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【発明の名称】 グリホセート耐性５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ
【発明者】 【氏名】ジェラード フランシス バリー

【氏名】ガネシュ マーシィ キショアー

【氏名】スチーブン ロジャーズ パジェット
【要約】 【課題】クラスＩＩのＥＰＳＰＳ酵素をコードする遺伝子を開示する。

【解決手段】該遺伝子は、除草剤グリホセートに耐性の形質転換微生物及び植物を創出する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 下記工程：ａ）
ｉ）植物細胞中でＲＮＡ配列を生じさせるように機能するプロモーター、ｉｉ）アミノ末端葉緑体トランジットペプチド及び配列番号：３、配列番号：５若しくは配列番号：７のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素であるか、或いは配列番号：３、配列番号：５若しくは配列番号：７のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が除去されているか、又は１以上の他のアミノ酸により置換されているか、又は配列番号：３、配列番号：５若しくは配列番号：７のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列に１以上のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列を有するアレル又は他の変異体である酵素であって、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）のＫｍが１〜１５０μＭでありＫｉ（グリホセート）／Ｋｍ（ＰＥＰ）比が３〜５００であるクラスＩＩのＥＰＳＰＳ酵素を含む融合ポリペプチドをコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列及びｉｉｉ）前記ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニルヌクレオチドのストレッチを付加させるように植物細胞中で機能する３′非翻訳領域を含み、ただし、前記プロモーターは構造ＤＮＡ配列に関して異種であり、融合ポリペプチドを十分に発現させて前記遺伝子により形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を高めるために用いられるものである組換え二本鎖ＤＮＡ分子を、植物細胞のゲノム中に挿入し；
ｂ）形質転換された植物細胞を得て；次いで、ｃ）前記形質転換された植物細胞から、グリホセート殺草剤に対する耐性が増加した遺伝学的に形質転換された植物を再生するを含む、グリホセート殺草剤に対して耐性である遺伝学的に形質転換された単子葉植物の生産方法。
【請求項２】 前記酵素が、配列番号：３のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】 前記クラスＩＩのＥＰＳＰＳ酵素をコードする構造ＤＮＡ配列が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６及び配列番号：９からなる群から選択される請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項４】 前記構造ＤＮＡ配列が、クラスＩＩの５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼのアミノ酸配列の第２位においてセリン、アラニン又はロイシンをコードすることを特徴とする請求の範囲第１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】 前記構造ＤＮＡ配列が、配列番号：１０に示されている葉緑体トランジットペプチドと配列番号：９に示されているＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡからなる請求の範囲第１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】 前記プロモーターが、植物ＤＮＡウィルスプロモーターである請求の範囲第１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】 前記プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターからなる群から選択される請求の範囲第６項に記載の方法。
【請求項８】 前記３’非翻訳領域がノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子由来である請求の範囲第１乃至７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】 配列中に：ａ）植物細胞中においてＲＮＡ配列を生じさせるように機能するプロモーター；
ｂ）配列番号：３、配列番号：５若しくは配列番号：７のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素であるか、或いは配列番号：３、配列番号：５若しくは配列番号：７のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が除去されているか、又は１以上の他のアミノ酸により置換されているか、又は配列番号：３、配列番号：５若しくは配列番号：７のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列に１以上のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列を有するアレル又は他の変異体である酵素であって、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）のＫｍが１〜１５０μＭでありＫｉ（グリホセート）／Ｋｍ（ＰＥＰ）比が３〜５００であるクラスＩＩのＥＰＳＰＳ酵素をコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列；及びｃ）前記ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニルヌクレオチドのストレッチを付加させるように植物細胞中で機能する３′の非翻訳領域を含み；ただし、前記プロモーターは前記構造ＤＮＡ配列に関して異種であり、前記構造ＤＮＡ配列は、アミノ末端葉緑体トランジットペプチド及びクラスＩＩのＥＰＳＰＳ酵素を含む融合ポリペプチドをコードするものである、組換え二本鎖ＤＮＡを含むグリホセート耐性単子葉植物細胞。
【請求項１０】 前記酵素が、配列番号：３のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列を有する請求の範囲第９項に記載の単子葉植物細胞。
【請求項１１】 前記構造ＤＮＡ配列が、クラスＩＩの５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼのアミノ酸配列の第２位においてセリン、アラニン又はロイシンをコードすることを特徴とする請求の範囲第９又は１０項に記載の単子葉植物細胞。
