作物種子または植物が作付けされている作物畑中で雑草を選択的にコントロールする方法が提供される。
【００１９】特に好ましい具体例において、植物発現のための遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡ分子は、カルボキシ末端グリホセート酸化還元酵素を、遺伝子を発現する植物細胞の葉緑体中に導入する能力を有するアミノ末端葉緑体トランジットペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする構造ＤＮＡ配列を含む。
【００２０】本発明のその他の具体例は、形質転換された植物細胞を選択し、同定するための選択可能な標識としてのグリホセート酸化還元酵素の使用である。
【００２１】図面の簡単な説明図１は、ゴマノハグサモザイクウィルス（ＦＭＶ）の全長プロモーターのＤＮＡ配列を示す。
【００２２】図２は、細菌単離物ＬＢＡＡに由来するグリホセート酸化還元酵素遺伝子の構造ＤＮＡ配列を示す。
【００２３】図３は、植物中での発現を高めるために適合された修飾グリホセート酸化還元酵素遺伝子と操作された構造グリホセート酸化還元酵素遺伝子の比較を示す。操作されたグリホセート酸化還元酵素遺伝子は、上方のＤＮＡ配列として図示されている。修飾遺伝子中に生じた変化のみを、配列の下方の鎖中に示す。
【００２４】図４は、植物中での発現を高めるために適合された合成グリホセート酸化還元酵素遺伝子と操作された構造グリホセート酸化還元酵素遺伝子との比較を示す。操作されたグリホセート酸化還元酵素遺伝子を上方のＤＮＡ配列として示す。
【００２５】図５は、ｐＭＯＮ１７０３２、Ｅｎ−ＣａＭＶ３５Ｓ−修飾されたグリホセート酸化還元酵素−ＮＯＳ３′カセットとしてベクターのＮｏｔＩ部位中に挿入された修飾グリホセート酸化還元酵素遺伝子を含むｐＭＯＮ８８６ベクターを示す。ｐＭＯＮ８６６ベクターは、本明細書中に開示されている。
【００２６】図６は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＳＳＵ１Ａ遺伝子に由来するＣＴＰ１葉緑体トランジットペプチドのヌクレオチド配列を示す。
【００２７】図７は、プラスミドｐＭＯＮ１７０６６、ＣＴＰ／合成グリホセート酸化還元酵素融合ポリペプチドをコードする遺伝子を含むｐＭＯＮ９７９型ベクターの遺伝学的／構造的地図を示す。
【００２８】図８は、プラスミドｐＭＯＮ１７１３８、ＣＴＰ／合成グリホセート酸化還元酵素融合ポリペプチドをコードする遺伝子を含むｐＭＯＮ９８１型ベクターの１例を示す。
【００２９】図９は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＥＰＳＰＳ遺伝子に由来のＣＴＰ２葉緑体トランジットペプチドのヌクレオチド配列を示す。
【００３０】図１０は、プラスミドｐＭＯＮ１７１５９の構造地図を示す。
【００３１】図１１は、プラスミドｐＭＯＮ１７２２６の構造地図を示す。
【００３２】図１２は、プラスミドｐＭＯＮ１７１６４の構造地図を示す。
【００３３】本発明の説明二本鎖ＤＮＡ形態中に存在する植物遺伝子の発現は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によるＤＮＡの１本鎖からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を合成すること、次いで、核の内部でｍＲＮＡ転写一次産物を処理することを伴う。この処理は、ポリアデニレートヌクレオチドをＲＮＡの３′末端に付加することを促進する３′シグナル領域を不可欠とする。
【００３４】ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写は、通常「プロモーター」と呼ばれるＤＮＡの１領域により調節される。このプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼに信号を送ってＤＮＡと会合させ、ＲＮＡの相当する相補的鎖を生成する鋳型としてＤＮＡ鎖の一方を使用してｍＲＮＡへの転写を開始させる塩基配列を含む植物細胞中で活性である多数のプロモーターが、従来より文献に記載されている。これらは、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）及びオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の腫瘍誘導プラスミド上に担持される）、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）１９Ｓ及び３５Ｓプロモーター並びにゴマノハグサモザイクウィルス（ＦＭＶ）３５Ｓプロモーターのようなカウリモウィルスプロモーター、リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ、非常に豊富な植物ポリペプチド）に由来する光誘導可能なプロモーターを含む。これらの全てのプロモーターは、植物中で発現される種々の型の構造ＤＮＡを生成するために使用されてきている；例えばＰＣＴ公開ＷＯ８４／０２９１３（ロジャーズら、モンサント社）参照。
【００３５】植物細胞中でＤＮＡの転写を起こさせることが知られまたは発見されたプロモーターは、本発明において使用することができる。このようなプロモーターは、植物及び植物ＤＮＡウィルスのような種々の起源から得ることができ、これらに限定されないが、ＣａＭＶ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーター、ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子のような植物遺伝子またはクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質から単離されるプロモーターを包含する。以下説明するように、選択される特定のプロモーターは、十分発現する能力を有し、その結果、有効量のグリホセート酸化還元酵素を生成し、グリホセート殺草剤に対する実質的な耐性を与えることができるものでなけらばならない。所望の耐性を導入するために必要なグリホセート酸化還元酵素の量は、植物種に応じて変化する。
【００３６】グリホセートは今や下記の型の植物組織中で転移し蓄積されることが知られているので、利用されるプロモーターは、その他の組織に加えて全ての分裂組織において比較的高い発現をすることが望ましい。代替的に、キメラ遺伝子の組み合わせを使用して、累積的にグリホセート酸化還元酵素の必要な全体の発現をもたらし、その結果グリホセート耐性表現型を生じるようにすることができる。
【００３７】本発明の構造ＤＮＡによって生成されたｍＲＮＡは５′非翻訳化リーダー配列も含む。この配列は、遺伝子を発現するために選択されるプロモーターから得ることができ、ｍＲＮＡの翻訳を増加させるために特別に修飾されることがある。５′非翻訳化領域は、ウィルスＲＮＡ、適当な真核遺伝子、または合成遺伝子配列から得ることができる。本発明は、下記の実施例に示されるような、非翻訳化領域が、プロモーター配列を伴う５′非翻訳化配列及びウィルスコートタンパク質遺伝子の５′非翻訳化領域の両方から得られる構造物に限定されるものではない。むしろ、非翻訳化リーダー配列は、無関係のプロモーターまたは上記のコード配列から得ることができる。
【００３８】本発明において使用される好適なプロモーターは、植物特に双子葉植物中に挿入されるキメラ遺伝子の強力で均質なプロモーターとして機能するゴマノハグサモザイクウィルス（ＦＭＶ）に由来の全長転写（３５Ｓ）プロモーターである。一般的に、得られるトランスジェニック植物は、高められたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより作動される同一の遺伝子よりも、組織及び細胞の全体を通して高く均質なレベルで挿入された遺伝子の方がコードされるタンパク質を発現する。図１を参照すると、そのプロモーターのＤＮＡ配列は、ＦＭＶゲノムのヌクレオチド６３６８及び６９３０（配列番号：１）の間に位置する。５′非翻訳化リーダー配列は、プロモーターにより連結されていることが好ましく、リーダー配列（配列番号：２）の例を図１に示す。リーダー配列はＦＭＶゲノムそれ自体から得ることができ、または、ＦＭＶ以外の起源から得ることができる。
【００３９】キメラ植物遺伝子の３′非翻訳化領域は、植物中でポリアデニレートヌクレオチドをＲＮＡの３′末端に付加させるように機能するポリアデニル化シグナルを含む。適当な３′領域の例としては、（１）ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子のようなＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む３′転写された非翻訳化領域、及び（２）ダイズ貯蔵タンパク遺伝子のような植物遺伝子及びリブロース−１，５−ビスホスフェートカルオキシラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝子の小サブユニット。好適な３′領域の例は、下記実施例において詳しく説明するマメに由来のｓｓＢＵＢＩＳＣＯ遺伝子（Ｅ９）に由来のものである。
【００４０】本発明のＤＮＡ構造物は、グリホセートをアミノメチルホスホネート及びグリオキシレートに転化するグリホセート酸化還元酵素をコードする二本鎖ＤＮＡ形態中の構造コード配列を含む。
【００４１】グリホセート酸化還元酵素反応の要約酵素グリホセート酸化還元酵素は、グリホセートのＣ−Ｎ結合の分裂を触媒し、反応生成物としてアミノメチルホスホネート（ＡＭＰＡ）及びグリオキシレートを生じさせる。好気的条件下において、酸素は、反応の共基質として利用される。フェナジンメトホスルフェート及びユビキノンのような他の電子担体は、好気的条件下の反応を刺激する。酸素の不在下では、これらの化合物は、電子受容体として作用する。
【００４２】この酵素的反応は、酸素電極を使用する酸素取込みによりアッセイすることができる。ＬＢＡＡ由来のグリホセート酸化還元酵素は、酸素還元の生成物として過酸化水素を生成しない。この酵素は、化学量論的に消費酸素１モル当り酸化されたグリホセート２モルを生成し、反応生成物としてＡＭＰＡ及びグリオキシレートをそれぞれ２モル生成する。
【００４３】グリホセート酸化還元酵素をアッセイする代替的な方法は、試料の２，４−ジニトロフェニルヒドラジンとの反応と、下記の項で詳しく説明するＨＰＬＣ分析によるグリオキシレート−２，４−ジニトロフェニルヒドラゾンの定量を伴う。
【００４４】グリホセート酸化還元酵素のアッセイの３番目の方法は、基質としての［３−１４Ｃ］−グリホセートの使用からなり；この酵素によって生成された放射性ＡＭＰＡは、下記に記載のアニオン交換カラム上のＨＰＬＣにより基質から分離される。ＡＭＰＡに関する放射能は、グリホセート酸化還元酵素反応の程度の尺度となる。
【００４５】ＬＢＡＡに由来するグリホセート酸化還元酵素は、補因子としてＦＡＤを使用するフラビンタンパク質である。この酵素により触媒される反応として本発明者らが提案している１つのメカニズムは、グリホセートによる酵素の活性部位におけるＦＡＤの還元を伴う。これは、還元されたＦＡＤ及びグリオキシレートとアミノメチルホスホネートのシッフ塩基の生成をもたらす。シッフ塩基は、水により水和され、その成分、ＡＭＰＡ及びグリオキシレートに加水分解される。還元されたフラビンは分子状酸素により再酸化される。このフラビン中間体は、グリホセートの酸素化を触媒して、ＡＭＰＡ及びグリオキシレートを生成することができる。この仮説は、認められた化学量論及びこの反応混合物中の過酸化水素を本発明者が検出できなかったことによるものである。
【００４６】グリホセートの他に、ＬＢＡＡに由来のグリホセート酸化還元酵素が、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）をグリシン及びグリオキシレートへ酸化する。ＩＤＡとの反応の速度は、グリホセートとの反応よりも著しく早い。
【００４７】有効にグリホセートからＡＭＰＡへの分解を行う細菌の単離グリホセートを分解する能力を有する細菌は知られている（ハラスら、１９８８；マリックら、１９８９）。これらの多数の細菌を、グリホセートの迅速な分解能力について下記の方法でスクリーニングした：２３の細菌単離物を、ＴＳＡ（トリプチケースダイズ寒天；ＢＢＬ）プレートから、炭素源としてのグルコース、グルコン酸塩及びクエン酸塩（各０．１％）、並びにリン源としてのグリホセートを０．１ｍＭ含むドヲルキン−フォスター塩培地からなる培地Ａへ移した。
【００４８】ドヲルキン−フォスター最小培地は、各々１ｍｌのＡ、Ｂ及びＣ、１０ｍｌのＤ、チアミンＨＣｌ（５ｍｇ）、各最終濃度が０．１％のＣ源並びに要求される濃度のＰ源（グリホセート、その他のホスホネートまたはＰｉ）を１ｌ（オートクレーブされたＨ２Ｏによる）中において合わせることによって作成した。
【００４９】
Ａ．Ｄ−Ｆ塩（１０００Ｘストック；１００ｍｌ当り；加圧滅菌）；
Ｈ３ＢＯ３ １ｍｇ ＭｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ １ｍｇ ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ １２．５１ｍｇ ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ ８ｍｇ ＮａＭｏＯ３．３Ｈ２Ｏ １．７ｍｇＢ．ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（１０００Ｘストック；１００ｍｌ当り；加圧滅菌）
； ０．１ｇＣ．ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（１０００Ｘストック；１００ｍｌ当り；加圧滅菌）
； ２０ｇＤ．（ＮＨ４）２ＳＯ４（１０００Ｘストック；１００ｍｌ当り；加圧滅菌）；
２０ｇ酵母抽出物（ＹＥ；ディフコ）を最終濃度が０．０１または０．００１％になるように添加した。
【００５０】培地各１ｍｌは、約２００，０００ｃｐｍ［３−１４Ｃ］グリホセート（アマースハム；ＣＦＡ．７４５）を含んでいた。この培養物を３０℃において振盪しながらインキュベーションした。単離物ＬＢＡＡは、１日で著しい成長を示したが、一方その他の試験培養物は、３日前にほとんど成長しなかった。培地、細胞ペレット及び培養上清（４日目のもの）中の放射能の測定（シンチレーションカウンター）により、全体の１４Ｃ放射能は減少し、残りは、上清及びペレットにおいて〜１：１に区分けされることが示され、グリホセートの著しい取込み及び代謝が起こっていることを示唆している。
【００５１】
【表１】