【請求項１２】 前記プロモーターが、植物ＤＮＡウィルスプロモーターである請求の範囲第９乃至１１のいずれか一項に記載のグリホセート耐性単子葉植物細胞。
【請求項１３】 前記プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターからなる群から選択される請求の範囲第１２項に記載のグリホセート耐性単子葉植物細胞。
【請求項１４】 コーン、小麦及び米からなる群から選択される請求の範囲第９乃至１３のいずれか一項に記載のグリホセート耐性単子葉植物細胞。
【請求項１５】 請求の範囲第９項に記載の植物細胞を含むグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項１６】 前記酵素が、配列番号：３のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列を有する請求の範囲第１５項に記載の単子葉植物。
【請求項１７】 前記構造ＤＮＡ配列が、クラスＩＩの５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼのアミノ酸配列の第２位においてセリン、アラニン又はロイシンをコードすることを特徴とする請求の範囲第１５又は１６項に記載の単子葉植物。
【請求項１８】 前記構造ＤＮＡ配列が、配列番号：１０に示されている葉緑体トランジットペプチドと配列番号：９に示されているＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡからなる請求の範囲第１５又は１６項記載のグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項１９】 プロモーターが、植物ＤＮＡウィルスプロモーターである請求の範囲第１５乃至１８のいずれか一項に記載のグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項２０】 前記プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターからなる群から選択される請求の範囲第１９項に記載のグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項２１】 ３′非翻訳領域がノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子由来である請求の範囲第１５乃至２０のいずれか一項に記載のグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項２２】 コーン、小麦及び米からなる群から選択される請求の範囲第１５乃至２１のいずれか一項に記載のグリホセート耐性単子葉植物。
【請求項２３】 下記工程：ａ）組換え二本鎖ＤＮＡ分子が作物種子または植物中に挿入された結果としてグリホセート耐性を有する単子葉作物種子または植物を植え、前記ＤＮＡ分子は、ｉ）植物細胞中でＲＮＡ配列を生じさせるように機能するプロモーター、ｉｉ）アミノ末端葉緑体トランジットペプチド及び配列番号：３、配列番号：５若しくは配列番号：７のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素であるか、或いは配列番号：３、配列番号：５若しくは配列番号：７のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が除去されているか、又は１以上の他のアミノ酸により置換されているか、又は配列番号：３、配列番号：５若しくは配列番号：７のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列に１以上のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列を有するアレル又は他の変異体である酵素であって、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）のＫｍが１〜１５０μＭでありＫｉ（グリホセート）／Ｋｍ（ＰＥＰ）比が３〜５００であるクラスＩＩのＥＰＳＰＳ酵素を含む融合ポリペプチドをコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列、ｉｉｉ）前記ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニルヌクレオチドのストレッチを付加させるように植物細胞中で機能する３′非翻訳領域を有し、ただし、前記プロモーターは構造ＤＮＡ配列に関して異種であり、前記融合ポリペプチドを十分に発現させて、前記遺伝子により形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を高めるために使用され；
ｂ）圃場の前記作物及び雑草に十分量のグリホセート殺草剤を与えて、前記作物には著しい影響を与えずに雑草を制御する；を含む、植えられた作物種子を有する作物又は植物を含む圃場において雑草を選択的に制御する方法。
【請求項２４】 前記酵素が、配列番号：３のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列を有する請求の範囲第２３項に記載の方法。
【請求項２５】 前記クラスＩＩのＥＰＳＰＳ酵素をコードする構造ＤＮＡ配列が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６及び配列番号：９からなる群から選択される請求の範囲第２３項に記載の方法。
【請求項２６】 前記構造ＤＮＡ配列が、クラスＩＩの５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼのアミノ酸配列の第２位においてセリン、アラニン又はロイシンをコードすることを特徴とする請求の範囲第２３乃至２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】 前記構造ＤＮＡ配列が、配列番号：１０に示されている葉緑体トランジットペプチドと配列番号：９に示されているＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡからなる請求の範囲第２３乃至２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】 前記プロモーターが、植物ＤＮＡウィルスプロモーターである請求の範囲第２３乃至２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】 前記プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターからなる群から選択される請求の範囲第２８項に記載の方法。
【請求項３０】 ３′非翻訳領域がノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子由来である請求の範囲第２３乃至２９のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】 作物植物がコーン、小麦及び米からなる群から選択される請求の範囲第２３乃至３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】 組換え構造ＤＮＡ分子であって、配列中に：ａ）植物細胞中においてＲＮＡ配列を生じさせるように機能するプロモーター；
ｂ）配列番号：３、配列番号：５若しくは配列番号：７のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素であるか、或いは配列番号：３、配列番号：５若しくは配列番号：７のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が除去されているか、又は１以上の他のアミノ酸により置換されているか、又は配列番号：３、配列番号：５若しくは配列番号：７のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列に１以上のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列を有するアレル又は他の変異体である酵素であって、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）のＫｍが１〜１５０μＭでありＫｉ（グリホセート）／Ｋｍ（ＰＥＰ）比が３〜５００であるクラスＩＩのＥＰＳＰＳ酵素をコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列；及びｃ）前記ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニルヌクレオチドのストレッチを付加させるように植物細胞中で機能する３′の非翻訳領域を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子であり、ただし、前記プロモーターは前記構造ＤＮＡ配列に関して異種であり、前記ポリペプチドを十分に発現させて前記ＤＮＡ分子により形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を高めるために用いられることを特徴とする前記ＤＮＡ分子を植物細胞に導入し；グリホセートを含む植物生育培地上に該植物細胞を置き；グリホセートを含む培地上での発育を示す植物細胞を選択することを含む形質転換された単子葉植物組織の選択方法。
【請求項３３】 前記酵素が、配列番号：３のアミノ酸配列又は配列番号：９によりコードされるアミノ酸配列を有する請求の範囲第３２項に記載の方法。
【請求項３４】 前記構造ＤＮＡ配列が、クラスＩＩの５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼのアミノ酸配列の第２位においてセリン、アラニン又はロイシンをコードすることを特徴とする請求の範囲第３２項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】【０００１】本出願は、１９９０年８月３１日に出願された「グリホセート耐性５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ」という発明の名称の出願番号０７／５７６，５３７号を有する係属中の米国特許出願の部分継続出願である。
【０００２】本発明の背景本発明は、一般的には植物の分子生物学に関し、より詳しくは、新規のグリホセート耐性５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ系に関する。遺伝子工学における最近の進歩は、植物を形質転換して外来遺伝子を含ませるために必須の手段を提供している。農地経済学的に重要な独特の特徴を有する植物を生産することは今や可能である。確かに、１のこのような効果的な特徴は、殺草剤耐性による、よりコスト的に有効で、環境と共存可能な雑草制御である。殺草剤耐性植物は、耕地に対して雑草を制御する必要性を減少させることができ、それにより土壌腐食を効果的に減少することができる。
【０００３】この点について多くの研究の対象となっている１の殺草剤は、通常グリホセートと称されるＮ−ホスホノメチルグリシンである。グリホセートは、アミノ酸、植物ホルモン及びビタミンを含む芳香族化合物の生合成をもたらすシキミ酸経路を阻害する。特に、グリホセートは、酵素５−エノールピルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（以下、「ＥＰＳＰシンターゼ」または「ＥＰＳＰＳ」と称する）を阻害することによって、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及び３−ホスホシキミ酸の５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸への転化を抑制する。
【０００４】グリホセート耐性植物は、細胞の葉緑体中に高レベルのＥＰＳＰシンターゼを生成する能力を植物のゲノム中に挿入することによって生成されることができ（シャーら、１９８６）、前記酵素はグリホセート耐性であることが好ましい（キショーら、１９８８）ことは知られている。ＥＰＳＰＳアミノ酸コード配列中の変性の結果グリホセート耐性となった野性型のＥＰＳＰＳ酵素の変異体が、単離されている（キショー及びシャー、１９８８；シュルツら、１９８４；ソストら、１９８４；キショーら、１９８６）。これらの変異体は典型的には、グリホセート耐性表現型を与える野性型ＥＰＳＰＳ酵素よりも、グリホセートについてのＫｉ が高いが、これらの変異体は、酵素の反応動力学的な効率を低くするＰＥＰについての高いＫｍによっても特徴付けられる（キショー及びシャー、１９８８；ソストら、１９８４；シュルツら、１９８４；キショーら、１９８６；ソスト及びアムルハイン、１９９０）。例えば、ＰＥＰについての見かけのＫｍ及びＥ．ｃｏｌｉ由来の天然ＥＰＳＰＳのグリホセートの見かけのＫｉは、１０μＭ及び０．５μＭであり、一方、位置９６におけるグリシンをアラニンに置換した単一アミノ酸置換を有するグリホセート耐性単離物については、これらの値は、それぞれ２２０μ及び４．０ｍＭである。ＥＰＳＰＳ遺伝子変異体の多数のグリホセート耐性植物が変異により構築されている。さらに、グリホセート耐性ＥＰＳＰＳは、ＰＥＰのＫｍ の増加及び天然植物酵素のＶｍａｘのわずかな減少によって損われ（キショー及びシャー、１９８８）、それによって酵素の触媒効率（Ｖｍａｘ／Ｋｍ）が低下する。変異体の反応動力学的定数はＰＥＰに関して損われるので、変異体酵素の高度の過剰生産、４０〜８０倍が、グリホセートの存在下での植物中の通常の触媒活性を維持するために要求され得ることが提案されている（キショーら、１９８８）。
【０００５】このような変異体ＥＰＳＰシンターゼがグリホセートに対して耐性のトランスジェニック植物を得るために有用であることが証明されている一方で、高度にグリホセート耐性であり、かつ反応動力学的に有効でありながら、そのために植物中の通常の触媒活性を維持するために生産されることが要求されるグリホセート耐性、ＥＰＳＰＳの量が減少されまたは改良された耐性が同じ発現レベルで得られるようなＥＰＳＰシンターゼを得ることが、ますます有益になってきた。