【００５２】５日目に、全ての試験培養物の培養上清７５μｌを下記のようにＨＰＬＣにより分析した：ＳＹＮＣＨＲＯＰＡＫＴＭＡＸ１００アニオン交換カラム（Ｐ．Ｊ．コバート）を使用し、可動相は６５ｍＭＫＨ２ＰＯ４からなり（ＮａＯＨによりｐＨ５．５：実験の必要に応じて、リン酸緩衝液の濃度は、５０〜７５ｍＭに変化し、材料の保持時間を変化した）、均一的に操作し、溶離した物質を放射能検出器を使用して連続的に監視した。特に一つの単離物（ＬＢＡＡ）において、分析結果から、グリホセートのピーク（本分析において保持時間［ＲＴ］＝７．０分）はまったく存在せず、メチルアミンまたはＮ−アセチルメチルアミン（ＲＴ＝３．５分間）と同じＲＴで、新しい放射能ピークが出現した。上記株ＬＢＡＡがその一部を形成する細菌のコレクションは、グリホセートをＡＭＰＡに分解すると特性化されている（ハラスら、１９８８）；メチルアミンまたはＮ−アセチルメチルアミンの検出により、ＡＭＰＡまたはＮ−アセチルＡＭＰＡはＬＢＡＡ「Ｃ−Ｐリアーゼ」活性により代謝され、この実験における成育に要求されるリン酸塩を放出する。株ＬＢＡＡは、より詳しく研究した。
【００５３】微生物単離物中のグリホセートからＡＭＰＡへの変換開示を明瞭かつ簡潔にするために、下記のグリホセート酸化還元酵素をコードする遺伝子の単離についての記述は、細菌単離物（ＬＢＡＡ）からの遺伝子の単離に向けるものとする。当業者は、その他の微生物単離物からこのような遺伝子を単離するために同一または類似の方法を利用することができることを容易に理解するであろう。
【００５４】グリホセート分解経路は、下記に示すように、グリホセート存在下で生育したＬＢＡＡの休眠細胞を用いて調べられた：炭素源としてグルコース、グルコン酸塩及びクエン酸塩、微量栄養素（＝培地ＤＦ３Ｓ）を補給するチアミン及び酵母抽出物（０．０１％）並びにリン源として０．２ｍＭ濃度のグリホセートを含むＤＦ培地中で成育したＬＢＡＡ培養物１００ｍｌから得た細胞をＫｌｅｔｔ＝２００で収穫し、ＤＦ３Ｓ培地２０ｍｌで２回洗浄し、等しい細胞２０ｍｌを、［３−１４Ｃ］グリホセートを含む同じ培地１００μｌ中に再懸濁させた（５２ｍＣｉ／ｍｍｏｌ２．５μｌ）。この細胞混合物を振盪しながら３０℃でインキュベーションし、試料（２０μｌ）を間隔を置いて抜取った。この試料を遠心分離し、上清及び細胞ペレットの両者をＨＰＬＣにより分析した（細胞ペレットを酸−ＤＦ３Ｓ［＝ＤＦ３Ｓ、０．６５Ｎ ＨＣｌ］１００μｌ中に再懸濁し、５分間沸騰し、短時間遠心分離し、得られた上清を分析した；酸性化されたグリホセート対照も調べた）。２時間の間、上清中のグリホセートピーク（ＲＴ＝７．８分）の放射能の量は、開始濃度の〜３３％に減少し、約３％のグリホセートが細胞中に見出された。メチルアミン標準とともに共溶離する物質は、上清中の開始時の数の〜５％を占め、細胞ペレット中で〜１．５％を占めた。７．７分のＲＴ（本実験における酸性化後にグリホセートＲＴ＝８．９分）において開始放射能の〜１．５％を占める新しいピークが細胞内容物中に同定された。全体の放射能中の大きな減少はまた、グリホセートがこの実験において大量に代謝されたことを示唆している。経路は、［１４Ｃ］ＡＭＰＡの代謝がＫｌｅｔｔ １６５において採取されＤＦ３Ｓ培地１００μｌ 当り細胞１５ｍｌの同量において再懸濁された休眠細胞中の［３−１４Ｃ］グリホセート（上記と同じ）の代謝と比較する次の実験においてさらに解明された。試料をＨＰＬＣにより分析し、酸性化された全体の培養物から成り、上記のように処理した。グリホセート実験の最初の２時間内に、２５％の放射能がメチルアミン／Ｎ−アセチルメタルアミンピーク（ＲＴ＝４．８分）中に見られ、１２．５％がＡＭＰＡ（ＲＴ＝６．４分）として、３０％が上述のピーク（ＲＴ＝９．４分）及び３０％がグリホセート（ＲＴ＝１１．８％）として見られた。このＡＭＰＡ実験において、放射能の１５％がＮ−アセチルメチルアミン／メチルアミンとして、５９％がＡＭＰＡとして及びＲＴ＝９．４分でピーク中に１８％が見出された。ＡＭＰＡの修飾体がＮ−アセチルＡＭＰＡとして同定された。類似のアセチル化工程が、唯一のＰ源としてのアミノメチルホスホネート中で成育するＥ．ｃｏｌｉ中で同定された生成物から推定されている（アヴィラら、１９８７）。これらのデータは、ＬＢＡＡ中のグリホセート分解経路がグリホセート→ＡＭＰＡ（→メチルアミン）→Ｎ−アセチルＡＭＰＡ→Ｎ−アセチルメチルアミンであることを指示している。
【００５５】Ｅ．ｃｏｌｉ中へのグリホセート酸化還元酵素遺伝子のクローニング株ＬＢＡＡにおけるグリホセートからＡＭＰＡへの変換が確認されたので、Ｅ．ｃｏｌｉ中での変換を伴う遺伝子のクローニングの直接的方法を研究した。クローニング及び遺伝学的技術は、特に断らない限り、一般的には、文献記載の方法を使用した（マニアティスら、１９８２）。クローニング方法は、下記のようにした：株ＬＢＡＡのコスミドバンクのＥ．ｃｏｌｉへの導入及びリン（Ｐ）源としてのグリホセートを成育に要求することによるグリホセートからＡＭＰＡへ変換する遺伝子の選択。この選択は、Ｅ．ｃｏｌｉ「Ｃ−Ｐリアーゼ」によるＡＭＰＡからＰｉの放出の後の、グリホセート代謝酵素により生成されたＰ源としてのＡＭＰＡの使用に依存している。ほとんどのＥ．ｃｏｌｉ株は、当初Ｐ源としてリン酸塩を利用することができないが、これらの株は通常、ＲｅｃＡとは無関係に、リン酸塩を利用し得るように迅速に適応する（Ｍｐｕ＋となる）（ワケットら、１９８７ｂ）。Ｅ．ｃｏｌｉＭｐｕ＋を下記のように、Ｅ．ｃｏｌｉＳＲ２００から単離した（Ｌｅｕ−、Ｐｒｏ−、ｒｅｃＡ、ｈｓｄＲ、ｓｕｐＥ、Ｓｍｒ、ｔｏｎＡ）：Ｅ．ｃｏｌｉＳＲ２００の新鮮なＬ−ブロス培養物を少量、Ｐ源としてアミノメチルホスホネート（ＡＭＰＡ；０．２ｍＭ；シグマ社製）を含有するＭＯＰＳ（ニートハルトら、１９７４）完全寒天培地（即ち、２５μｇ ／ｍｌでＬ−ロイシン及びＬ−プロリン並びに１０μｇ／ｍｌでビタミンＢ１（チアミン）を含む；寒天＝「精製された」ＤＩＦＣＯ）で平板培養した。
【００５６】ＭＯＰＳ成分：１０ｍｌ １０Ｘ ＭＯＰＳ塩２ｍｌ ０．５ｍｇ／ｍｌチアミンＨＣｌ１ｍｌ ２０％グルコース１０ＸＭＯＰＳ塩：１００ｍｌとして４０ｍｌ １Ｍ ＭＯＰＳｐＨ７．４４ｍｌ １Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ ｐＨ７．４１ｍｌ ０．０１Ｍ ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ５ｍｌ １．９Ｍ ＮＨ４Ｃｌ１ｍｌ ０．２７６Ｍ Ｋ２ＳＯ４１ｍｌ ０．５ｍＭ ＣａＣｌ２１ｍｌ ０．５２８ Ｍ ＭｇＣｌ２１０ｍｌ ５Ｍ ＮａＣｌ１ｍｌ ０．５％Ｌ−メチオニン１ｍｌ 微栄養成分微栄養成分は３×１０−９Ｍ（ＮＨ４）６Ｍｎ７ Ｏ２４４×１０−７Ｍ Ｈ３ＢＯ４３×１０−８Ｍ ＣｏＣｌ２１．６×１０−８Ｍ ＣｕＳＯ４８×１０―８Ｍ ＭｎＣｌ２１×１０−８Ｍ ＺｎＳＯ４である。
【００５７】６つの個々のコロニーを、３７℃における３日後のインキュベーションの後にこのプレートから採取し、Ｐ源としてＡＭＰＡまたはメチルホスホネート（アルファ社製）のいずれかを含むＭＯＰＳ完全寒天上に縞状に塗った。上記二つのリン酸塩培地に同程度にかつ均一に成育したコロニーをE.coliＳＲ２００Ｍｐｕ＋として選択した。
【００５８】染色体ＤＮＡを株ＬＢＡＡから下記のようにして調製した：ＬＢＡＡのＬ−ブロス（ミラー、１９７２）後期対数増殖期の細胞ペレット１００ｍｌを、溶液Ｉ（バーンボイム及びドーリー、１９７９）１０ｍｌ中に再懸濁させた。ＳＤＳを最終濃度が１％になるように添加し、懸濁液を、おのおの乾燥氷中の１５分間及び７０℃の水中の１０分間の浸漬からなる乾燥融解サイクルに３回付した。得られた溶解物をその後当容量のフェノール：クロロホルム（１：１；ＴＥにより飽和されたフェノール）（ＴＥ＝１０ｍＭトリスｐＨ８．０；１．０ｍＭＥＤＴＡ）を用いて４回抽出し、液相を遠心分離（１５０００ｇ；１０分間）により分離した。２容量のエタノールを添加して得たエタノール−沈殿物質を、短時間の遠心分離（８０００ｇ；５分間）によって上清からペレット化した。このペレットを５ｍｌＴＥ中に再懸濁し、２ｌのＴＥに対して４℃で１６時間透析した。この調製によって、１５０μｌ／ｍｌのＤＮＡ溶液６ｍｌが生じた。
【００５９】部分的に制限酵素により開裂されたＤＮＡを下記のようにして調製した：ＬＢＡＡＤＮＡの３つの１００μｇ試料を、それぞれ、４、２及び１酵素ユニット／μｇ ＤＮＡの割合で、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩにより３７℃において１時間処理した。ＤＮＡ試料を集め、ＥＤＴＡにより０．２５ｍＭとし、等容量のフェノール：クロロホルムで抽出した。Ｎａ酢酸塩及びエタノールの添加の後に、ＤＮＡを２容量のエタノールにより沈殿させ、遠心分離（１２０００ｇ；１０分間）によりペレット化した。乾燥したＤＮＡペレットを５００μｌＴＥ中に再懸濁し、０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリスｐＨ８．０、５ｍＭＥＤＴＡ中で１０〜４０％シュクロース勾配（各々５．５ｍｌの５％増加）で層状とした。ＳＷ２８ローターにより２６，０００ｒｐｍで２０時間遠心分離した後、管に穴をあけ、１ｍｌの画分を集めた。各第３の画分の試料１５μｌ を０．８％アガロースゲル上に塗り、ＤＮＡの寸法を線状ラムダＤＮＡ及びＨｉｎｄＩＩＩ−消化されたラムダＤＮＡ標準との比較により測定した。２５〜３５ｋｂフラグメントのＤＮＡを含む画分を集め、ＡＭＩＣＯＮ１０カラム上で脱塩し（７０００ｒｐｍ；２０℃；４５分間）、沈殿化により濃縮した。この操作により所望のサイズのＬＢＡＡＤＮＡの５０μｇが生成された。
【００６０】プラスミドｐＨＣ７９（ホーン及びコリンズ、１９８０）ＤＮＡ及びＨｉｎｄＩＩＩ−ホスファターゼ処理されたベクターを他の文献（マニアチスら、１９８２）に開示された方法により調製した。連結反応の条件は下記の通りである： ベクターＤＮＡ（ＨｉｎｄＩＩＩ−及び子牛アルカリホスファターゼ−処置）
１．６μｇ サイズ分画されたＬＢＡＡ ＨｉｎｄＩＩＩ 断片 ３．７５μｇ １０Ｘ連結緩衝液 ２．２μｌ ２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０；
１００ｍＭ ＭｇＣｌ２；
１００ｍＭ ジチオトレイトール；
５２ｍＭ スパーミジン Ｔ４ＤＮＡリガーゼ （ベーリンガー−マンハイム）
（４００ユニット／ｕｌ） １．０μｌ Ｈ２Ｏ２２．０μｌ〜になるまで １６℃で１８時間連結されたＤＮＡ（４μｌ）を、製造者の手順を使用してラムダファージ粒子（ストラータジーン；ギガパックゴールド）中に導入した。
【００６１】Ｌ−ブロス（０．２％のマルトースを含む）中で一晩成育したＥ．ｃｏｌｉＳＲ２００Ｍｐｕ＋が、導入されたＤＮＡ５０μｌにより感染させた。形質転換体を、Ｐ源として０．２ｍＭのグリホセートを含むＭＯＰＳ完全寒天及びアンピシリン上で選択した。
【００６２】少量の試料を、１ｍＭのＰｉを含むアンピシリンを加えたＭＯＰＳ（ニートハルトら、１９７４）完全寒天培地を用いて平板培養し、導入されたコスミド力価を評価したした。コスミド形質転換体を、３７℃において２日後に〜１０５／μｇ／ＬＢＡＡＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡの割合で後者の培地上で単離した。コロニーは、３日から１０日までグリホセート−寒天培地上で増加し、最終割合は２００〜３００コスミド当り１となった。プラスミドＤＮＡを、グリホセートプレートからの２１のコスミド形質転換体から調製した。これらのコスミドは、プラスミドＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ制限パターンに基づいて少なくとも２つのクラスに分類される。クラスＩでは、全てのコスミドが、共通の６．４及び４．２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ制限断片をクローニングしていて、クラスＩＩでは、共通の〜２３ｋｂｐ断片をクローニングしていた。種々のクローニングされた断片を代表する１０のコスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉＳＲ２００Ｍｐｕ＋中に再び形質転換し、グリホセート利用性をＭＯＰＳ完全寒天培地、同アンピシリン添加培地及び同グリホセート添加培地上での平板培養における成育の選択により確認した。Ｐ源としてグリホセート（ＭＯＰＳ培地中の０．２ｍＭ）を使用する培養物により得られる最終細胞濃度も測定したが、異なる形質転換体の間にはほとんど相違点が認められなかった。形質転換体を、Ｐ源として０．１ｍＭのＡＭＰＡを含むＭＯＰＳ完全ブロス中に植付け（「Ｃ−Ｐリアーゼ」活性の存在を確実にする）、３７℃における２４時間後に、０．１ｍＭのグリホセート及び［３−１４Ｃ］グリホセート（４０，０００ｃｐｍ／ｍｌ）を含むＭＯＰＳ完全培地中に１００倍に希釈した。全てのコスミド含有細胞がグリホセートを分解し、速度に大きな違いもなく、Ｎ−アセチルＡＭＰＡ及びＮ−アセチルメチルアミンを生成した。Ｎ−アセチルＡＭＰＡがこれらの試験中において、培養物の上清中に見出された。ｐＭＯＮ７４６８として同定されたクラスＩに由来の１つのコスミドを選んでさらに研究した。第二のグリホセート酸化還元酵素遺伝子がクラスＩＩコスミドクローンから同定されている。
【００６３】Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＲ２００Ｍｐｕ＋／ｐＭＯＮ７４６８の無細胞溶解物を、１．０ｍＭのグリホセート（及び各々１００μｇ／ｍｌのＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン及びＬ−トリプトファン並びに各５μｇ／ｍｌのｐ−ヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸及びｐ−アミノ安息香酸を補充してＥ．ｃｏｌｉＥＰＳＰシンターゼの阻害の影響を最小限にした）を含むＭＯＰＳ完全培地上で成育した細胞から調製した。細胞ペレット（約０．５ｇ湿潤重量）をリシス緩衝液（４０ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７．４；４ｍＭトリシン、ｐＨ７．４；１０％グリセロール；１ｍＭＤＴＴ）１ｍｌ中に再懸濁し、フレンチプレスを２回通過させた。細胞の破片を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより除去した。ＭｇＣｌ２を１０ｍＭまで添加した後、放射標識されたグリホセートの分解について上清をアッセイした。グリホセート基質を［３−１４Ｃ］グリホセートとして提供した（最終濃度＝１７μＭ）。観察された生成物は、大部分がＡＭＰＡと少量のＮ−アセチルＡＭＰＡであった；ＡＭＰＡが生成したことは、株ＬＢＡＡ由来の酵素活性がクローン化されたことを示しているが、Ｎ−アセチルＡＭＰＡは内生的エンドヌクレアーゼＥ．ｃｏｌｉ活性によるものであるかもしれない（アビラら、１９８７）。このような条件下のＡＭＰＡ生成の比活性は、１３．３ｐｍｏｌＡＭＰＡ／分．ｍｇタンパク質であった。
【００６４】グリホセートからＡＭＰＡへ変換する遺伝子の特性化次いで、グリホセート酸化還元酵素活性を生じるクローニング領域のコスミド中での位置を調べた。挿入物中でまれに切断する制限酵素の使用により、ｐＭＯＮ７４６８の主にクローニングされた領域内での種々の部分欠失物（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）を、下記のようにして単離した：０．５〜２μｇのプラスミドＤＮＡ試料を、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ、ＳａｃＩ、Ｂｇｌ ＩＩまたはＢａｍＨＩにより完全に消化し、フェノール：クロロホルムにより抽出し、エタノールにより沈殿させ、ＴＥ緩衝液中に再懸濁し、連結反応緩衝液及びＴ４ＤＮＡリガーゼにより最終容量５０μｌ中で室温において２〜４時間（１６℃において１８時間）連結させた。形質転換体をＥ．ｃｏｌｉＳＲ２００Ｍｐｕ＋中で選択し、これらの部分欠失物についてグリホセート利用性表現型の消失または保持について調べた。クローンの制限地図に関するこれらのデータを使用して、２つの共通のＨｉｎｄＩＩＩ断片（６．４及び４．２ｋｂ）を含むｐＭＯＮ７４６８中の挿入物の中心部分に近い位置に活性領域があることがわかった。この領域に由来するＨｉｎｄＩＩＩ制限断片をその後ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ストラータジーン）中にサブクローニングし、これらのグリホセート表現型をＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１Ｍｐｕ＋中で測定した（ＪＭ１０１のＭｐｕ＋誘導体をＳＲ２００Ｍｐｕ＋について記載されているようにして単離した）。いずれの配座（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）も６．４ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片を含むクローンは、グリホセートを利用した。このＨｉｎｄＩＩＩ断片の制限マッピングの後に、一連の部分欠クローンを挿入物中及びポリリンカー領域内でまれに切断する酵素を使用して２つの６．４ｋｂＨｉｎｄＩＩＩクローンから単離した。ＨｉｎｄＩＩＩ断片の内部の多数の制限断片もまたサブクローニングされた。３．５ｋｂＰｓｔＩ及び２．５ｋｂＢｇｌＩＩ断片は、いずれの配座もグリホセート利用に対して正であった。部分欠失物に由来するデータと合わせたこれらのデータを利用して、活性領域は約１．８ｋｂＢｇｌ ＩＩ−ＸｈｏＩ断片にあることがわかった。さらに、６．４ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片から単離された部分欠失物からは、ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩ部位をたぶん領域内に有する約０．７ｋｂの最小コード領域を示している。
【００６５】グリホセートからＡＭＰＡ酵素活性を生じるような転写／表現の方向を、下記のようにして調べた：ｐＭＯＮ７４６９＃１及び＃４のＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１Ｍｐｕ＋形質転換体（ｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩ部位中の２．５ｋｂＢｇｌ ＩＩ断片のクローン）を、Ｐｌａｃ誘導物質ＩＰＴＧを使用して及び無使用で、Ｍ９−グルコース−チアミン−アンピシリンブロス中で培養し、菌体を後期対数増殖期において採取し（クレット１９０〜２２０）、４つの培養物の無細胞溶解物を上記のようにして調製し、１７μＭのグリホセートを使用してグリホセートからＡＭＰＡへの変換活性をアッセイした。最も高い酵素活性が、ｐＭＯＮ７４６９＃１とＩＰＴＧに関して得られ、ＸｈｏＩ部位はＰｌａｃに遠位であり、遺伝子がＢｇｌ ＩＩからＸｈｏＩ方向中で発現されることを示唆している。
【００６６】
【表２】