【０００６】従来の研究は、異なる起源に由来するＥＰＳＰＳ酵素がグリホセートによる阻害に対する感受性の程度に関して広範囲に変化することを示している。グリホセート濃度の関数としての植物及び細菌ＥＰＳＰＳ酵素活性の研究は、グリホセートに対する感受性の程度が非常に広範囲であることを示した。感受性の程度は、試験されたいずれの属または種とは相関関係がないことを示した（シュルツら、１９８５）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＰＧ２９８２由来のＥＰＳＰＳ活性のグリホセート阻害に対する非感受性は報じられているが、その研究の詳細は報じられていない（フィッツギボン、１９８８）。一般的に、それらの天然の耐性は報じられているが、天然発生の細菌グリホセート耐性ＥＰＳＰＳ酵素の、変異されたＥＰＳＰＳ酵素に対する速度論的な優位性を示唆する報告はなく、いずれの遺伝子も特定されていない。同様に、グリホセート耐性を与える植物中の天然のグリホセート耐性ＥＰＳＰＳ酵素の発現についての報告はない。
【０００７】本発明の概要反応動力学的に有効なグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼをコードするＤＮＡからなるＤＮＡ分子が提供される。本発明のＥＰＳＰシンターゼは、グリホセート耐性を与えながら、触媒活性を維持する酵素に必要なトランスジェニック植物中のＥＰＳＰＳ酵素の過剰生産量を減少させる。本明細書中に開示されている上記の及びその他のＥＰＳＰシンターゼは、新規のＥＰＳＰＳ酵素系（以下「クラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素」と称する）を代表する。クラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素は、知られた細菌または植物ＥＰＳＰＳ酵素とはほとんど相同関係を持たず、適当なＫｍ（ＰＥＰ）範囲を維持しながらグリホセートに対する耐性を示す。本発明の酵素のＥＰＳＰＳのＫｍ（ＰＥＰ）の適当な範囲は、１〜１５０μＭであり、１〜３５μＭの範囲がより好ましく、２〜２５μＭの範囲が特に好ましい。反応動力学定数は、以下に特定するアッセイ条件下で測定される。酵素のＶｍａｘは、未阻害植物酵素の少なくとも１５％であることが好ましく、２５％より大きいことがより好ましい。本発明のＥＰＳＰＳは、２５〜１００００μＭのグリホセート範囲のＫｉを有することが好ましい。Ｋｉ／Ｋｍ比は３〜５００であり、６〜２５０がより好ましい。Ｖｍａｘは、２〜１００単位／ｍｇ（μｍｏｌｅｓ／分．ｍｇ、２５℃）の範囲であることが好ましく、シキミ酸−３−ホスフェートのＫｍは、０．１〜５０μＭの範囲であることが好ましい。
【０００８】クラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素をコードするＥＰＳＰＳは、３つの異なる細菌から単離されている：即ち、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓｓｐ．株ＣＰ４、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．株ＬＢＡＡ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．株ＰＧ２９８２である。ＬＢＡＡ及びＰＧ２９８２クラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子は、同じであると決定されており、これら２つの遺伝子によりコードされたタンパク質は、ＣＰ４タンパク質に非常に類似しており、それと約８４％のアミノ酸同一性を共有している。クラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素は、その他のクラスＩ ＥＰＳＰＳ酵素がクラスＩ抗体と容易に反応する条件下で、クラスＩ ＥＰＳＰＳ酵素から調製されたポリクローナル抗体と反応することができない点によって、クラスＩ ＥＰＳＰＳから容易に区別されることができる。
【０００９】その他のクラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素は、標準ハイブリッド形成技術を使用して、本明細書中に開示されているクラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子の１に由来する核酸プローブを利用して、容易に単離及び同定することができる。ＣＰ４株由来のそのようなプローブは、株ＬＢＡＡ及びＰＧ２９８２からクラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子を単離するために調製され利用されている。これらの遺伝子は、知られた方法論により植物中の発現を高めるためにも採用されることができる。このようなプローブは、土壌から新たに単離される細菌中の相同の遺伝子を同定するために使用されている。
【００１０】このクラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子は、葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ）と融合して、それが導入され得る植物の葉緑体を、そのタンパク質の標的とさせることが好ましい。このＣＴＰ−クラスＩＩＥＰＳＰＳ融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子は、標準方法により所望の植物中に導入するための３′ポリアデニル化部位及び適当なプロモーターを使用して調製することができる。
【００１１】従って、本発明は１の観点において、植物中に導入されたときに、その酵素の触媒活性及び植物代謝が実質的に通常の状態で維持されるようにその植物がグリホセート耐性を与えられるように、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）について低いＫｍ、高いＶｍａｘ／Ｋｍ比及びグリホセートについて高いＫｉを示す新規なＥＰＳＰシンターゼ系を提供する。この議論の目的のために、高度に有効なＥＰＳＰＳとは、グリホセートの存在下での有効性を言う。
【００１２】本発明のその他の観点において、クラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素をコードするＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ分子が開示されている。クラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素ＤＮＡ配列は、３つの起源に由来するものが開示されている：即ち、ＣＰ４と称されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．株ＬＢＡＡ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．株ＰＧ２９８２である。
【００１３】本発明のその他の観点において、その他の起源に由来するＤＮＡ配列がプローブとハイブリッド形成する能力をアッセイすることによって、その他の起源中のクラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子をスクリーニングすることにおける使用に適しているＥＰＳＰＳクラスＩＩ遺伝子由来の核酸プローブが示されている。