【００６７】観察された唯一の生成物はＡＭＰＡであり、前に記載したＡＭＰＡアセチル化活性は、Ｐ源としてのグリホセート上で成育するＥ．ｃｏｌｉ形質転換体中に誘導されたことを示唆している。
【００６８】後の実験において、ｐＭＯＮ７４６９＃１及びｐＭＯＮ７４７０（ｐＵＣ１１８中のＢｇｌ ＩＩ−ＸｈｏＩ １．８ｋｂ；〜７００ｂｐＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片の欠失によりｐＭＯＮ７４６９＃１から形成された）の細胞溶解物を２ｍＭのグリホセートを使用して、グリホセートからＡＭＰＡへの変換活性についてアッセイし（Ｓｐ．Ａｃｔ．［３−１４Ｃ］グリホセート＝３．７ｍＣｉ／ｍｍｏｌ；０．２μＣｉ／反応；培地中でＩＰＴＧを使用して成育した培養物）、改良されたアッセイ条件を反映して、より高い酵素活性が記録された。
【００６９】
【表３】

【００７０】Ｂｇｌ ＩＩ断片によりコードされるタンパク質を、この断片をベクターｐブルースクリプト（＋）（ｐＭＯＮ７４７１＃１、＃２；反対の配座）中のＢａｍＨＩ 部位へクローニングして、Ｔ７発現系（テーバー及びリチャードソン、１９８５）を使用して生体内で測定した。試験及び対照プラスミドをｐＧＰ１−２（テーバー及びリチャードソン、１９８５）を含むＥ．ｃｏｌｉＫ３８中に形質転換し、アンピシリン及びカナマイシン（各々１００及び５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ−ブロス（２ｍｌ）中で３０℃においてクレットの目盛の〜５０まで培養した。少量を抜取り、細胞を遠心分離により採集し、Ｍ９塩（ミラー、１９７２）により洗浄し、０．２％のグルコース、２０μｇ／ｍｌのチアミンと、０．０１％の１８アミノ酸（システイン及びメチオニンを除く）を含むＭ９培地１ｍｌ中に再懸濁した。３０℃における９０分間のインキュベーションの後、培養物を４２℃の水浴に移し、そこで１５分間保持した。リファンシピン（シグマ社製）を２００μｇ／ｍｌとなるように添加し、この培養物を４２℃でさらに１０分間保持し、その後３０℃に２０分間移した。試料は３５Ｓ−メチオニン１０μＣｉにて３０℃、５分間パルスし、細胞を遠心分離により採集し、クラッキング緩衝液６０〜１２０μｌ中に再懸濁した（６０ｍＭトリス−ＨＣｌ６．８／１％ＳＤＳ／１％２−メルカプトエタノール／１０％グリセロール／０．０１％ブロモフェノールブルー）。少量の試料を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の電気泳動に付し、酢酸−メタノール−水（１０：３０：６０）１０容量中に６０分間浸した後、製造者の指示に従って、ゲルをＥＮＬＩＧＨＴＮＩＮＧＴＭ（デュポン製）中に浸し、乾燥し、Ｘ線フィルムに−７０℃で感光した。３５Ｓ−メチオニンを使用して標識されたタンパク質は、Ｂｇｌ ＩＩからＸｈｏＩ方向のみに検出され、最も大きいものは約４５ｋｄのサイズであった。ｐＢｌｕｅＳｒｉｐｔのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位中へのクローニング（ｐＭＯＮ７４７２を形成する）の後に、Ｂｇｌ ＩＩ−ＸｈｏＩ断片を調べたところ、この〜４５ｋｄのタンパク質は依然として発現された。
【００７１】Ｅ．ｃｏｌｉのグリホセートからＡＭＰＡ変換活性の発現のグリホセート耐性への効果を、最初に阻害濃度のグリホセートを含む培地中での組換え体の成育を調べることにより調べた。試験は、対照ベクター（ｐＵＣ１１８；ビエラ及びメッシング、１９８７）または２．５ｋｂＢｇｌ ＩＩ断片のｐＵＣ１１８クローン（ｐＭＯＮ７４６９＃１、＃４）を含むＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１の成育を比較した。グリホセート利用能力及びグリホセート耐性の間に非常に明白な相関関係があった。この耐性表現型（１５ｍＭグリホセートに対する耐性）をスクリーンとして、ｐＭＯＮ７４７０（ｐＵＣ１１８中のＢｇｌ ＩＩ−ＸｈｏＩ １．８ｋｂ；〜７００ｂｐＸｈｏＩ−ＳａｌＩ断片の欠失によりｐＭＯＮ７４６９＃１から形成された）及び後者のクローンのような欠失クローンの表現型の迅速なモニターリングに使用した。
【００７２】構造グリホセート酸化還元酵素遺伝子のヌクレオチド配列Ｂｇｌ ＩＩ−ＸｈｏＩ断片のヌクレオチド配列（配列番号：３）を一本鎖ＤＮＡ鋳型（ファージミドクローン及び「ヘルパー」Ｍ１３ファージＲ４０８を使用して生成された）及び商業的に入手可能なＳＥＱＵＥＮＡＳＥＴＭ（インターナショナルバイオテクノロジーズインコーポレーテッド）キットを使用して測定した。配列（配列番号：３）のコンピューター分析により、Ｂｇｌ ＩＩからＸｈｏＩ方向中の単一の大きい読み取り枠（ＯＲＦ）の存在が示され、これをいくつかの関連する制限部位とともに図２中に示す。仮定の終結コドン（ＵＡＡ）が、２ｂｐの５′ＳｃａＩ制限切断部位に存在した。このＵＡＡコドンが〜４５ｋｄＯＲＦの末端コドンであることを確認するデータを下記のように導き出した：グリホセート利用表現型に基づいて、３′限界はＳａｃＩ部位（ＳｃａＩ部位の９５ｂｐ上流）とＸｈｏＩ部位の間にあると以前に決定されている。
【００７３】Ｂｇｌ ＩＩ−ＳｃａＩ断片がｐＢｌｕｅＳｒｉｐｔのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位中にクローニングされ、タンパク質が生体内で発現させられた時にも、〜４５ｋｄのタンパク質がなお生成された。ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩとしてのｐＢｌｕｅＳｒｉｐｔクローンからのＢｇｌ ＩＩ−ＳｃａＩ断片をｐＵＣ１１８ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ中に再クローニングしたところ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１形質転換体に１５ｍＭグリホセートに対する耐性を与えることが見出された。これらのデータは〜４５ｋｄタンパク質のＣ末端がＳａｃＩ及びＳｃａＩ部位にあることを示している。いずれの読み取り枠中の、これらの部位の間の１の終結コドンは、ＳｃａＩ部位のすぐ上流にある。
【００７４】もしｆＭｅｔとして使用されたとき４６．１４０及び４４．００２ｋｄのタンパク質を生じさせる２つのメチオニンコドン（ＡＵＧ；位置１２０及び１８６に位置する）が存在するが、どちらのＭｅｔもはっきりと認識され得るシャイン−ダルガーノ配列が上流になかった。
【００７５】タンパク質の開始は、下記のように確定した：Ｂｇｌ ＩＩ制限部位認識配列を、ｐＭＯＮ７４７０の部位特異的変異誘発により、ＡＧＡＴＣＴをそれぞれＡＵＧ１２０及びＡＵＧ１８６の２１及び９ＢＰ上流にある配列ＡＧＡＣＴＧ（「Ｂｇｌ １２０」）及びＧＴＡＴＧＣ（「Ｂｇ １８６」）と置換して、可能性ある２つの開始コドンの上流の位置に導入した。特記する以外は、変異誘発のための変化される配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーの傍らには、各々の側部上に８〜１０の相同の塩基を付した。グリホセート耐性を突然変異したクローンについて測定した。ＡＵＧ１２０の上流のＢｇｌ ＩＩ部位の誘導は、グリホセート耐性に影響を与えなかったが、一方、グリホセート耐性はＡＵＧ１８６の上流のＢｇｌ ＩＩ部位を誘導する変異誘発により消失した。〜４５ｋｄタンパク質へのこれらの変異誘発の効果を、オリジナルのＢｇｌ ＩＩ部位のすぐ上流でＨｉｎｄＩＩＩ 部位の下流のｐＭＯＮ７４７０（ＫｐｎＩ）のポリリンカー中の１部位を使用して、突然変異された配列をＴ７発現ベクター中にサブクローニングすることによって調べた。この完全な断片を、ｐ１８ＵＴ３Ｔ７（ファルマシア）ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ中に再クローニングし、上記のように生体内で試験した。〜４５ｋｄのタンパク質がなお発現され、「Ｂｇｌ ＩＩ」変異誘発された配列の両方から比較可能なレベルであった。新しいＢｇｌ ＩＩ部位がｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩ部位へのクローニングのための５′末端（及びＨｉｎｄＩＩＩ 部位の下流）として使用されたとき、ＡＵＧ１２０の上流の新しいＢｇｌ ＩＩ部位が５′末端として作用するが、ＡＵＧ１８６の上流に位置するものが５′末端でない場合は、〜４５ｋｄタンパク質はなお発現される。これらのデータは、ＡＵＧ１２０（またはそれに非常に近い位置にあるいくつかのコドン）がグリホセート酸化還元酵素タンパク質のＮ−末端であることを強く示唆している。ＡＵＧ１８６の上流に導入されたＢｇｌ ＩＩ部位は、時期早尚に末端化するかまたは高度に不安定なタンパク質をもたらすことはなく、この変異誘発（Ｖａｌ１８−Ｃｙｓ１９−−→Ａｒｇ１８−Ａｌａ１９）から得られる予想されるコード配列変化が酵素活性に重大な影響を及ぼしたことを示唆している。
【００７６】ＮｃｏＩ制限部位認識配列（ＣＴＡＴＧＴのＣＣＡＴＧＧ；第二コドンをセリンからアラニンへ変化される）またはＮｄｅＩ配列（ＣＣＴＡＴＧのＣＡＴＡＴＧ）をＡＵＧ１２０へ別個に導入し（ｐＭＯＮ７４７０の変異誘発により）、有効なＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターを使用してこのＯＲＦを発現させることにより、Ｎ−末端の位置を確認する別のデータが得られた。ＮｄｅＩ版の表現の概要を以下に示す：仮定のＡＵＧで開始するＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片が、ｏｍｐＦ−ＩＧＦ−１融合断片を置き換える（ヲングら、１９８８）ｐＭＯＮ２１２３（ＮｄｅＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ）中にクローニングされた。得られたクローンはＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１中に導入され、細胞は文献記載の方法（ヲングら、１９８８）で２時間ナリジキシン酸により誘導された。得られたタンパク質は、ＳＤＳＰＡＧＥ上の〜４５ｋｄタンパク質と大きさの点で区別できず、誘導された培養物に由来する細胞溶解物は、１２．８ｎｍｏｌｓ ＡＭＰＡ／分．ｍｇのグリホセート酸化還元酵素比活性を有していた。別個の実験で比較したところ、第二コドンがセリンでなくアラニンであるときもグリホセート酸化還元酵素活性に相違が観察されなかった。グリホセート酸化還元酵素（配列番号：４）の構造ＤＮＡ配列は、ヌクレオチド１２０から開始し、図２のＢｇｌ ＩＩ−ＸｈｏＩ断片のヌクレオチド１４１５で終結しており、グリホセート酸化還元酵素は４３１のアミノ酸からなる（配列番号：５）。
【００７７】グリホセート酸化還元酵素植物遺伝子形質転換べクターの構築構造グリホセート酸化還元酵素遺伝子の操作を促進するために、内部ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩ制限部位認識配列を部位特異的変異誘発により除去して、配列ＧＡＡＴＴＣをＧＡＡＴＴＴに、ＣＣＡＴＧＧをＣＣＡＣＧＧにそれぞれ置換した。植物形質転換ベクターへの導入及び表現に適したグリホセート酸化還元酵素コード配列は、下記の方法によりアセンブリーした：ＮｃｏＩ（「Ｍｅｔ−Ａｌａ−」）Ｎ−末端をＮｃｏＩ−及びＥｃｏＲＩ欠失したコード配列と結合させ、内部ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＶ制限部位を使用する多数のクローニング工程によりＣ末端をＳｃａＩ部位にまで欠失させた。これらの工程において、Ｂｇｌ ＩＩ部位はＮｃｏＩ部位のすぐ上流に位置し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位は、終結コドンのすぐ下流に位置した。この操作されたグリホセート酸化還元酵素遺伝子の配列（配列番号：６）を図３に示す。操作されたグリホセート酸化還元酵素遺伝子はなお野性型のグリホセート酸化還元酵素タンパク質をコードする。この操作は、グリホセート酸化還元酵素のアミノ酸配列を変化させない。グリホセート酸化還元酵素構造配列（配列番号：６）は、１３２１ｂｐのＢｇｌ ＩＩ／ＮｃｏＩ−−ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片と同様に、適当な植物表現カセット中に容易にクローニングされる。このグリホセート酸化還元酵素遺伝子（配列番号：６）は、Ｂｇｌ ＩＩ−ＥｃｏＲＩと同様に、植物形質転換及び発現ベクターｐＭＯＮ９７９中にクローニングされて、ｐＭＯＮ１７０７３を形成した。
【００７８】グリホセート酸化還元酵素遺伝子配列の修飾及び再合成ＬＢＡＡに由来するグリホセート酸化還元酵素遺伝子は、植物中のこの遺伝子の高発現に不利となる配列を含んでいる。これらの配列は、しばしばＡ＋Ｔに富み植物遺伝子中に頻繁に見られるものよりも高いＧ＋Ｃ％（５６％対〜５０％）である潜在的ポリアデニル化部位、濃縮されたＧ及びＣ残基のストレッチ及び植物遺伝子中では頻繁に使用されないコドンを含む。グリホセート酸化還元酵素遺伝子の高いＧ＋Ｃ％は、下記を含む多数の潜在的結果をもたらす：コドンの第３位置中で植物遺伝子に見られるよりも高いＧまたはＣの利用、及びＲＮＡの発現または安定性に影響を与え得る強力なヘアーピン構造を形成する能力。グリホセート酸化還元酵素遺伝子のＧ＋Ｃ含量の減少、Ｇ及びＣのストレッチの崩壊、潜在的ポリアデニル化配列の除去並びに植物遺伝子により頻繁に使用されるようなコドンの利用という改良は、植物中のグリホセート酸化還元酵素の発現を高めることができる。
【００７９】この実験の第一期において、遺伝子の選択された領域を部位特異的変異誘発により修飾した。これらの修飾は、主に（しかし排他的ではなく）Ｇ＋Ｃ％を減少させ、Ｇ＋Ｃクラスターのいくつかを破壊することに向けられた。操作されたグリホセート酸化還元酵素遺伝子は、最初にＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩと同様にファージミドベクターｐＭＯＮ７２５８中に再クローニングされ、ｐＭＯＮ１７０１４を形成した。一本鎖のＤＮＡは、ｄｕｔ ｕｎｇ Ｅ．ｃｏｌｉ株から調製された。遺伝子の７つの領域は、表ＩＶ中に記載されたプライマー、バイオラッド変異誘発キット（カタログ＃１７０−３５７６）を使用し、このキットにより提供される手順に従って、部位特異的変異誘発により修飾された。
【００８０】明確にするために、実際のプライマーの逆補体を示す。前記プライマーに対応する図２及び図３中に示される配列中の塩基位置は、それぞれ第一及び第二組の数により示す。
【００８１】
【表４】