【００１４】本発明のさらにその他の観点において、クラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子を植物のゲノム中に導入することによってグリホセート耐性が与えられたトランスジェニック植物及び形質転換された植物細胞が開示されている。
【００１５】本発明のさらにその他の観点において、配列中に：ａ）ＲＮＡ配列を生じさせるように植物細胞中で機能するプロモーター；
ｂ）クラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素をコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列；及びｃ）ポリアデニルヌクレオチドのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）をＲＮＡ配列の３′末端に付加させるように植物細胞中で機能する３′非翻訳化領域を含み、前記プロモーターは構造ＤＮＡ配列に関して異種であり、融合ポリペプチドを十分発現させて下記ＤＮＡ分子により形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を高めるために適している組換え二本鎖ＤＮＡ分が開示されている。
【００１６】本発明のさらにその他の観点において、植物にグリホセート耐性を与えるためにクラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子により形質転換された作物の種子または作物の植物を植えることによる作物の畑において雑草を選択的に制御する方法が示されており、その方法によれば、グリホセートを含む殺草剤をその作物に処理し、グリホセート感受性の雑草を選択的に死滅させながら、前記作物は死滅させないことができる。
【００１７】本発明のその他の及びさらなる目的、効果及び観点は、添付の図面及び本発明の開示から明らかとなるであろう。
【００１８】図面の簡単な説明図１は、ゴマノハグサモザイクウィルス（ＦＭＶ３５Ｓ）の全長プロモーターのＤＮＡ配列（配列番号：１）を示す。
【００１９】図２は、コスミドクローニングベクターｐＭＯＮ１７０２０を示す。
【００２０】図３は、細菌単離物Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． 株ＣＰ４由来のクラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子の構造ＤＮＡ配列（配列番号：２）及び推定アミノ酸配列（配列番号：３）を示す。
【００２１】図４は、細菌単離物Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． 株ＬＢＡＡ由来のクラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子の構造ＤＮＡ配列（配列番号：４）及び推定アミノ酸配列（配列番号：５）を示す。
【００２２】図５は、細菌単離物Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． 株ＰＧ２９８２由来のクラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子の構造ＤＮＡ配列（配列番号：６）及び推定アミノ酸配列（配列番号：７）を示す。
【００２３】図６は、Ｅ．ｃｏｌｉＥＰＳＰＳアミノ酸配列（配列番号：８）とＣＰ４ＥＰＳＰＳのアミノ酸配列（配列番号：３）とのベストフィットの比較を示す。
【００２４】図７は、ＣＰ４ＥＰＳＰＳアミノ酸配列（配列番号：３）とＬＢＡＡＥＰＳＰＳのアミノ酸配列（配列番号：５）とのベストフィットの比較を示す。
【００２５】図８は、合成ＣＰ４クラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子の構造ＤＮＡ配列（配列番号：９）を示す。
【００２６】図９は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＥＰＳＰＳＣＴＰに由来し葉緑体プロセシング部位にＳｐｈＩ制限部位を有する葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ）のＤＮＡ配列（配列番号：１０）及び推定アミノ酸配列（配列番号：１１）を示す（以下、「ＣＴＰ２」と称する）。
【００２７】図１０は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＥＰＳＰＳ遺伝子に由来し、ＥＰＳＰＳの成熟領域内にＥｃｏＲＩ 制限部位を含む葉緑体トランジットペプチドのＤＮＡ配列（配列番号：１２）及び推定アミノ酸配列（配列番号：１３）を示す（以下、「ＣＴＰ３」と称する）。
【００２８】図１１は、Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ ＥＰＳＰＳＣＴＰに由来し、葉緑体プロセシング部位にＳｐｈＩ制限部位を含み、その中のプロセシング部位におけるアミノ酸が−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ− に変更された葉緑体トランジットペプチドのＤＮＡ配列（配列番号：１４）及び推定アミノ酸配列（配列番号：１５）を示す（以下、「ＣＴＰ４」と称す る）。
【００２９】図１２は、Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ ＥＰＳＰＳ遺伝子の成熟領域中に天然発生の ＥｃｏＲＩ部位を有する前記遺伝子に由来する葉緑体トランジットペプチドのＤＮＡ配列（配列番号：１６）及び推定アミノ酸配列（配列番号：１７）を示す（以下、「ＣＴＰ５」と称する）。
【００３０】図１３は、ＣＰ４植物形質転換体／発現ベクターｐＭＯＮ１７１１０のプラスミド地図を示す。
【００３１】図１４は、ＣＰ４合成ＥＰＳＰＳ遺伝子植物形質転換体／表現ベクターｐＭＯＮ１７１３１のプラスミド地図を示す。
【００３２】図１５は、ＣＰ４ＥＰＳＰＳなしのＤＮＡ植物形質転換発現ベクターｐＭＯＮ１３６４０のプラスミド地図を示す。
【００３３】図１６は、ＣＰ４植物形質転換体／直接選択ベクターｐＭＯＮ１７２２７のプラスミド地図を示す。
【００３４】図１７は、ＣＰ４植物形質転換体／発現ベクターｐＭＯＮ１９６５３のプラスミド地図を示す。
【００３５】本発明の開示二本鎖ＤＮＡ形態中に存在する植物遺伝子の発現は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によりＤＮＡの１本鎖からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を合成すること及びそれに続く核内のｍＲＮＡ一次産物のプロセシングを必須とする。このプロセシングは、ポリアデニル化ヌクレオチドをＲＮＡの３′末端に付加する３′非翻訳化領域を必須とする。
【００３６】ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写は、通常「プロモーター」と称されるＤＮＡの１の領域により調節される。このプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼに、ＤＮＡと結合させ、ＲＮＡの対応する相補的鎖を生成する鋳型としてＤＮＡ鎖の一方を使用してｍＲＮＡ中への転写を開始させるシグナルを与える塩基配列を含む。植物細胞中で活性の多数のプロモーターが文献に記載されている。これらは、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）及びオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（これらはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ の腫瘍誘発プラスミド上に担持されている）、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）１９Ｓ及び３５Ｓプロモーター、リブロースビス−ホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ、非常に豊富な植物ポリペプチド）由来の光誘導可能なプロモーター及びゴマノハグサモザイクウィルス（ＦＭＶ３５Ｓ）由来の全長転写プロモーターを包含する。これらプロモーターの全ては、植物中で発現された種々の型のＤＮＡ構造物を生成するために使用されている；例えばＰＣＴ公開ＷＯ８４／０２９１３（ロジャーズら、モンサント）参照。
【００３７】知られ、植物細胞中の転写を生じさせることが発見されたプロモーターは、本発明において使用することができる。このようなプロモーターは、植物及び植物ＤＮＡウィルスのような種々の起源から得ることができ、これらに限定されないが、ＣａＭＶ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーター並びにｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子のような植物遺伝子から単離されたプロモーターを包含する。以下に記載するように、選択された特定のプロモーターは、十分発現することができ、その結果、有効量のクラスＩＩＥＰＳＰＳを生成して、その植物をグリホセート殺草剤に対して実質的に耐性にすることができるものであることが好ましい。所望の耐性を誘導するために要求されるクラスＩＩＥＰＳＰＳの量は、植物の種によって変化する。利用されるプロモーターは、グリホセートがこのタイプの植物組織中で移動し蓄積されることが今や知られているので、その他の組織に加えて、全ての分裂組織中で比較的高度に発現することが好ましい。代替的に、キメラ遺伝子の組合せを使用して、漸増的に選択されたクラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素の必要な全体的発現レベルを得て、グリホセート耐性表現型を得ることができる。
【００３８】本発明のＤＮＡ構築物により生成されたｍＲＮＡは、５′非翻訳化リーダー配列も含む。この配列は、遺伝子を発現するために選択されたプロモーターに由来することができ、ｍＲＮＡの翻訳を増加するために特定に修正されることができる。５′非翻訳化領域はウィルスＲＮＡ、適当な真核遺伝子または合成遺伝子配列から得ることもできる。本発明は、下記の例に記載される、非翻訳化領域がプロモーター配列を伴う５′非翻訳化配列及びウィルス被覆タンパク質遺伝子の５′非翻訳化領域の一部の両方に由来する構造に限定されるものではない。むしろ、非翻訳化リーダー配列は、関係のないプロモーターまたは上記のコード配列に由来することができる。
【００３９】本発明において使用される好適なプロモーターは、植物特に双子葉植物中に挿入されるキメラ遺伝子の分裂組織中での特に良好な発現を伴う強力で均一なプロモーターとして作用するゴマノハグサモザイクウィルス（ＦＭＶ３５Ｓ）に由来する全長転写（配列番号：１）プロモーターである。得られたトランスジェニック植物は一般的には、高められたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより駆動される同じ遺伝子よりも、形質転換された植物の組織及び細胞の全体を通して、より高くより均一なレベルで挿入された遺伝子によりコードされるタンパク質を発現する。図１を参照すると、ＦＭＶ３５ＳプロモーターのＤＮＡ配列（配列番号：１）は、ＦＭＶゲノムのヌクレオチド６３６８及び６９３０の間に存在する。５′非翻訳化リーダー配列はプロモーターと連結することが好ましい。リーダー配列は、ＦＭＶ３５Ｓゲノム自体から得ることができ、またはＦＭＶ３５Ｓ以外の起源から得ることができる。
【００４０】キメラ植物遺伝子の３′非翻訳化領域は、植物中においてウィルスＲＮＡの３′末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加するように作用するポリアデニル化シグナルを含む。適当な３′領域の例は、（１）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子、例えばノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子、のポリアデニル化シグナルを含む３′転写された非翻訳化領域、及び（２）ダイズ貯蔵タンパク質遺伝子のような植物遺伝子及びリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小ユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝子である。好ましい３′領域の例は、以下に詳しく説明するマメ（Ｅ９）由来のｓｓＲＵＢＩＳＣＯに由来のものである。
【００４１】本発明のＤＮＡ構造物は、グリホセート耐性で高度に有効なクラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素をコードする二本鎖ＤＮＡ形態中の構造コード配列をも含む。
【００４２】グリホセート耐性で高度に有効なＥＰＳＰＳ酵素の同定グリホセート耐性で高度に有効なＥＰＳＰＳ酵素を同定し単離する試みにおいて、グリホセートに対する耐性を示す多数の細菌に由来し、または適当な起源から単離されたＥＰＳＰＳ酵素の反応動力学的分析を行った。いくつかのケースにおいて、ＥＰＳＰＳ酵素はグリホセートによる阻害に耐性を示さないことが発見され、細菌の耐性表現型はグリホセートまたはその他の因子に対する非浸透性によるものであると結論付られている。しかしながら、多数の場合において、その他の微生物及び植物起源について既に報告されたものと比較すると、そのＥＰＳＰＳ酵素がグリホセートによる阻害に対して高度の耐性を示しＰＥＰについて低いＫｍを示す微生物が同定された。これらの微生物に由来のＥＰＳＰＳ酵素を次の研究及び分析に付された。
【００４３】表Ｉは、上記の分析の結果同定及び単離されたＥＰＳＰＳ酵素について得られたデータを示す。表Ｉは、グリホセートに対する阻害に高耐性を有し、ＰＥＰについて低いＫｍを有することが観察された３つの同定されたクラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素についてのデータ、天然Ｐｅｔｕｎｉａ ＥＰＳＰＳ及びＧＡ１０１と称されるＰｅｔｕｎｉａ ＥＰＳＰＳのグリホセート耐性変異体についてのデータを含む。ＧＡ１０１変異体は、不変領域中の位置１０１（Ｐｅｔｕｎｉａに関して）のグリシン残基にアラニン残基の置換を示すので、そのように命名される。Ｐｅｔｕｎｉａ ＥＰＳＰＳ中にもたらされる変化（ＧＡ１０１）はその他の多数のＥＰＳＰＳ酵素中に導入した場合には、反応動力学における類似の変化、グリホセートについてのＫｉ及びＰＥＰについてのＫｍの増加が認められた。