【００８２】得られた遺伝子（配列番号：７）は、配列決定及び操作されたグリホセート酸化還元酵素遺伝子対照と比較可能なグリホセート耐性レベルを与える能力により確認した。この修飾された遺伝子（配列番号：７）を「修飾されたグリホセート酸化還元酵素」と称する。グリホセート酸化還元酵素遺伝子（配列番号：６）のＧ＋Ｃ％は、操作されたバージョンの〜５６％から修飾されたバージョン（配列番号：７）の〜５２％に減少した。操作された及び修飾されたグリホセート酸化還元酵素遺伝子の比較を図３に示すが、操作されたバージョンを上に、修飾されたバージョンを生成するために導入された変化を下に示す。この修飾されたグリホセート酸化還元酵素遺伝子は、Ｂｇｌ ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片として、Ｅｎ−ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＮＯＳ３′配列を含む植物表現カセット中にクローニングされた。その後このカセットを、ＮｏｔＩ断片としてｐＭＯＮ８８６ベクター中にクローニングし、ｐＭＯＮ１７０３２を形成した（図５）。
【００８３】合成グリホセート酸化還元酵素遺伝子（配列番号：８）を、上記の不利な配列を可能な限り完全に変化するように設計した。まとめると、下記の配列または配列の特徴を可能な限り多く除去するように（一方で不要な制限部位の導入を避けるように）再設計した。：５またはそれ以上のＧ及びＣのストレッチ；ポリアデニル化部位または潜在的なＲＮＡ脱安定領域として作用する（支配的な）Ａ＋Ｔに富む領域；及び植物遺伝子中では頻繁に見られないコドン。操作された（配列番号：６）及び合成（配列番号：８）グリホセート酸化還元酵素遺伝子の比較を図４に示すが、操作された遺伝子（配列番号：６）を上部に、合成遺伝子（配列番号：８）に導入された相違を下に示す。合成グリホセート酸化還元酵素遺伝子のＧ＋Ｃ％は〜５１％であり、短く、高エネルギーのヘアーピン構造を形成する能力は減じられる。この合成遺伝子は、Ｂｇｌ ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてｐＭＯＮ９７９中にクローニングされ、植物中への導入のためのｐＭＯＮ１７０６５を形成する。
【００８４】葉緑体に向けられたグリホセート酸化還元酵素の発現植物中のグリホセート標的、５−エノールピルビル−シキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素は、葉緑体中に位置する。細胞質中に位置するグリホセート酸化還元酵素活性は、グリホセートがトランスジェニック植物中の葉緑体に到達するのを減少／防止するが、グリホセート酸化還元酵素の葉緑体への方向付けは、ＥＰＳＰシンターゼへのグリホセートの影響をさらに最小限にすることが見出されている。多くの葉緑体局在タンパク質は、プリカーサーとしての細胞核遺伝子から発現され、移入工程中に除去される葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ）により葉緑体を標的とする。このような葉緑体タンパク質の例としては、リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小サブユニット（ＳＳＵ）、５−エノール−ピルビル−シキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、フェレドキシン、フェレドキシン酸化還元酵素、集光性複合タンパク質Ｉ及びタンパク質ＩＩ、及びチオレドキシンＦが挙げられる。非葉緑体タンパク質は、ＣＴＰとのタンパク融合物を使用することにより葉緑体を標的とすることができ、ＣＴＰ配列はタンパク質に葉緑体を標的とさせるのに充分であることが生体内外で示されている（デラ−シオッパら、１９８７）。
【００８５】グリホセート酸化還元酵素タンパク質は、ＣＴＰのＣ末端及びグリホセート酸化還元酵素のＮ−末端の融合を構成することによって、葉緑体を標的とする。第一の例において、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａに由来のＳＳＵ１Ａ遺伝子から誘導された特定化ＣＴＰ（チミコら、１９８８）を使用した。このＣＴＰ（ＣＴＰ１と称される）を、部位特異的突然変異誘発の組み合わせにより構成した。ＣＴＰ１構造（配列番号：９）（図６）は、ＳＳＵ１ＡＣＴＰ（アミノ酸１〜５５）、成熟ＳＳＵ１Ａタンパク質の最初の２３のアミノ酸（アミノ酸５６〜７８）、セリン残基（アミノ酸７９）、ＳＳＵ１ＡＣＴＰのアミノ酸５０〜５６と成熟タンパク質の最初の２つのアミノ酸を繰り返す新しい部分（アミノ酸８０〜８７）並びにアラニン及びメチオニン残基（アミノ酸８８及び８９）からなる。ＮｃｏＩ制限部位は、３′末端に位置し（Ｍｅｔコドンに架橋する）グリホセート酸化還元酵素またはその他の遺伝子の５′への正確な融合物の構成を促進させる。後の段階において、Ｂｇｌ ＩＩ部位はＳＳＵ１Ａ配列のＮ末端の上流に導入され、その融合物の植物形質転換ベクターへの導入を促進させる。この融合物は、ｐＧＥＭ３ＺＦ（＋）ベクター中でＣＴＰ１（配列番号：９）及び操作されたグリホセート酸化還元酵素（配列番号：６）の間でアセンブリーされ（ＮｃｏＩ部位を介して）、ｐＭＯＮ１７０３４を形成する。このベクターは、ＳＰ６ポリメラーゼ及び３５Ｓ−メチオニンにより翻訳されたＲＮＡを使用して生体外で転写されて、以下に説明する方法によりＬａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａから単離された葉緑体中に移入されると評価され得る物質を提供する（デラ−シオッパら、１９８６、１９８７）。このＣＴＰ１−グリホセート酸化還元酵素融合物は勿論、対照に比較して３５Ｓ標識されたＰｒｅ ＥＰＳＰＳの約９％の有効性で葉緑体中に移入されることが見出されている（ｐＭＯＮ６１４０；デラ−シオッパら、１９８６）。ＣＴＰ１−グリホセート酸化還元酵素融合物はその後、合成グリホセート酸化還元酵素遺伝子（配列番号：８）とアセンブリーされ、Ｂｇｌ ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片として、植物ベクターｐＭＯＮ９７９中に導入されてｐＭＯＮ１７０６６を生成する（図７）。より多くのクローニング部位を得るための中間クローニング工程の後に、このＣＴＰ１グリホセート酸化還元酵素融合物もまた、ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ部位としてｐＭＯＮ９８１中にクローニングされ、ｐＭＯＮ１７１３８を生成する（図８）。
【００８６】第二の例において、ＣＴＰ−グリホセート酸化還元酵素融合物は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＥＰＳＰＳ（リーら、１９８７）ＣＴＰ及び合成グリホセート酸化還元酵素コード配列の間で構成される。このＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＣＴＰは、最初に部位特異的変異誘発により操作されて、ＣＴＰプロセッシング部位にＳｐｈＩ制限部位を配置する。この変異生成は、この位置におけるＧｌｕ−ＬｙｓをＣｙｓ−Ｍｅｔに置き換えた。ＣＴＰ２と称されるこのＣＴＰの配列（配列番号：１０）を図９に示す。合成グリホセート酸化還元酵素遺伝子の（配列番号：８）のＮｃｏＩ部位を、Ｍｅｔコドンを架橋するＳｐｈＩ部位により置き換えた。第二のコドンをこの工程中のロイシンのコドンに転化した。この変化は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のグリホセート酸化還元酵素の生体内の活性に明白な影響を与えなかった。ＣＴＰ−２合成グリホセート酸化還元酵素融合物はｐブルースクリプトＫＳ（＋）中にクローニングされ、この鋳型はＴ７ポリメラーゼを使用して生体外で転写され、３５Ｓ−メチオニン標識された物質がＣＴＰ１−グリホセート酸化還元酵素融合物の場合と比較可能な効率で葉緑体中に移入されることが示された。このＣＴＰ２合成グリホセート酸化還元酵素融合物はその後、ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片として植物発現ベクター中にクローニングされ、ｐＭＯＮ１７１６４を生成した。このプラスミドの構造地図を図１２に示す。
【００８７】ｐＭＯＮ１７１６４の植物ベクター部分（図１２）は、下記の部分から構成される。形質転換された組織を選択するために植物発現するように操作されたキメラカナマイシン耐性遺伝子。キメラ遺伝子は、０．３５Ｋｂカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（Ｐ−３５Ｓ）（オデールら、１９８５）、０．８３ＫｂネオマイシンホスホトランスフェラーゼタイプＩＩ遺伝子（ＫＡＮ）及びノパリンシンターゼ遺伝子の０．２６Ｋｂ３′非翻訳化領域（ＮＯＳ３′）（フレイリーら、１９８３）。ｐＴｉ１５９５５オクトピンＴｉプラスミドに由来の０．４５ＫｂＣｌａＩからＤｒａＩ断片は、Ｔ−ＤＮＡ左端領域（バーカーら、１９８３）を含む。ＲＫ２プラスミド由来の複製起源（ｏｒｉ−Ｖ）を含む０．７５Ｋｂ部分（スタルカーら、１９８１）。Ｅ．ｃｏｌｉ中の保持のための複製起源（ｏｒｉ−３２２）及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞への抱合転移のためのｂｏｍ部位を与えるｐＢＲ３２２の３．０ＫｂＳａｌＩからＰｓｔＩ部分。細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ）をコードし（フリングら、１９８５）、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓでの選択の決定基であるトランスポゾンＴｎ７から単離された０．９３Ｋｂ断片。ノパリン型Ｔ−ＤＮＡ右端領域を含むｐＴｉＴ３７プラスミドに由来する０．３６ＫｂＰｖｕＩからＢｃｌＩ断片（フレイリーら、１９８５）。ゴマノハグサモザイクウィルス由来の０．６Ｋｂ３５Ｓプロモーター（Ｐ−ＦＭＶ）（ゴウダら、１９８９）、いくつかの特異的クローニング部位、及びマメｒｂｃ Ｓ−Ｅ９遺伝子の０．７Ｋｂ３′非翻訳化領域（Ｅ９３′）（コルッジら、１９８４及びモレリら、１９８５）からなる発現カセット。ＣＴＰ−２合成グリホセート酸化還元酵素融合断片は、この発現カセット内にクローニングされる。このプラスミドのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの誘導及びそれに続く植物形質転換を、下記の実施例において説明する。
【００８８】当業者は、隣接するグリホセート酸化還元酵素を植物細胞葉緑体中に移入する特定のＣＴＰの機能を利用する種々のキメラ構造物を製造し得ることを理解するであろう。グリホセート酸化還元酵素の葉緑体移入は、下記のアッセイを使用して調べることができる。
【００８９】葉緑体取込みアッセイ完全な葉緑体を、バートレットら（１９８２）の変形方法を使用して、パーコール／フィコール勾配中で遠心分離によりレタス（Ｌａｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ，ｖａｒ．ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ）から単離した。完全な葉緑体の最終ペレットを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．７中の滅菌３３０ｍＭソルビトール０．５ｍｌ中に懸濁させ、クロロフィルについてアッセイし（アーノン、１９４９）、最終クロロフィル濃度が４ｍｇ／ｍｌとなるように調節した（ソルビトール／Ｈｅｐｅｓを使用）。レタスの単一頭部から得られた完全葉緑体の収量は３〜６ｍｌクロロフィルである。
【００９０】典型的な３００μｌ取り込み実験試薬は、５ｍＭＡＴＰ、８．３ｍＭ未標識メチオニン、３２２ｍＭソルビトール、５８．３ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、５０μｌ網状赤血球溶解物翻訳生成物及びＬ．ｓａｔｉｖａから得られた完全な葉緑体（２００μｇクロロフィル）を含んでいた。この取り込み混合物を最大光強度（１５０ワット灯）に設定したファイバーオプティックイルミネーターの真正面で室温においてゆっくりと振動させた（１０×７５ｍｍガラス管）。取り込み混合物の試料（約５０μｌ）を少量種々の時間において取り出し、１１，０００Ｘｇで３０秒遠心分離することにより１００μｌシリコーン油勾配上（１５０μｌポリエチレン管中）で画分する。これらの条件下で、完全な葉緑体はシリコーン油層の下でペレットを形成し、インキュベーション培地（網状赤血球溶解物を含む）はその表面上に浮く。遠心分離後に、シリコーン油勾配を、乾燥氷中ですぐに凍結させる。その後葉緑体ペレットをリーシス緩衝液５０〜１００μｌ（１０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨｐＨ７．５、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭベンズアミジン、５ｍＭε−アミノ−ｎ−カプロン酸及び３０μｇ／ｍｌアプロチニン）中に再懸濁し、１５，０００Ｘｇで２０秒間遠心分離して、ペレット化してチラコイド膜とする。この遠心分離により得られた清澄な上清（葉緑体タンパク質）及び各取り込み実験から得られる網状赤血球溶解物インキュベーション培地を少量、電気泳動のための当容量の２ＸＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合する（下記参照）。
【００９１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、３％（Ｗ／Ｖ）アクリルアミドスタッキングゲル（５ｍｍ×１．５ｍｍ）を有する３〜１７％（Ｗ／Ｖ）アクリルアミドスラブゲル（６０ｍｍ×１．５ｍｍ）中で、レムリ（１９７０）の方法により実施する。このゲルを４０％メタノール及び１０％酢酸を含む溶液中に２０〜３０分間固定する。その後、このゲルを、ＥＮ３ＨＡＮＣＥＴＭ（デュポン製）中に浸漬し、ゲルをゲル乾燥機で乾燥させる。増強スクリーンを使用して、一晩露出してこのゲルを放射能写真撮影し、グリホセート酸化還元酵素が単離された葉緑体中に移入されたか否かを測定する。
【００９２】その他のグリホセート酸化還元酵素構造遺伝子の代替的単離方法クラスＩＩコスミドｐＭＯＮ７４７７由来の第二のＬＢＡＡグリホセート酸化還元酵素遺伝子を含む多数のその他のグリホセート酸化還元酵素遺伝子が同定及びクローニングされている。第一グリホセート酸化還元酵素遺伝子をプローブとして使用して、上記のクローニングの項で説明した〜２３Ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片上でのサザンハイブリッド形成により、遺伝子が位置付された。サザン分析により、それぞれ〜３．５及び〜２．５ＫｂのＰｓｔＩ及びＢｇｌ ＩＩハイブリッドバンドも示された。ｐＭＯＮ７４７７由来のＢｇｌ ＩＩ断片がｐＢｌｕｅＳｒｉｐｔベクターのＢａｍＨＩ部位中にサブクローニングされた。クローニングされた断片がｐＭＯＮ７４６９＃１でのようにｌａｃプロモーターに関して方向付られているＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１中のクローン（ｐＭＯＮ７４８２）をＩＰＴＧとともに導入し、グリホセート酸化還元酵素活性をアッセイした。この実験において、〜９３ｎｍｏｌ／分．ｍｇのＳｐ．Ａｃｔ．が得られた。後者の実験において、クラスＩ及びクラスＩＩコスミドは、同一の包まれたコスミド調製品によるＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０１の感染及びＭ９培地上の３〜５ｍＭグリホセートにおけるグリホセート耐性の直接の選択の後に単離された。
【００９３】グリホセート酸化還元酵素遺伝子も、その他の微生物単離物からサブクローニングされ、グリホセートをリン源として利用するその能力により最初に同定され、その後ＬＢＡＡグリホセート酸化還元酵素遺伝子プローブとのハイブリッド形成により仮定的なグリホセート酸化還元酵素遺伝子を含むことが示されている。この遺伝子は、３ｍＭのグリホセートを含むＭ９培地上でＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐＧＰ１−２（ボイヤー及びローランド−デュソア、１９６９；テイバー及びリチャードソン、１９８５）中のグリホセート耐性をスクリーニングすることにより、Ｔ７プロモーター中に最初にクローニングされた。グリホセート酸化還元酵素遺伝子の存在は、最初にＬＢＡＡ遺伝子との正のハイブリッド形成シグナルにより、次いで、２．５ＫｂＢｇｌ ＩＩ断片上のその位置により同定された。このＢｇｌ ＩＩ断片をｐＢｌｕｅＳｒｉｐｔ中のＢａｍＩＩ 部位中にクローニングされ（ｐＭＯＮ１７１８３）、ＩＰＴＧの転化によりｌａｃプロモーターから発現された。この実験において、５３ｎｍｏｌｅｓ／分．ｍｇの特異的活性を有するグリホセート酸化還元酵素が得られ、この方法による遺伝子の単離が確認された。以下の特徴は、これらのグリホセート酸化還元酵素遺伝子に通常見られる：遺伝子は、〜２．５ＫｂＢｇｌ ＩＩ断片、〜３．５ＰｓｔＩ断片上に見られ（全長グリホセート酸化還元酵素遺伝子プローブを使用するサザンハイブリッド形成による）、遺伝子内に１のＥｃｏＲＩ部位を含み、この遺伝子はＨｉｎｄＩＩＩ部位を含まない。下記の概略図は、これらの遺伝子のいくつかの共通の特徴を示すものである。
【００９４】
【化１】