【００４４】
【表１】

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株ＣＰ４を、１ｍＭホスフェートの存在下で炭素源（１０ｍＭ）としてのグリホセート上で生長するその能力により最初に同定した。株ＣＰ４は、Ｍａｎｎｖｉｌｌｅ Ｒ−６３５珪ソウ土ビーズを使用する固定床固定細胞カラムから得られた採集物から同定された。このコラムは、グリホセート産生植物から得られる廃水流上で３月間操作された。このコラムは、５０ｍｇ／ｍｌグリホセート及びＮＨ４ＣｌとしてのＮＨ３を含む。全有機炭素は３００ｍｇ／ｍｌであり、ＢＯＤ（生物学的酸素要求量−「ソフト」の炭素利用能の基準）は、３０ｍｇ／ｍｌ未満であった。この処理カラムは文献に記載されている（ハイトカンプら、１９９０）。１０ｍＭのグリホセート及び１ｍＭのホスフェートを含むドウォルキン−フォスターの最小塩培地を使用して、このカラムの洗浄液から単一の炭素源としてのグリホセート上で生長することができる微生物を選択した。ドウォルキン−フォスターの最小培地は、１ｌ（オートクレーブされたＨ２Ｏ）中に、Ａ、Ｂ及びＣをそれぞれ１ｍｌ並びにＤ（それぞれ以下に示す）１０ｍｌ及びチアミンＨＣｌ（５ｍｇ）を混合することによって生成された。
【００４５】酵母抽出物（ＹＥ；ディフコ）を最終濃度が０．０１または０．００１％になるように添加した。株ＣＰ４も、炭素源としてのグルコース、グルコン酸塩及びクエン酸塩（各０．１％）並びにリン源としての有機リン酸塩（０．１〜１．０ｍＭ）を含む、上記のように補正されたＤ−Ｆ塩からなる培地上で生長した。
【００４６】微生物を含むその他のクラスＩＩＥＰＳＰＳが、既に文献に記載された（ハラスら、１９８８）細菌の採集物に由来するＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．株ＬＢＡＡ及び文献に記載されている（ムーアら、１９８３；フィッツギボン、１９８８）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．株ＰＧ２９８２として同定された。粗溶解物の測定から、株ＰＧ２９８２に由来するＥＰＳＰＳ酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉのＥＰＳＰＳ酵素よりもグリホセートに対する阻害への感受性が小さいことが既に報告されているが、感受性の欠如に関する詳細は報告されておらず、この酵素のＰＥＰのＫｍまたはこの酵素の遺伝子のＤＮＡ配列についての報告もまだない（フィッツギボン、１９８８；フィッツギボン及びブレイマー、１９９０）。
【００４７】クラスＩＩＥＰＳＰＳと既に研究されたものとの関連今日までに研究された全てのＥＰＳＰＳタンパク質は、著しい程度の相同を示している。例えば、細菌及び植物ＥＰＳＰＳは約５４％が同一で、８０％もの高率の類似性を有する。細菌ＥＰＳＰＳ及び植物ＥＰＳＰＳそれ自体内の、同一性及び類似性の程度はより大きい（表ＩＩ参照）。
【００４８】
【表２】

ＣＰ４及びＬＢＡＡ細菌の粗抽出物（タンパク質５０μｇ）をウェスタン分析においてＰｅｔｕｎｉａ ＥＰＳＰＳタンパク質に対するウサギ抗ＥＰＳＰＳ抗体（パジェットら、１９８７）を用いてプローブしたら、対照ＥＰＳＰＳ（Ｐｅｔｕｎｉａ ＥＰＳＰＳ、２０ｎｇ；クラスＩ ＥＰＳＰＳ）が容易に検出された条件下で、延長された露出時間（タンパク質Ａ−１２５Ｉ現像システム）を用いても、プラスのシグナルは検出されなかった。これらの抽出物中のＥＰＳＰＳ活性の存在は酵素アッセイにより確認された。これらの細菌単離物由来のＥＰＳＰＳと既に研究されたＥＰＳＰＳとの間の類似性がないことが、ＰＥＰの低いＫｍとグリホセートの高いＫｉとの組合せに関連することを示すこの驚くべき結果は、これらの新規のＥＰＳＰＳ酵素が知られたＥＰＳＰＳ酵素（以下、「クラスＩ ＥＰＳＰＳ」と称する）とは異なることを示している。
【００４９】微生物単離物中のグリホセート耐性酵素開示を明瞭かつ簡潔にするために、クラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素をコードする遺伝子の単離物についての以下の記載は、細菌単離物に由来するそのような遺伝子の単離物を指すものとする。当業者は、同じまたは類似の方法を利用して、その他の微生物単離物、植物または真菌の起源からそのような遺伝子を単離することができることを理解するであろう。
【００５０】Ｅ．ｃｏｌｉ中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子のクローニングＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株ＣＰ４中の適当なＥＰＳＰＳの存在が確証されたので、２つの平行的な方法を実施して遺伝子をクローニングした：グリホセート耐性ＥＰＳＰＳの所期の発現型に基づくクローニング；及び酵素を精製して、抗体を生じさせタンパク質からアミノ酸配列を得るための物質を提供しクローニングの立証に役立てた。特に断らない限り、クローニング及び遺伝子技術は、一般的にはマニアチスら、１９８２またはサムブルックら、１９８７に記載された技術である。クローニング方法は下記の通りとした：株Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株ＣＰ４のコスミドバンクをＥ．ｃｏｌｉ中に導入すること及び阻害濃度のグリホセート上での生長について選択することによってＥＰＳＰＳ遺伝子の選択を行うこと。
【００５１】染色体ＤＮＡは、株Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株ＣＰ４から下記のようにして調製した：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株の２００ｍｌＬ−ブロス（ミラー、１９７２）、後期対数期培養物に由来の細胞ペレットを、溶液Ｉ１０ｍｌ；グルコース５０ｍＭ、ＥＤＴＡ１０ｍＭ、トリス−ＣＬ２５ｍＭ、ｐＨ８．０中に再懸濁した（バーンボイム及びドーリー、１９７９）。ＳＤＳを最終濃度が１％になるように添加し、この懸濁液を、それぞれが乾燥氷中に１５分間及び７０℃の水中に１０分間浸漬することからなる３回の凍結−解凍サイクルに付した。次いでこの溶解物を、等容量のフェノール：クロロホルム（１：１；ＴＥにより飽和されたフェノール；ＴＥ＝１０ｍＭトリスｐＨ８．０；１．０ｍＭＥＤＴＡ）により４回抽出し、得られた液相を遠心分離（１５０００ｇ；１０分間）により分離した。２容量のエタノールを添加した後、短時間の遠心分離（８０００ｇ；５分間）により、エタノール沈殿物質を上清からペレット化した。このペレットをＴＥ５ｍｌ中に再懸濁し、ＴＥ２ｌに対して４℃で１６時間透析した。この調製により５５２μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液５ｍｌが得られた。