【００９５】グリホセート酸化還元酵素遺伝子の高度の類似性は、新規のグリホセート酸化還元酵素遺伝子がクローニングされ得るその他の方法を示唆している。遺伝子の側部に位置する領域の明白な保存及び特定の制限部位の不在は、Ｂｇｌ ＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＮｄｅＩの制限部位またはその他の適当なクローニング部位を含む、側部に位置する領域へ一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ並びにクローニングに適したグリホセート酸化還元酵素遺伝子断片を増幅するＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応；ＰＣＲの完全な詳細及びその応用についてはエールリッヒ、１９８９参照）の使用を示唆している。野性型（ＬＢＡＡ単離物）グリホセート酸化還元酵素遺伝子の１１９ｂｐ上流（配列番号：１１）及び遺伝子の〜２９０ｂｐ（配列番号：１２）下流の側部に位置する配列を図２に示す。
【００９６】ＰＣＲ法を使用して、多数の起源に由来するグリホセート酸化還元酵素遺伝子が単離されている。グリホセート酸化還元酵素活性の存在は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．株ＬＢｒから調製された染色体ＤＮＡ由来のグリホセート酸化還元酵素遺伝子をクローニングすることにより（ジェイコブら、１９８８）、及びＬＢＡＡグリホセート酸化還元酵素遺伝子のＮ及びＣ末端に相同で下記の適当な制限クローニング部位を有するプライマーを使用して確認された：5-GAGAGACTGT CGACTCCGCG GGAGCATCAT ATG-3（配列番号１３）と5-GAACGAATCC AAGCTTCTCA CGACCGCGTA AGTAC-3（配列番号１４）
これらのＰＣＲ反応に使用されたサイクルサームのパラメーターは下記の通りである：９４℃で１分間変性；６０℃で２分間アニール；７２℃で３分間重合化；３０サイクル、自動延長はなし、４℃のインキュベートに連結された。
【００９７】生成される所期の〜１．３ｋｂＰＣＲが生成され、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ による消化の後、この断片は、コードされた酵素の発現のためにｐＭＯＮ２１２３中にクローニングされた。グリホセート酸化還元酵素活性を上記に記載のようにして測定し、グリホセートのＫｍは、上記に示されるＬＢＡＡから得られる酵素のそれと類似していた： グリホセート源 Ｋｍ（グリホセート：ｍＭ） 酸化還元酵素遺伝子 Pseudomonas ｓｐ．ＬＢｒ株 ２５【００９８】グリホセートプロセス廃棄流処理装置から単離された細菌も、グリホセートをＡＭＰＡに変換させることができる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株ＬＢＡＡ及びＬＢｒは、２つのそのような例である。このような細菌は、これらの廃棄流処理装置から新たに単離することができる。
【００９９】細菌の母集団を、マンヴィルＲ−６３５ケイソウ土ビーズを使用する固定床不動セルカラムから、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含むトリプトンソイ寒天（ディフコ製）上に置き、２８℃でインキュベートすることによって単離した。カラムを、モンサント社のルーリング、ＭＳ、グリホセート製造プラントから得られる廃棄水流上で３月間作動させた。カラムは、５０ｍｇ／ｍｌのグリホセートとＮＨ４ＣｌとしてＮＨ３を含んでいた。全有機炭素は３００ｍｇ／ｍｌであり、ＢＯＤ（生物学的酸素要求量−「ソフト」の炭素有効性の測定）は３０ｍｇ／ｍｌよりも少なかった。この処理カラムについては、文献に記載されている（ヘイトカンプら、１９９０）。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株Ｔ１０であると同定されたこの母集団の優勢なメンバーの１つは、与えられる唯一の炭素源が１０ｍＭのグリホセートである最小ブロス（このブロスはＤＦ培地と同様にして構成されているが、グルコース、グルコン酸塩及びクエン酸塩の代りにグリホセートを使用している）中でも成育することが見出された。染色体ＤＮＡは、この単離物から調製され、株ＬＢｒに対して上記したものと同一のプライマーを使用して同一のＰＣＲ法に付された。正しい寸法の断片が生成され、Ｅ．ｃｏｌｉ表現ベクター中にクローニングされた。グリホセート酸化還元酵素活性をアッセイし、グリホセートのＫｍもまた測定された： 遺伝子の起源 Ｋｍ（グリホセート：ｍＭ）
Agrobacterium ｓｐ． Ｔ１０株 ２８【０１００】グリホセートからＡＭＰＡの変換は、多くの異なる土壌について報告されており（復習のためにマリクら、１９８９を参照）、土壌のような混合環境試料から全ＤＮＡを抽出するために、多数の方法を利用することができ（ホーベンら、１９８８；ステファン及びアトラス、１９８８；ツアイ及びオルソン、１９９１）、分解性微生物を最初に単離する必要なしに、グリホセート酸化還元酵素遺伝子をクローニングする可能性を示している。もちろん、グリホセート利用能力またはＥ．ｃｏｌｉ上のグリホセート耐性の授与に基づく、グリホセート酸化還元酵素のクローニングについて記載された方法は、本明細書に記載のグリホセート酸化還元酵素について決定された相同性に依存せずに、その他のグリホセート酸化還元酵素遺伝子またはその他のグリホセート代謝遺伝子がクローニングされ得る反応図式を提供する。例えば１区画の土壌にグリホセートを繰り返し与えることによって、グリホセート分解に関して細菌を強化することもできる（クインら、１９８８、タルボットら、１９８４）。この強化工程を使用して、グリホセート酸化還元酵素遺伝子を土壌またはその他の環境から回収する容易性を高めることができる。
【０１０１】土壌細菌中のグリホセート酸化還元酵素遺伝子の存在の証明及びこのような遺伝子の単離の方法を以下説明する：適当な細菌の母集団を、炭素源としてグリホセート（１０ｍＭ）を含む液体培地中（この培地は、ドヲルキン−フォスター培地と同様のものであるが、炭素源を省略し、Ｐ源としてＰｉを使用する）で成育することができる細菌を選択するために強化した。接種は土壌の採取（イリノイ州ジャージービルの最近収穫されたダイズ畑から得られた）により与えられ、母集団は２８℃において上記の培地中で引続き培養することにより選択された（シクロヘキシムは真菌の成育を防止するために１００μｇ／ｍｌで含まれる）。Ｌ−寒天培地上で平板培養したところ、５のコロニータイプが同定された。染色体ＤＮＡがこれらの単離物のＬ−ブロス培養物２ｍｌから調製され、グリホセート酸化還元酵素遺伝子の存在は、ＰＣＲスクリーニングを使用して証明された。プライマー、GCCGAGATGACCGTGGCCGAAAGC（配列番号：１５）及びGGGAATGCCGGATGCTTCAACGGC（配列番号：１６）を使用して、予測された寸法のＤＮＡ断片が単離物（Ｓ３と称される）の１つから染色体ＤＮＡとともに得られた。使用されたＰＣＲの条件は下記の通りである：９４℃で１分間；４０℃で２分間；７２℃で３分間；３５サイクル。この方法で生成されたＤＮＡ断片をプローブとして使用して（放射標識後）、ＬＢＡＡＤＮＡについて記載されたように構成されているコスミドバンクからＳ３グリホセート酸化還元酵素遺伝子候補物を単離し、その他のグリホセート酸化還元酵素遺伝子の単離を大いに促進させる。使用されるプライマーは、ＬＢＡＡグリホセート酸化還元酵素遺伝子中の内部配列と相同である。使用されたＰＣＲ条件は、プライマーにおいてかなりの程度に不適当な組合せをし、その結果は、Ｓ３から得られるグリホセート酸化還元酵素遺伝子が、ＬＢＡＡ遺伝子のＮ及びＣ末端に対するプライマーを使用して連続的に単離されたその他のグリホセート酸化還元酵素遺伝子に近接に関連するものではないことを示唆している。
【０１０２】遺伝子の単離には種々の方法を利用することができる。これらの方法のいくつかは、単離を促進するように表現型スクリーンを設計する遺伝子の機能の知識に基づくものである。その他の方法は、部分的または完全な相同を有するプローブまたはプライマーの利用を認める少なくとも一部のＤＮＡ配列情報に基づくか、または遺伝子生成物を検出する抗体の使用に基づく。これらの選択可能物の全てをグリホセート酸化還元酵素遺伝子のクローニングに応用することができる。
【０１０３】グリホセート酸化還元酵素の動力学的性質の改良殺草剤の酵素不活性による操作された殺草剤耐性の従来の例は、グリホセート酸化還元酵素がグリホセートを代謝するよりもより高い効率で殺草剤に結合し代謝する能力を有する酵素を利用していた。グリホセート酸化還元酵素は、２０〜３０ｍＭのグリホセートのＫｍを有し、その結果、グリホセートの分解の反応速度は、Ｋｍを低下させるかＶｍａｘを増加させることによってトランスジェニック植物中の最適効率で高められることができる。
【０１０４】適当な選択及び／またはスクリーニングと結合した無秩序の変異誘発技術は、多数の突然変異された遺伝子配列及び潜在的な変異体を生成することに成功している強力な手段である。同一の方法を使用して、改良されたグリホセート分解効率を有するグリホセート酸化還元酵素変異体を単離し同定することができる。使用することができる変異誘発技術は、興味のある遺伝子を含む細菌培養物またはその遺伝子を含む精製されたＤＮＡの化学的変異誘発並びにヌクレオチドの新規な鎖への誤導入（エラー）を助けるような条件下での遺伝子の複製（またはその一部）を精製するために使用されるＰＣＲ方法を含む。このような条件の例は、Ｍｎ＋＋の存在下でＰＣＲ法を実施することである。
【０１０５】変異誘発後の改良された変異体の適当な生体内スクリーニングは、Ｅ．ｃｏｌｉでの改良されたグリホセート耐性に関するスクリーニング、またはＭｐｕ＋株中のグリホセート上での高められた成育についてのスクリーニングを含むであろう。スクリーニングのために、グリホセート酸化還元酵素は、弱い細菌プロモーターを含むベクター及び／または低複製番号を有するレプリコン中へクローニングされる。異なるグリホセート酸化還元酵素構造物のグリホセート耐性表現型は、グリホセート濃度の範囲にわたって変化し、グリホセート酸化還元酵素発現のレベルと相関関係があることが判明している。例えば、未誘導条件下で、Ｐｌａｃ−グリホセート酸化還元酵素ベクターは、ＰｒｅｃＡ−グリホセート酸化還元酵素ベクターよりもグリホセート酸化還元酵素をより少なく発現し、より低いグリホセート耐性を示す。変異誘発された遺伝子断片が、最も適当なベクター中にクローニングされ、得られたライブラリーをスクリーニングした。親グリホセート酸化還元酵素クローンを含む対照株の成育を阻害するグリホセート濃度で成育するその能力に関して、変異体を選択する。グリホセート酸化還元酵素活性は、Ｅ．ｃｏｌｉ上にグリホセートをＡＭＰＡに変換する能力を与え、適当なＥ．ｃｏｌｉ株中で、そのＡＭＰＡは、Ｃ−ＰリアーゼによるＣ−Ｐ結合の分裂の後にリン酸塩の源を与えることができる。適当なＥ．ｃｏｌｉ株は、Ｂ株またはＫ株のＭｐｕ＋誘導体である。グリホセート酸化還元酵素遺伝子は、株Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０１Ｍｐｕ＋（＝ＧＢ９９３）中で唯一のリン源としてのグリホセート上での最小の成育を与える。グリホセート上の成育速度は、グリホセート酸化還元酵素発現レベルと相関関係があることも示されている。変異誘発されたグリホセート酸化還元酵素遺伝子は、適当なベクター及びプレート上での異なる成育速度または唯一のリン源としてのグリホセートを含む培地中での培養によりスクリーニングされた変異体ライブラリー中にクローニングされた。対照株と比較してプレート上で速い成育を示すクローンは、その後成育曲線分析により再スクリーニングされた。
【０１０６】各選択／スクリーニングにおいて同定されているグリホセート酸化還元酵素変異体は、高レベル表現でベクター中にクローニングされ、グリホセートのＫｍ及びＶｍａｘ値を測定する酵素分析に付された。最良のグリホセート酸化還元酵素変異体は完全な動力学的特性化のために精製される。野性型の酵素値よりも低いＫｍ値及び同等以上のＶｍａｘ値により同定されているグリホセート酸化還元酵素の変異体が、核酸配列決定により分析され、変異が決定される。変種の単離における目的は、グリホセート酸化還元酵素触媒されたグリホセート減成に対するＫｃａｔ／Ｋｍ率を高めることにある。
【０１０７】このような改良を伴う変異体が単離された。使用された変異誘発方法は、Ｍｎ＋＋により弱められたＰＣＲ方法であり、鋳型は、合成グリホセート酸化還元酵素を含む線状化されたグリホセート酸化還元酵素プラスミド（配列番号：８）であった。使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、ベクター中の領域に相同であり、グリホセート酸化還元酵素遺伝子の側部に位置する。
【０１０８】使用されるＰＣＲ条件は下記の通りである：９４℃で１分間、５５℃で２分間及び７２℃で３分間、３５サイクル。ｄＣＴＰ＋ｄＧＴＰ＋ＴＴＰ対ｄＡＴＰの５：１の割合を用いた。反応試薬は、１２５、２５０、３７５または５００μＭのＭｇＣｌ２を含んでいた。反応後、増幅された生成物を、弱いＥ．ｃｏｌｉプロモーターを含むベクター中に再クローニングした。このベクターは、ａｒａＢＡＤプロモーター及び適当なクローニング部位を含むｐＢＲ３２７誘導体である。このクローニング工程から得られた１００のコロニーをその後、改良されたグリホセート耐性について、並びにグリホセート及びＰｉまたはグリホセートのみをそれぞれ含むＭＯＰＳ最小培地からなる培地中の利用表現型について、Ｅ．ｃｏｌｉＧＢ９９３中でスクリーニングした。成育速度を９６時間にわたってＡ５５０を測定することにより決定した。３つのクローンが、これらのスクリーンにおいてより速い成育速度を示すものとして同定された。これらの形質転換体は、１．５〜２．０倍速い利用表現型を有していた。グリホセート酸化還元酵素遺伝子は、発現ベクター部分に再クローニングされ、この表現型は変化した。全動力学的分析は、粗Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物中で実施した。仮定のグリホセート酸化還元酵素変異体タンパク質は、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ変異体グリホセート酸化還元酵素遺伝子をＰｒｅｃＡ−遺伝子１０Ｌ発現ベクター中にサブクローニングした後に、過発現された。ＰｒｅｃＡ−遺伝子１０Ｌ中の過発現のために、前記ベクターを含むＧＢ９９３細胞は、５０μｇ／ｍｌナリジキシン酸を含むＭ９最小倍中へクレット＝１１０〜１２０で導入され、激しく振盪させながら３７℃において２．５時間成育させた。細胞を４０００ｇにおいて５分間４℃において遠心分離することにより採取し、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．１、１ｍＭＥＤＴＡ、３５ｍＭＫＣｌ、２０％グリセロール及び１ｍＭベンズアミジン中で、３ｍｌ／ｇ細胞ペレットの濃度で再懸濁した。溶解物は、１０００ｐｓｉのフレンチプレス中で細胞を２回破断することにより調製した。不溶性の破片を１２０００ｇで１５分間４℃において遠心分離することにより除去し、上清をＰＤ−１０カラムを通すことにより脱塩した（セファデックスＧ−２５、ファルマシア）。空隙率画分を動力学的分析のための酵素源として用いた。タンパク質濃度をバイオラッドのタンパク質色素結合アッセイを使用して測定した。時間及び酵素濃度の推移を実施して直線範囲を測定した。酵素アッセイを下記のようにして実施した：１００μｌ反応試薬中の溶解物及びグリホセート酸化還元酵素混合物（最終濃度＝０．１ＭＭＯＰＳ、０．０１Ｍトリシン、ｐＨ７．４、０．０１ｍＭＦＡＤ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）を、グリホセートの添加の前に、２分間３０℃においてプレインキュベーションした（ＮａＯＨによりｐＨ７．０に調整された、水中調製の分析等級のストック）。１０分間の時間が、１０μｇ溶解物を使用する酵素アッセイに最適の時間であると決定された。振盪を伴う３０℃における１０分間の後、０．２５ｍｌのジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）試薬（０．５ＭＨＣｌ中０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加して、さらに５分間３０℃において振盪しながら、反応を進行させた。次いで、１．５ＭＮａＯＨ溶液（４００μｌ）をアッセイ混合物に添加し、反応を３０℃において振盪しながら５分間続けた。酵素活性を、グリオキシレートの標準に対するＡ５２０を測定することにより、生成されたグリオキシレート−ＤＮＰＨ付加物の量から測定した。酵素アッセイを、仮定のグリホセート酸化還元酵素変異体の少なくとも２つの異なる単一コロニー単離物において２回行う。Ｋｍ及びＶｍａｘを決定するために、酵素アッセイを、グリホセート濃度の（０．２〜２．０）×Ｋｍ範囲上で行った。Ｋｍ及びＶｍａｘを、ラインウィーバーバーク、イーディー−ホフスティー及び双曲線形動力学的プロットから決定した。Ｖｍａｘは、下記のイムノブロット分析により溶解物中の免疫反応グリホセート酸化還元酵素タンパク質の量を測定した後に評価された。イムノブロット分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びに０．１％ＳＤＳ及び２５％メタノールを含む２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン中のホーファートランスファー装置中での、５００ｍＡにおける１〜２時間のタンパク質のゲルからニトロセルロースへの移送の後に実施した。移送の後、ニトロセルロースは、少なくとも３０分間振盪しながら室温において、２％のウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．９％ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．０２％ＮａＮ３とともに、インキュベーションした。
【０１０９】ブロッキングの後、ヤギ抗グリホセート酸化還元酵素抗血清の１：２５，０００希釈を含む同一の緩衝液を添加し、フィルターを室温において４５分間振盪させた。第一のグリホセート酸化還元酵素抗体とともにインキュベーションした後、フィルターを抗体なしの緩衝液中で、４５分洗浄した；ラビット抗ヤギアルカリホスファターゼ−接合された第二抗体（ピアス製）の１：５０００希釈を含む緩衝液を添加し、フィルターを振盪しながら室温において４５分間インキュベーションした。ＮＢＴ及びＢＣＩＰ（プロメガ）を添加して発色させる前に、フィルターを抗体を含まない緩衝液中で３０分間洗浄した。免疫反応性グリホセート酸化還元酵素タンパク質もニトロセルロース上で溶解物をドットブロットすることにより定量し、次いで１２５Ｉ−タンパク質Ｇを検出のために使用すること以外は上記と同様にフィルターを処理した。溶解物中のグリホセート酸化還元酵素タンパク質の量は、ドットを数えて、放射能をグリホセート酸化還元酵素タンパク質標準と比較することにより決定される。１の変異体、ｖ．２４７は、２５ｍＭグリホセートにおいてグリホセート酸化還元酵素の３〜４倍高い比活性を示し、イムノブロット分析により、それが高められたグリホセート酸化還元酵素タンパク質レベルを原因とするものではないことが示された。次に続くアッセイは、この変異体が、野性型のグリホセート酸化還元酵素よりもグリホセートの１０倍低いＫｍを有していることを示した。類似の方法により、ＩＤＡのＫｍを測定し、そのデータを下記に示す。
【０１１０】
【表５】

【０１１１】ｖ．２４７から得られたグリホセート酸化還元酵素遺伝子は配列決定され（配列番号：１７）、５つのヌクレオチド変化が見られた。これらの変化を、それらがコドンに関連するように以下に示す：ＧＣＴからＧＣＣ（コドン４３）、アミノ酸変化なし；ＡＧＣからＧＧＣ（コドン８４）、ＳｅｒからＧｌｙ；ＡＡＧからＡＧＧ（コドン１５３）、ＬｙｓからＡｒｇ；ＣＡＣからＣＧＣ（コドン３３４）、ＨｉｓからＡｒｇ及びＣＣＡからＣＣＧ（コドン３６２）、アミノ酸変化なし。ｖ．２４７由来のグリホセート酸化還元酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号：１８に示す。これらの異なるアミノ酸変化の重要性を、最初に変化した領域を野性型のグリホセート酸化還元酵素中に再クローニングし、グリホセート酸化還元酵素活性及び動力学への影響を測定することにより決定した。これらは、ＮｃｏＩ−ＮｈｅＩ断片（コドン８４を含む）、ＮｈｅＩ−ＡｐａＬＩ断片（コドン１５３を含む）及びＡｐａＬＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（コドン３３４を含む）を別個に、野性型遺伝子中に再クローニングすることによって行われた。次いでこれらのグリホセート酸化還元酵素遺伝子を後発現させ、動力学的分析を実施した。得られたデータを下記に示すが、ＡｐａＬＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（コドン３３４を含む）において生じた変化は、単に酵素中の変化の原因となることを示している。
【０１１２】
【表６】

【０１１３】この結果は、コドン３３４におけるＨｉｓからＡｒｇへの変化を繰り返し、部位特異的変異誘発によりこの残基においてその他の特異的変化を導入することによって確認され、延長された。使用されたプライマーを以下に示す。
【０１１４】
【表７】

（これらの配列は、実際に使用されるものに対してアンチセンスである。）これらの変化の存在は、変異誘発されたグリホセート酸化還元酵素遺伝子の配列決定により確認され、発現されたグリホセート酸化還元酵素の動力学的分析を行った。データを以下に示すが、多数の置換がこの位置において可能であり、それが変化した動力学的性質を有する酵素を得る結果となることを示している。
【０１１５】
【表８】

【０１１６】付加的な変異誘発を実施して、Ｈｉｓ３３４残基をその他のアミノ酸に変化させた。それを行うプライマー及び新しいコドンを以下に示す： Ｔｒｐ−CTCTACACTTGGGCTCGTAAGCTTCTTCCAGC（配列番号：２３）；
Ｉｌｅ−CTCTACACTATCGCTCGTAAGCTTCTTCCAGC（配列番号：２４）；
Ｌｅｕ−CTCTACACTCTGGCTCGTAAGCTTCTTCCAC（配列番号：２５）；
Ｇｌｕ−CTCTACACTGAAGCTCGTAAGCTTCTTCCAGC（配列番号：２６）
（これらの配列は、実際に使用されているものに対してアンチセンスである；これらのプライマーは、母集団から変異誘発された子孫の同定を促進する「静かな」ＨｉｎｄＩＩＩを添加する。）ＧＬＵ３３４変異体は、実質的なグリホセート酸化還元酵素活性を保持し、一方ＴＲＰ３３４、ＩＬＥ３３４及びＬＥＵ３３４変異体は、活性を保持する割合が非常に低い。
【０１１７】第一世代の変異体から、最も高いＫｃａｔ／Ｋｍ率を有するものが、第二回目の変異誘発に付され、その後次のスクリーニング及び分析に付される。第一世代の変異体において同定された単一の点変異を結合することにより第二世代のグリホセート酸化還元酵素変異体を構成するために、代替的な方法を使用することができる。
【０１１８】植物形質転換本発明の実施によりグリホセート耐性を有することができる植物は、これらに限定されないが、ダイズ、ワタ、コーン、キャノーラ、脂肪種子ナタネ、アマ、テンサイ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、小麦、コメ、アルファルファ、レタス、リンゴ、ポプラ及びマツを含む。
【０１１９】本発明の二本鎖ＤＮＡ分子（「キメラ遺伝子」）を、いずれかの適当な方法により植物のゲノム中に挿入することができる。適当な植物形質転換ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドから誘導されるもの、並びに例えば、ヘレラ−エストレラ（１９８３）、ビーバン（１９８４）、リー（１９８５）及びＥＰＯ公開１２０，５１６（シルペルートら）に記載されたものを含む。ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴｉまたは根−誘導（Ｒｉ）プラスミドから誘導される植物形質転換ベクターに加えて、代替的な方法を使用して、本発明のＤＮＡ構造物を植物細胞中に挿入することができる。このような方法は、例えば、リポソーム、エレクトロポレーション、遊離ＤＮＡの取込みを増加する薬品、微小投影衝撃を介する遊離ＤＮＡの輸送及びウィルスまたは花粉を使用する形質転換の利用を含む。
【０１２０】ｐＭＯＮ９７９植物形質転換／発現ベクターは、ｐＭＯＮ８８６中のネオマイシンホスホトランスフェラーゼタイプＩＩ（ＫＡＮ）遺伝子を、細菌ゲンタマイシン−３−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼタイプＩＩ（ＡＡＣ（３）−ＩＩＩ）遺伝子と取り替えることにより、ｐＭＯＮ８８６（下記に説明する）から誘導された（ヘイフォルトら、１９８８）。キメラＰ−３５Ｓ／ＡＡ（３）−ＩＩＩ／ＮＯＳ３′遺伝子は、ゲンタマイシン耐性をコードし、それにより形質転換された植物細胞を選択することとなる。ｐＭＯＮ９７９はまた、高められたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ケイら、１９８７）、いくつかの独特な制限部位及びＮＯＳ３′末端（Ｐ−Ｅｎ−ＣａＭＶ３５Ｓ／ＮＯＳ３′）からなる０．９５ｋｂの発現カセットを含む。ｐＭＯＮ９７９ＤＮＡ部分の残りは、ｐＭＯＮ８８６と全く同じである。
【０１２１】プラスミドｐＭＯＮ８８６は、ＤＮＡの下記部分から成る。第一は、細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ）をコードするトランスポゾンＴｎ７から単離される０．９３ｋｂＡｖａＩから操作された−ＥｃｏＲＶ断片であり、それはＥ．ｃｏｌｉ及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ中の選択のための決定基である。これは、形質転換された植物細胞を選択するキメラカナマイシン耐性をコードするＤＮＡの１．６１ｋｂ断片に連結される。キメラ遺伝子（Ｐ−３５Ｓ／ＫＡＮ／ＮＯＳ３′）は、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタイプＩＩ（ＫＡＮ）遺伝子及びノパリンシンターゼ遺伝子の３′−非翻訳化領域から成る（フレイリーら、１９８３）。次の部分は、ＲＫ２プラスミド由来の複製起源を含む０．７５ｋｂｏｒｉ Ｖである。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ中の維持のための複製起源を与え、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 細胞への抱合的転移のためのｂｏｍ部位を与えるｐＢＲ３２２の３．１ｋｂＳａｌＩからＰｖｕＩ部分（ｏｒｉ ３２２）に連結される。次の部分は、ノパリン型ＤＮＡ右端を担持するｐＴｉ３７由来の０．３６ｋｂＰｖｕＩからＢｃｌＩである（フレイリーら、１９８５）。
【０１２２】ｐＭＯＮ９８１プラスミドは、下記のＤＮＡ断片を含んでいる：細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性［Ｓｐｃ／Ｓｔｒ；Ｅ．ｃｏｌｉ及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ中の選択のための決定基（フリングら、１９８５）］をコードするトランスポゾンＴｎ７から単離された０．９３ｋｂの断片；０．３５ｋｂカリフラワーマザイクウィルス３５Ｓプロモーター（Ｐ−３５Ｓ）（オーデルら、１９８５）、０．８３ｋｂネオマイシンホスホトランスフェラーゼタイプＩＩ遺伝子（ＫＡＮ）及びノパリンシンターゼ遺伝子の０．２６ｋｂ３′−非翻訳化領域（ＮＯＳ３′）（フレイリーら、１９８３）を含む、形質転換された組織を選択するように植物発現のために操作されたキメラカナマイシン耐性遺伝子；ＲＫ２プラスミド由来の複製の０．７５ｋｂ起源（ｏｒｉ Ｖ）（スタルカーら、１９８１）；Ｅ．ｃｏｌｉ中の維持のための複製起源（ｏｒｉ−３２２）及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞中への抱合的転移のためのｂｏｍ部位を提供するｐＢＲ３２２の３．１ｋｂのＳａｌＩからＰｖｕＩ部分並びにノパリン型Ｔ−ＤＮＡ右端領域を含むｐＴｉ３７プラスミド由来の０．３６ｋｂのＰｖｕＩからＢｃｌＩ断片（フレイリーら、１９８５）。発現カセットは、ゴマノハグサモザイクウィルスの０．６ｋｂ３５Ｓプロモーター（Ｐ−ＦＭＶ）（ゴウダら、１９８９）及びマメｒｂｃＳ−Ｅ９遺伝子の０．７ｋｂ３′非翻訳化領域（Ｅ９３′）（コルッチラク、１９８４及びモレリら、１９８５）から成る。ＦＭＶ３５Ｓプロモーター（図１）を含む０．６ｋｂＳｓｐＩ断片を操作して、適当なクローニング部位を転写開始部位の下流に配置した。植物ベクターを、ＡＢＩＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株中に起動させた。ＡＢＩ株は、脱武装のＴｉプラスミドｐＴｉＣ５８を担持するＡ２０８Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ｐＭＰ９０ＲＫ）である（コンク及びシェル、１９８６）。Ｔｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ植物ホルモン遺伝子を担持せず、従って株はクラウンゴール病を発病することができない。植物ベクターのＡＢＩへの交配は、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を使用する三親抱合系により行った（ディッタら、１９８０）。植物組織をＡＢＩ：：植物ベクター抱合物とともにインキュベートしたら、そのベクターは、脱武装のｐＴｉプラスミドによりコードされるｖｉｒ機能により植物細胞へ転移される。ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ右端領域において開放し、全植物ベクター配列は、宿主植物染色体中に挿入されることができる。ｐＴｉＣ５８Ｔｉプラスミドは、植物細胞へ転移されないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中に残る。
【０１２３】植物再生グリホセート酸化還元酵素活性の適当な生成が形質転換された細胞（またはプロトプラスト）中で行われた場合は、細胞（またはプロトプラスト）は全植物体中に再生される。再生工程のための方法論の選択は臨界的ではなく、Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ（アルファルファ、ダイズ、クローバー等）、Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ（ニンジン、セロリー、アメリカボーフー）、Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ（キャベツ、ラディッシュ、脂肪種子等）、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ（メロン及びキュウリ）、 Ｇｒａｍｉｎｅａｅ（コムギ、コメ、コーン等）、Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ（ジャガイモ、タバコ、トマト、ペッパー）及びその他の花作物から選ばれる宿主に対して適当な手順を利用することができる。例えば、アミラート、１９８４；シマモト、１９８９；フロム、１９９０；バジル、１９９０参照。
【０１２４】下記の実施例は、本発明の実施をさらに詳しく説明するためのものであり、いかなる場合にも本発明の範囲を限定するものであると解釈してはならない。当業者は、本発明の精神及び範囲を逸脱しない限り、種々の変更、省略等を本明細書中に記載されている方法及び遺伝子に対して行い得ることを理解するであろう。
【０１２５】本発明の、配列番号：５のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が除去され若しくは１以上の他のアミノ酸により置換され又は配列番号：５のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列を有する変異体は、それをコードする遺伝子の位置特異的変異などにより得られるものであって、グリホセート酸化還元酵素活性を有するものである。
【０１２６】本発明のアレル変異体は、対立遺伝子座に変異を有する遺伝子によりコードされているアミノ酸配列を有し、グリホセート酸化還元酵素活性を有する蛋白質である。
【０１２７】
【実施例】形質転換された植物中のグリホセート酸化還元酵素の発現、活性及び発現型グリホセート酸化還元酵素の形質転換、発現及び活性並びに、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．「Ｓａｍｓｕｎ」及び／またはＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ ｃｖ．中に導入されるグリホセート酸化還元酵素遺伝子による植物へ与えられるグリホセート酸化還元酵素遺伝子。ベクターｐＭＯＮ１７０７３、ｐＭＯＮ１７０３２、ｐＭＯＮ１７０６５、ｐＭＯＮ１７０６６、ｐＭＯＮ１７１３８及びｐＭＯＮ１７１６４を使用するウェスターが下記の具体的実施例中に開示されている。Ｅｎ−ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのコントロールの下での操作されたグリホセート酸化還元酵素遺伝子（配列番号：６）の発現についてのタバコにおける最初のデータは（例えば表ＶＩＩＩ及びＩＸ中のｐＭＯＮ１７０７３上のデータ参照）、グリホセート酸化還元酵素の低レベルの発現を示している。この遺伝子の転写は３−４植物の場合、ノーザン及びＳ１分析で確認したが、グリホセート酸化還元酵素タンパク質を検出することはできなかった（アッセイが〜０．０１％表現レベルである検出限界）。０．４ｌｂ／ａｃｒｅ（約０．４４８ｋｇ／ｈａ）グリホセートにより噴霧した後のＲｏ植物の分析は、低い耐性レベルのみを示した。ＦＭＶプロモーターを使用した場合及びグリホセート酸化還元酵素遺伝子に対してＣＴＰ融合物を使用した場合と同様に、遺伝子配列の修飾（本明細書に記載のものと同じ）は、タバコの改良された発現を得る結果となった。これらの理由により、示されたデータの大部分は、これらの改良されたグリホセート酸化還元酵素構造物を含むベクターを使用して誘導されるトランスジェニック植物から得られる。修飾されたグリホセート酸化還元酵素ベクターｐＭＯＮ１７０３２を使用する１組の実験を実施例１に記載し、操作されたグリホセート酸化還元酵素、合成グリホセート酸化還元酵素及びＣＴＰ１−合成グリホセート酸化還元酵素の考察を実施例２に示す。キャノーラにおけるグリホセート酸化還元酵素の形質転換及び発現を実施例３に記載する。
【０１２８】実施例１タバコ葉ディスク形質転換方法は、約１月齢の健常な葉組織を使用する。１０％クロロックス及び表面活性剤による１５〜２０分間の表面滅菌の後、この葉を滅菌水中で３回すすいだ。滅菌紙パンチを使用して、葉ディスクに穴を開け、１日間の前培養のためにＭＳ１０４培地上にさかさまにして置いた（ＭＳ塩、４．３ｇ／ｌ、シュクロース３０ｇ／ｌ、Ｂ５ビタミン５００Ｘ２ｍｌ／ｌ、ＮＡＡ０．１ｍｇ／ｌ及びＢＡ１．０ｍｇ／ｌ）。そのディスクに、１／５に希釈された（即ち約０．６ＯＤ）対照ベクターを含む脱武装されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＢＩの一晩の培養物を植付けた。この植付けは、そのディスクを培養物とともに遠心分離管に入れることによって行った。３０〜６０秒後に、液体を排出し、このディスクを滅菌濾紙の間で吸収させた。その後このディスクをフィルターディスクとともにＭＳ１０４フィーダープレート上に逆さまにして置いて、共培養した。
【０１２９】共培養の２〜３日後に、このディスクを、逆さまのまま、ＭＳ１０４培地を有する選択プレートに移した。２〜３週間後、カルスが生成され、個々の塊が葉ディスクから分離した。若枝が茎から区別がつくように十分大きくなったときに、その若枝をカルスから清潔な状態で切断した。この若枝を選択により、ホルモン無しの根付け培地上（ＭＳＯ：ＭＳ塩４．３ｇ／ｌ、シュクロース３０ｇ／ｌ及びＢ５ビタミン５００Ｘ２ｍｌ）に置いた。根が１〜２週間内に形成された。滅菌状態のままで、いずれかの葉カルスアッセイを、根付いた若枝上で行うことが好ましい。根付いた若枝を土壌中に入れ、高湿度環境に保った（例えば、プラスチック容器または袋）。この若枝を環境湿度条件に徐々にさらしながら、強化した。
【０１３０】４５カナマイシン耐性ｐＭＯＮ１７０３２タバコ系の全体を調査した（表Ｖ）。
【０１３１】
【表９】

【０１３２】植物組織培養培地上の葉の再カルス形成は、少なくとも１１のこれらの系の低レベルのグリホセート耐性を示す（＋／−表現型で評価した）。少なくとも２４のこれらの系が、０．５〜２ｎｇ／抽出可能なタンパク質５０μｇの範囲でグリホセート酸化還元酵素の検出可能なレベルを発現した。葉再カルス形成アッセイにおいて示されたグリホセート耐性及び高いグリホセート酸化還元酵素発現レベルは、修飾されたグリホセート酸化還元酵素遺伝子を生成するために配列をコードするグリホセート酸化還元酵素に行われる変化（配列番号：７）が植物中で発現されるこの遺伝子の能力に著しい影響を与えることを示した。これと同じ効果は、その後強力な植物プロモーターを使用して、優れた３′ポリアデニル化シグナル配列を使用して、リボソーム充填及び翻訳開始のための開始コドンの回りの配列を最適化して操作されたグリホセート酸化還元酵素遺伝子（配列番号：６）を発現することにより、またはこれらの若しくはその他の発現、調節配列または因子の組合せにより達成されることができる。最も高いグリホセート酸化還元酵素発現レベルを有するものを含む、多数のこれらの系のＲ１子孫（＃１８８５４及び１８８４８）に、０．４及び１．０ｌｂ／ａｃｒｅの速度でグリホセートを噴霧し（各々、０．４４８及び１．１２ｋｇ／ｈａ）、成長に関する動作を４週間の間評価した（表ＶＩ）。
【０１３３】
【表１０】

【０１３４】特に、最も高いレベルのグリホセート酸化還元酵素を発現する植物についての初期の遅延の後、これらの系は、両噴霧速度における植物グリホセート耐性を示した（時間とともに改良された）。グリホセート酸化還元酵素酵素活性を２つのｐＭＯＮ１７０３２系（＃１８８５８及び１８８８１）について測定した。葉の組織（１ｇ）を採取し、液体Ｎ２中で凍結し、抽出前に−８０℃で保存した。抽出のために、葉組織を液体Ｎ２とともに乳鉢及び乳棒中により微粉砕した。粉砕化された葉組織に、１ｍｌの抽出緩衝液（１００ｍＭトリスＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭＤＮＡ、２０％グリセロール、３５ｍＭＭＫＣｌ、１ｍＭベンズアミジンＨＣｌ、５ｍＭＮａアスコルビン酸塩、５ｍＭジチオトレイトール及び１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、４℃）を添加し、試料をさらに１分間粉砕した。得られた混合物を５分間遠心分離し（高速、エッペンドルフ）、得られた上清を飽和硫酸アンモニウム溶液により処理して、７０％の最終飽和液を得た（２．３３ｍｌ飽和溶液／ｍｌ抽出）。沈殿されたタンパク質を上記のように遠心分離により集め、ペレットを抽出緩衝液０．４ｍｌ中に再懸濁した。再び遠心分離して、粒子状物質を除去した後、試料を１ｍｌのシリンジ中に含まれるセファデックスＧ５０を使用して脱塩し、ペネフスキー（１９７６）の方法により抽出緩衝液を使用して平衡に達した。脱塩された植物抽出を氷状に保存し、タンパク質濃度をブラドフォードの方法（１９７６）により測定した。グリホセート酸化還元酵素反応は、０ｍＭＭｇＣｌ２、０．０１ｍＭフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ、シグマ社）及び１ｍＭユビキノンＱ０（シグマ社）を含む０．１ＭＯＰＳ／０．０１トリシン緩衝液、ｐＨ７．４のアッセイ混合物中で、６０分間３０℃で２回行った。植物抽出物（７５μｌ）を前記アッセイ混合物中で２分間前インキュベーションし、イミノ二酢酸（ＩＤＡ、２０μｌ）基質を添加して最終濃度を５０ｍＭとすることにより反応を開始した（全アッセイ容積は０．２ｍｌであった）。反応体を急冷し、下記に記載の方法で誘導化した。ＩＤＡ及び植物抽出物を省略する対照反応をも実施した。グリオキシレート検出を、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）誘導化及び逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、クレシらの方法（１９８２）の変形例を使用して実施した。グリホセート酸化還元酵素反応体（０．２ｍｌ）を、ＤＮＰＨ試薬（０．５ＭＨＣｌ中の０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＮＰＨ（アルドリッチ））０．２５ｍｌとともに急冷し、５分間２５℃で誘導化させた。次いでこの試料を酢酸エチルにより抽出し（２×０．３ｍｌ）、合一した酢酸エチル抽出物を１０％Ｎａ２ＣＯ３相を酢酸エチル（０．２ｍｌ）により１度洗浄し、ウェイターズのＷＩＳＰＨＰＬＣ自動インジェクターを経由して、ウェイターズの９９０フォトダイオードアレイＵＶ／ＶＩＳＨＰＬＣ検出器を備えたＬＫＢＧＴｉ二元ＨＰＬＣシステムを使用するベックマンウルトラスフィアＣ１８ＩＰＨＰＬＣカラム（５μ、４．６ｍｍ×２５ｃｍ）上で、このＮａ２ＣＯ３相を注入した（１００μｌ）。イソクラチック可動相は、５ｍＭテトラブチルアンモニウムフォスフェート（ピエール）を含むメタノール−水−酢酸（６０：３８．５：１．５）であった。ＤＮＰＨ−グリオキシレートピーク（保持時間＝６．７分間）を３６５ｎｍで検出し、全く同じ方法で誘導されたグリオキシレート標準（シグマ社、０．２ｍｌ中２０μＭ）と比較した。
【０１３５】
【表１１】

【０１３６】実施例２一連の形質転換されたタバコ系を「イソジェニック」グリホセート酸化還元酵素べクターｐＭＯＮ１７０３２（操作されたグリホセート酸化還元酵素）（配列番号：６）、ｐＭＯＮ１７０６５（合成グリホセート酸化還元酵素）（配列番号：８）及びｐＭＯＮ１７０６６（ＣＴＰ１−合成グリホセート酸化還元酵素）を使用して誘導した。これらの多数の系のウェスタン分析（下記表ＶＩＩ参照）により、操作されたグリホセート酸化還元酵素植物は、５０μｇの植物タンパク質当り〜０．５ｎｇのグリホセート酸化還元酵素を発現し、合成グリホセート酸化還元酵素は、５０μｇ当り〜０．５から２ｎｇのレベルで発現し、ＣＴＰ１−合成グリホセート酸化還元酵素植物は５０μｇ当り〜２から２０ｎｇのレベルで発現することが判明した。
【０１３７】
【表１２】

【０１３８】操作された若しくは合成グリホセート酸化還元酵素またはＣＴＰ１−合成グリホセート酸化還元酵素を発現する多数の第一形質転換体Ｒｏ系を、０．４ｌｂ／ａｃｒｅのグリホセートを噴霧し（０．４４４８ｋｇ／ｈａ）、上記のように評価した。
【０１３９】
【表１３】

【０１４０】グリホセート酸化還元酵素による殺草剤の誘導体ＡＭＰＡ及びグリオキシレートへの代謝を経る、時間の経過により解消されるいくつかの即時性グリホセート速度が存在するので、合成グリホセート酸化還元酵素系は、修飾グリホセート酸化還元酵素について注目される反応と類似の反応を示した。グリホセートの標的（ＥＰＳＰシンターゼ）は、葉緑体内に存在しているので、グリホセート酸化還元酵素の活性は、それが葉緑体に達する前に殺草剤を除去することによって、この細胞小器官内のグリホセート濃度を減少しなければならない。ＣＴＰ１−合成グリホセート酸化還元酵素植物は、これらの植物は処理された割合では、即時性グリホセート効果を仮に示すとしても多くを示さないので、優れたグリホセート耐性を示した。一般的に、処理された耐性植物は、通常の成育、開花及び繁殖性をも示した。
【０１４１】ＣＴＰ１−合成グリホセート殺草剤植物は、その他のグリホセート酸化還元酵素構造物に対して示されるよりも著しく高レベルのグリホセート酸化還元酵素発現を示した。この増加したグリホセート酸化還元酵素レベルは、融合物の翻訳の促進または、葉緑体内のグリホセート酸化還元酵素の封鎖によるものであり、長いタンパク質半減期を与える。高濃度のグリホセート酸化還元酵素及び／またはその葉緑体中での存在により、葉緑体中のグリホセートの迅速な無毒化により高レベルのグリホセート耐性が与えられる。葉緑体中のグリホセート酸化還元酵素の存在は確認されている。グリホセート酸化還元酵素についてウェスタンの正であることが示されている４つの植物のそれぞれから得られた５つの葉（＃２２８４４、２２８５４、２２８８６、２２８８７）を、高速度で３×３秒間、０．９ＬＧＲ＋緩衝液（バートレットら、１９８２）中のウェアリングブレンダーにおいて均質化した。このホモジネートを４層のミラクロスを介して濾過し、ＧＳ−３ローター中で６０００ｒｐｍにおいて遠心分離した。得られたペレットをＧＲ＋緩衝液合計４ｍ中に再懸濁し、４０／８０％パーコール段階勾配の頂部上におき、９，５００ｒｐｍで１０分間回転させた。この完全な葉緑体（下方のバンド）をＧＲ−緩衝液（バートレットら、１９８２）により１回洗浄し、遠心分離した（６，０００ｒｐｍまで、破壊を伴う）。次いでこれらを５０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．７、３３０ｍＭソルビトール３００μｌ中に再懸濁し、超音波処理により氷上に溶解させた（小プローブ、３０％−３ミクロチップ設定×１０秒）。破片をペレット化し、上清を５０ｍＭ、ｐＨ７．５中のセファデックスＧ５０カラムを通過させた。可溶性タンパク質濃度は２．４ｍｇ／ｍｌであった。酵素アッセイを基質として５０ｍＭＩＤＡ及び５０ｍＭグリホセートの両者を使用して上記のように行ったが（３０分間アッセイ）、１ｍＭのユビキノンは添加しなかった。
【０１４２】
【表１４】

【０１４３】実施例３キャノーラの多数の形質転換された系は、ベクターｐＭＯＮ１７１３８（ＣＴＰ１−合成グリホセート酸化還元酵素）及びｐＭＯＮ１７１６４（ＣＴＰ２−合成グリホセート酸化還元酵素）を使用して、下記の方法で誘導されている。
【０１４４】植物材料Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｃｖ Ｗｅｓｔａｒの苗がメトロミックス３５０を含む２インチ（〜５ｃｍ）のポット中で活着した。これらは、２４℃の成育室内で、１６／８時間の光周期で、４００μＥｍ−２秒−１の光強度（ＨＩＤ灯）として成育させた。これらに、「Ｐｅｔｅｒｓ２０−１０−１０Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｓｐｅｃｉａｌ」の肥料を与えた。２１／２週間後に、これらを６インチ（〜１５ｃｍ）のポットに移し、成育室内で１５／１０℃の昼／夜温度において、１６／８時間の光周期、８００μＥｍ−２秒−１の光強度（ＨＩＤ灯）により成育させた。これらに、「Ｐｅｔｅｒｓ１５−３０−１５Ｈｉ−Ｐｈｏｓ Ｓｐｅｃｉａｌ」の肥料を与えた。
【０１４５】形質転換／選択／再生薹立ち前または薹立ち中であって開花前に、植物から得られた４つの末端の節間を取除き、７０％ｖ／ｖエタノール中で１分間、２％ｗ／ｖ次亜鉛素酸ナトリウムで２０分間表面滅菌し、滅菌脱イオン水で３回すすいだ。付着した葉を有する茎を、滅菌前に湿潤プラスチックバッグ中に〜７２時間冷蔵することができた。６〜７の茎部分を基底末端の方向を維持して、Ｒｅｄｃｏ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｓｌｉｃｅｒ２００により５ｍｍのディスクに切断した。
【０１４６】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２４ｍｇ／ｌクロラムフェニコール及び１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含むルリアブロス２ｍｌｓ中で、２４℃において回転装置を用いて一晩成育させた。１：１０希釈を、約９×１０８細胞／ｍｌを与えるＭＳ（ムラシゲ及びスクーグ）培地中で行った。これを６６０ｍｕにおける光学濃度の示度により確認した。この茎ディスク（外植体）に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ １．０ｍｌを植え付け、過剰部分をその外植体から吸引除去した。
【０１４７】この外植体を、１／１０Ｘ標準ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％シュクロース、０．８％寒天、ｐＨ５．７、１．０ｍｇ／ｌ６−ベンジルアデニン（ＢＡ）を含むペトリプレート中に基底側部を下にして置いた。このプレートに、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％シュクロース、ｐＨ５．７、４．０ｍｇ／ｌｐ−クロロフェノキシ酢酸、０．００５ｍｇ／ｌキネチンを含む培地１．５ｍを層状に積み重ね、滅菌濾紙でカバーした。
【０１４８】２〜３日の共培養の後、この外植体を、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％シュクロース、０．８％寒天、ｐＨ５．７、１ｍｇ／ｌＢＡ、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌセフォタキシム、選択により２００ｍｇ／ｌカナマイシンまたは１７５ｍｇ／ｌゲンタマイシンを含む深皿ペトリプレートに移した。７つの外植体を各プレート上に置いた。３週間後に、１のプレート当り５つの外植体として、新鮮な培地へ移した。外植体を連続的光を与えながら（青白色）、成育室内で２５℃において培養した。
【０１４９】発現アッセイ３週間後、若枝を外植体から摘み取った。葉再カルス形成アッセイを開始してＲｏ若枝の修飾を確認した。葉組織の３つの小片を、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％シュクロース、０．８％寒天、ｐＨ５．７、５．０ｍｇ／ｌＢＡ、０．５ｍｇ／ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌセフォタキシム及び２００ｍｇ／ｌカナマイシン若しくはゲンタマイシンまたは０．５ｍＭグリホセートを含む再カルス形成培地上に置いた。この葉アッセイを外植体の培養と同じ条件下で成育室中でインキュベートした。３週間後に、葉カルス形成アッセイを、殺草剤耐性（カルスまたは緑葉組織）または感受性（漂白）の評価を行った。
【０１５０】移植摘み取りの時に、若枝の茎をＲｏｏｔｏｎｅＲに浸し、メトロ−ミックス３５０を含む２インチ（〜５ｃｍ）のポット中に置き、さらに閉鎖された湿潤性の環境のもとに置いた。これらを、２４℃の成育室内に置き、１６／８時間の光周期で４００μＥｍ−１秒−２（ＨＩＤ灯）を使用して、約３週間の間徐々に強化した。ＲＯ植物から採取した種は、Ｒ１植物を生じさせるＲ１種子である。ＲＯ植物のグリホセート耐性を評価するために、この子孫を評価した。ＲＯ植物は各挿入位置においてヘミ接合であると考えられるので、自家受粉すると、Ｒ１における最大の遺伝子型分離が得られる。各挿入物は結合の不在下で、優勢な対立遺伝子であり、ただ１つのヘミ接合の挿入物が耐性表現に要求されるので、１の挿入物は、３：１、２の挿入物、１５：１、３つの挿入物６３：１等に分離する。従って、比較的少ないＲ１植物で、成長して少なくとも１の耐性発現型が得られる。ＲＯ植物由来の種子を採取し、脱穀し、次いでグリホセート噴霧試験において植える前に乾燥させた。種々の技術を使用して、Ｒ１噴霧評価のためにその植物を成育させている。試験は、グリーンハウス及び成育室の両方において行う。２つの植付けシステムを使用する；３２または３６の細胞を含む〜１０ｃｍのポットまたは植物皿。植付けのために使用される土壌は、メトロ３５０及び３タイプの徐放性肥料供給器または植物メトロ３５０である。潅水は、グリーンハウスの頭上かまたは成育室の地下潅水である。キャノーラにとって適当な温度管理を維持した。１６時間の光周期を維持した。開花が始まったら、植物を種子生成のために〜１５ｃｍのポットに移植する。
【０１５１】噴霧「バッチ」は、同じ日に全て噴霧された数組のＲ１の子孫からなる。いくつかのバッチは、Ｒ１植物以外の評価を含む。各バッチはまた、推定的に形質転換された特定のバッチにおいて遺伝子型を示す噴霧された及び未噴霧の非トランスジェニック遺伝子型を含んでいる。また、バッチ中には、いくらかの耐性を有するものとして以前に同定された１またはそれ以上の非分離形質転換された遺伝子型が含まれている。
【０１５２】各Ｒｏ子孫に由来する２６の植物は、噴霧されておらず、グリホセート耐性を比較し測定し、またグリホセートによっては誘導されないいずれかの変異性を評価するための対照として奉仕する。通常、植付けから１０〜２０日でその他の植物が２〜４の葉段階に達した時に、グリホセートを、研究の目的に応じて０．２８〜１．１２ｋｇ／ｈａの割合で適用する。低容量を使用する少量散布技術が採用されている。実験室トラック噴霧器は、畑における条件と等しい割合を散布するように計算されている。０〜１０の指標を使用して、植物耐性について噴霧された植物を評価する。この指標は、同じＲｏ植物に由来の未噴霧植物との比較である。０は死であり、１０は未噴霧の植物と可視的な相違がない場合を示す。０〜１０の間の数字が高いほど、未噴霧の植物と比較して損害が少ないことが示される。処理の後（ＤＡＴ）７、１４及び２８日後又は、薹立ちまで、植物を評価し、１つの系にＲｏ植物属内の未噴霧の植物に対する平均指標が与えられる。
【０１５３】６の整数を使用して、グリホセートから受ける再生の損害の程度を質的に記述する。
【０１５４】
０：花のつぼみが発育しない２：花のつぼみは存在するが開花前に発育不全となる４：花は開花するが葯がない、または葯が花粉を押し出すことができない６：実のならない葯８：部分的に実のならない葯１０：完全に繁殖した花花構造の発育の程度に応じて、開花の開始時または少し後に、この指標を使用して植物を評価した。
【０１５５】下記表Ｘ及びＸＩは、ｐＭＯＮ１７１３８（０．５６ｋｇ／ｈａの割合で噴霧された）及びｐＭＯＮ１７１６４（０．８４ｋｇ／ｈａの割合で噴霧された）のそれぞれにより形質転換されたキャノーラ植物の生長及び再生の評価を表にしたものである。下記に示す結果は、植物内でのグリホセート酸化還元酵素遺伝子の発現の結果としてキャノーラ植物に付与されたグリホセート耐性を表わす。
【０１５６】
【表１５】

【０１５７】
【表１６】

【０１５８】実施例４グリホセート酸化還元酵素遺伝子は、ダイズ中に導入され表現されており、それらの植物にグリホセート耐性を付与している。（上記の）ＣＴＰ−２合成グリホセート酸化還元酵素融合遺伝子を、ＦＭＶプロモーターの制御の下で、ベクターｐＭＯＮ１７１５９中のＮＯＳ３′配列とともに、ダイズ中に導入したが、その地図を図１０に示す。このベクターはグリホセート酸化還元酵素遺伝子配列の他に下記の要素からなる；複製のｐＵＣ起源、Ｅ３５Ｓプロモーターの制御の下でＥ９３′配列を有するＮＰＴＩＩ細菌選択可能な標識遺伝子（カナマイシン）及びβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ；ジェファーソンら、１９８６）。後者の遺伝子は、形質転換された植物材料の同定を促進する計測可能な標識を提供する。
【０１５９】ダイズ植物は、クリストーら（１９８８）により記載された粒子噴霧技術を使用する微小射影注入方法を使用してｐＭＯＮ１７１５９により形質転換される。Ｒｏ 植物から収穫された種子は、Ｒ１植物を生じさせるＲ１種子である。Ｒｏ植物のグリホセート耐性を評価するために、その子孫を評価した。Ｒｏ植物は、各挿入位置においてヘミ接合であると推定されるので、自家受粉によりＲ１内で最大遺伝子型分離が起こる。各挿入物は、結合不在の下で、優勢な対立遺伝子として作用し、唯一のヘミ接合挿入物が耐性発現に必要とされると考えられるので、１の挿入物が３：１、２の挿入物、１５：１、３つの挿入物６３：１等に分離する。従って、比較的少ないＲ１植物で成育して少なくとも１つの耐性発現型が表われる。
【０１６０】Ｒｏダイズ植物由来の種子を収穫し、グリホセート噴霧試験において植えられる前に乾燥させる。種子をメトロ３５０を含む４インチ（〜５ｃｍ）の四角形のポットに植える。各Ｒｏ植物に由来する２０の苗木が試験に対して適当であると考えられる。植物をグリーンハウス環境中に保持し成育させる。１２．５〜１４時間の光周期及び日中３０℃及び夜間２４℃の温度を調節する。水溶性のＰｅｔｅｒｓ Ｐｅｔｅ Ｌｉｔｅ肥料を必要に応じて与える。噴霧「バッチ」は、全て同じ日に噴霧された数組のＲ１子孫である。いくつかのバッチはＲ１植物以外の評価を有することができる。各バッチは、推定的に形質転換された特定のバッチ中で遺伝子型を表わす噴霧された及び未噴霧の非トランスジェニック遺伝子型も含む。バッチ中にはまた、いくらかの耐性を有していると以前に同定された１またはそれ以上の非分離の形質転換された遺伝子型が含まれる。
【０１６１】各Ｒｏ子孫に由来の１〜２の植物は噴霧されず、グリホセート耐性を比較し測定し、またグリホセートにより導入されないいずれかの変異性を評価する対照として作用する。通常植え付けから２〜３週間で、その他の植物が第一の三出葉の段階に達したときに、グリホセートを、ＲｏｕｎｄｕｐＲ１２８ｏｚ．／ａｃｒｅ（８．８９５ｋｇ／ｈａ）に等しい速度で与える。実験室トラック噴霧器を換算してこのような条件と等しい割合で射出する。
【０１６２】０〜１０の成育評価を使用する。この評価は、同じＲｏ植物由来の未噴霧子孫に対するものである。０は死であり、１０は未噴霧の植物と比べて可視的な相違がないことを示す。０〜１０の間で数値が高い程、未噴霧の植物と比べて損害が少ないことを示す。植物は処理（ＤＡＴ）後の７、１４及び２８日目に評価した。
【０１６３】
【表１７】

【０１６４】実施例５グリホセート酸化還元酵素遺伝子は、カルス中に検出されるタンパク質の発現を伴ってブラックスウィートコーン（Ｂｌａｃｋ Ｍｅｘｉｃａｎ Ｓｗｅｅｔ）（ＢＭＳ）コーン細胞中に導入されている。プラスミドｐＭＯＮ１９６３２を使用して、グリホセート酸化還元酵素遺伝子をコーン細胞中に導入した。このプラスミドの基幹は、〜９０から〜３００領域の重複（ケイら、１９８７）、トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の第一イントロンを含む０．５８Ｋｂの断片（カリスら、１９８７）及びノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子由来の３′末端配列（フレイリーら、１９８３）を含む０．６Ｋｂカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５ＳＲＮＡプロモーター（Ｅ３５Ｓ）を、ｐＵＣ１１９中に挿入することにより構成される（ヤニッシュら、１９８５）。ｐＭＯＮ１９６３２は、合成グリホセート酸化還元酵素コード配列（配列番号：８）に融合されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＳＳＵＣＴＰを含むｐＭＯＮ１７０６４に由来の１．７ＫｂＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＩＲ断片を挿入することにより形成された。プラスミドｐＭＯＮ１９６３２を、トウモロコシアセトラクテートシンターゼ遺伝子のスルホニルウレア耐性形態を含むプラスミド、ＥＣ９との共衝撃により、ＢＭＳコーン細胞中に導入した。各プラスミド２．５μｇをタングステン粒子上にコーティングし、実質的にはクラインらにより記載された（１９８９）方法と同様にして、ＰＤＳ−１０００粒子射出を使用して、対数増殖期のＢＭＳ細胞中に導入した。形質転換体は、２０ｐｐｂクロロスルフロンを含むＭＳ培地上で選択された。クロロスルフロン上の初期の選択の後、カリをグリホセート酸化還元酵素ウェスタンブロットによりアッセイした。
【０１６５】ＢＭＳ細胞（３ｇ湿潤重量）を真空下で濾紙（ワッットマン＃１）上で乾燥させ、再び秤量し、抽出緩衝液（５００μｇ／ｇ乾燥重量；１００ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール）を添加した。組織を２．８電力設定されたフィートンオーバーヘッド撹拌器により３０秒間均質化した。遠心分離（３分間、エッペンドルフマイクロフュージュ）の後、上清を除去し、タンパク質を定量した（バイオラッド、タンパク質アッセイ）。試料（５０μｇ／ウェル）をグリホセート酸化還元酵素標準（１０ｎｇ）とともにＳＤＳＰＡＧＥゲル（ジュール、３〜１７％）上に充填し、電気泳動に付し、先に記載された方法（パドジェット、１９８７）と類似の方法によりニトロセルロースへ移した。ニトロセルロースブロットをヤギ抗グリホセート酸化還元酵素ＩｇＧによりプローブし、Ｉ−１２５タンパク質Ｇを使用して展開した。放射性ブロットを放射能写真で可視化した。結果をＬＤＢＵｌｔｒａＳｃａｎ ＸＬレーザー濃度計を使用する光濃度により定量し、下記表ＸＩＩＩにまとめて示す。
【０１６６】
【表１８】

【０１６７】ＸＩＩＩは、グリホセート酸化還元酵素がコーンのような単子葉植物で発現され検出されることを明らかにしている。
【０１６８】実施例６グリホセート酸化還元酵素遺伝子を、グリホセートを含む培地の直接上での植物形質転換のための選択可能な標識として使用することができる。形質転換された植物材料を選択し同定する能力は、ほとんどの場合、普通に阻害可能な基質の存在下で形質転換された組織の優先的で連続的な成育を可能にする優勢な選択可能な標識遺伝子に応じて決定される。抗生物質耐性及び殺草剤耐性遺伝子は、相当する抗生物質または殺草剤の存在下におけるそのような優勢の選択可能な標識遺伝子としてほとんど独占的に使用されている。多分、ｎｐｔＩＩ／カナマイシン選択組織がもっとも頻繁に使用されている。グリホセート酸化還元酵素は、形質転換された植物の生成及び同定のための有効あるいは優れた選択可能な標識／選択組織として示されている。
【０１６９】この計画中で使用されることができる植物形質転換ベクターは、ｐＭＯＮ１７２２６（図１１）である。このプラスミドは、以下に説明するその他の多くのプラスミドに似ており、このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ中で複製させＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中に導入し複製させることを可能にする以前に記載された細菌複製系及び細菌選択可能な標識遺伝子（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ）から実質的に構成され、Ｔ−ＤＮＡの右端及び左端の間には、ＦＭＶプロモーター−Ｅ９３′カセット中のＣＴＰ１−グリホセート酸化還元酵素合成遺伝子が存在する。このプラスミドは、発現カセットの両端の間及び外側に存在する多数の制限酵素のための単一の部位も有している。これは、植物への導入のためのベクターにその他の遺伝子及び遺伝子要素を添加することを容易にする。
【０１７０】グリホセート上の形質転換された植物の直接の選択のための手順をタバコについて簡単に説明する。実施例１において説明した標準方法により前培養のために外植体を調製する：１月齢のタバコ植物から得た葉の表面滅菌（１０％クロロックス＋表面活性剤中に１５分間；３ＸｄＨ２Ｃ洗浄）；均一な組織型を作るために、葉の縁、中央脈、先端及び葉柄端部を除去して、外植体を０．５×０．５ｃｍの四角形に切断する；外植体をＭＳ１０４プレート＋２ｍｌ４ＣＯＯ５Ｋ培地上に単一層で裏返しにして置き、表面を湿らせる；１〜２日の前培養。４ＣＯＯ５Ｋ培地により１．２Ｘ１０９細菌／ｍｌの力価に調整された植物形質転換プラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの一晩の培養物を使用して、外植体に植付けた。外植体を遠心分離管に入れ、得られたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ上清を添加し、細菌と外植体の混合物を２５秒間最大に設定して「渦巻き運動」に付して細菌の浸透を均一にした。細菌を排出し、外植体を乾燥滅菌濾紙の層間に水分を吸収させて過剰の細菌を除去した。水分を吸取られた外植体を、ＭＳ１０４プレート＋２ｍｌ４ＣＯＯ５Ｋ培地＋フィルダーディスク上に裏返しにして置く。２〜３日間共培養する。この外植体をＭＳ１０４＋カルベニシリン１０００ｍｌ＋セフォタキシム１００ｍｇ／ｌに３日間移した（遅延した期）。この外植体を次いで、選択期のためにＭＳ１０４＋グリホセート０．０５ｍＭ＋カルベニシリン１０００ｍｇ／ｌ＋セフォタキシム１００ｍｇ／ｌへ移した。４〜６週間で若枝をカルスから切断し、ＭＳＯ＋カルベニシリン５００ｍｇ／ｌ根付け培地上に置いた。根が３〜５日で形成され、その時に葉片を根付いたプレートから切断して、グリホセート耐性と物質が形質転換されたことを確認することができる。
【０１７１】これらの形質転換された組織中のグリホセート酸化還元酵素タンパク質の存在は、葉ディスクの免疫ブロット分析により確認されている。ｐＭＯＮ１７２２６による１の実験から得られたデータを下記に湿す：Ａｇｒｏ