【００５２】部分的に制限されたＤＮＡは下記のようにして調製した。ＣＰ４ＤＮＡの３つの１００μｇ の少量試料を、それぞれ４、２及び１酵素単位／μｇ ＤＮＡの割合で、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩにより１時間３７℃において処理した。このＤＮＡ試料を集め、ＥＤＴＡにより０．２５ｍＭとし、等容量のフェノール：クロロホルムにより抽出した。酢酸ナトリウム及びエタノールを添加した後、ＤＮＡを２容量のエタノールにより沈殿させ、遠心分離によりペレット化した（１２０００ｇ；１０分間）。乾燥したＤＮＡペレットをＴＥ５００μｌ中に再懸濁し、０．５ＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５ｍＭＥＤＴＡ中の１０〜４０％のシュクロース勾配上（各５．５ｍｌの５％増加）で層にした。ＳＷ２８ローターによる２６，０００ｒｐｍ における２０時間の遠心分離の後、管に穴を開け、〜１．５ｍｌの画分を採集した。各第２画分の試料（２０μｌ）を、０．７％アガロースゲル上で操作し、ＤＮＡのサイズを線状にされたλＤＮＡ及びＨｉｎｄＩＩＩ−消化されたλＤＮＡ標準との比較により測定した。２５〜３５ｋｂの断片のＤＮＡを含む画分を集め、ＡＭＩＣＯＮ１０カラム上で脱塩し（７０００ｒｐｍ；２０℃；４５分間）、沈殿により濃縮した。この操作により、所望の寸法のＣＰ４ＤＮＡ１５μｇが生成された。コスミドバンクはベクターｐＭＯＮ１７０２０を使用して構成された。このベクター、図２に示される地図は、ｐＢＲ３２７レプリコンに基づき、Ｔｎ７由来のスペクチノマイシン／ストレプオマイシン（Ｓｐｒ；ｓｐｃ）耐性遺伝子（フリングら、１９８５）、Ｔｎ９由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍｒ；ｃａｔ）（アルトンら、１９７９）、ファージＴ７由来の遺伝子１０プロモーター領域（ドューンら、１９８３）及びｐＨＣ７９由来の１．６ｋｂ ＢｇｌＩＩ ファージλコス断片（ホーン及びコリンズ、１９８０）を含む。多数のクローニング部位がｃａｔ遺伝子の下流に存在している。Ｅ．ｃｏｌｉ中のその他の微生物起源由来の遺伝子の発現の優勢な阻止は、転写のレベルであると考えられるので、Ｔ７プロモーターの使用及びｐＧＰ１−２プラスミドからのその位置でのＴ７ポリメラーゼの提供（テイバー及びリチャードソン、１９８５）は、ＲＮＡポリメラーゼ転写終結配列を含むとしても、外来ＤＮＡの大ＤＮＡ部分の発現を可能にする。ｓｐｃ遺伝子の発現は、ＣｍｒのみがｐＧＰ１−２を含む株中で選択され得るように、Ｔ７プロモーターからの転写により損われる。膜成分を採用しないＣｍ耐性のような抗生物質耐性の使用は、膜成分、例えばβ−ラクタマーゼのような膜成分及びＡｍｐ耐性を含む耐性遺伝子の高レベルの表現がグリホセート耐性表現型を生じさせることの観察によることが好ましい。多分これは、膜局在耐性タンパク質による細胞からのグリホセートの排除によるものである。また選択可能な標識は、Ｔ７プロモーターと同じ方向に配向していることが好ましい。
【００５３】次いでこのベクターを、クローニングの調製において、ＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、子牛アリカリホスファターゼ（ＣＡＦ）により処理した。ベクター及び標的配列は、下記：【００５４】
【表３】

を結合し、Ｈ２Ｏを２２．０μｌになるまで添加することによって連結した。この混合物を１６℃において１８時間インキュベートした。１０Ｘ連結緩衝液は、２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１００ｍＭＭｇＣｌ２；１００ｍＭジチオトレイトール；２ｍＭスペルミジンである。この連結されたＤＮＡ（５μｌ）を、製造者による手順を使用して、λファージ粒子（ストラータジーンギガパックゴールド）中に挿入した。
【００５５】Ｔ７ポリメラーゼ発現プラスミドｐＧＰ１−２（テイバー及びリチャードソン、１９８５）を含みＬ−ブロス（０．２％のマルトース及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシン）中で一晩生長したＥ．ｃｏｌｉＨＢ１０１（ボイヤー及びローランド−デュソー、１９７３）の試料（２００μｌ）を上記挿入されたＤＮＡ５０μｌ により感染させた。形質転換体を、３．０ｍＭのグリホセートと、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）、Ｌ−プロリン（５０μｇ／ｍｌ）、Ｌ−ロイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びＢ１（５μｇ／ｍｌ）を含むＭ９（ミラー、１９７２）寒天上で３０℃で選択した。少量試料をグリホセートを欠く同じ培地上で培養し、前記挿入されたコスミドの量を測定した。コスミド形質転換体を、３日後に３０℃においてＣＰ４ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ１μｇ当り〜５×１０５の割合で、この後者の培地上で単離した。３日から１５日に最終割合が〜１／２００コスミドで、コロニーがグリホセート寒天上に発生した。ＤＮＡが１４のグリホセート耐性クローンから調製され、この表現型を確認した後に、Ｅ．ｃｏｌｉＧＢ１００／ｐＧＰ１−２中に形質転換し（Ｅ．ｃｏｌｉＧＢ１００はＭＭ２９４のａｒｏ Ａ誘導体である［タルマッジ及びギルバート、１９８０］）、添加された芳香族アミノ酸及びアミノ安息香酸の不在下での生長の相補性を試験した。ＳＲ４８１のようなその他のａｒｏ Ａ（バッハマンら、１９８０；パジェットら、１９８７）を使用することが可能であり、この実験に適している。ＧＢ１００の使用はほとんど例がなく、限定された意味において考察されるべきではない。このａｒｏ Ａ株は通常、生長培地が最小培地中の生長のために、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン及びＬ−トリプトファンをそれぞれ１００μｇ／ｍｌ並びにｐ−ヒドロキシ安息香酸、２，３−ジヒドロキシ安息香酸及びｐ−アミノ安息香酸をそれぞれ５μｇ／ｍｌ補給されることを要求する。試験された１４のコスミドのうち、１のみがａｒｏ Ａ−表現型の相補性を示した。このコスミドの形質転換体、ｐＭＯＮ１７０７６は、１０日後に未補給の最小培地上において弱いが均一な生長を示した。
【００５６】コスミドによりコードされたタンパク質を、Ｔ７表現系（テイバー及びリチャードソン、１９８５）を使用して生体内で測定された。ｐＧＰ１−２（テイバー及びリチャードソン、１９８５）と試験及び対照コスミドを含むＥ．ｃｏｌｉの培養物を、クロラムフェニコール及びカナマイシン（それぞれ２５及び５０μｇ／ｍｌ）を含むＬ−ブロス（２ｍｌ）中で３０℃においてクレットの目盛が〜５０になるまで生長させた。少量の１を取り、細胞を遠心分離により採集し、Ｍ９塩（ミラー、１９７２）により洗浄し、０．２％グルコース、２０μｇ／ｍｌチアミン及び０．０１％１８アミノ酸（−システイン及びメチオニン）を含むＭ９培地１ｍｌ中に再懸濁した。３０℃において９０分間インキュベートした後、この培養物を４２℃の水浴中に移し、そこで１５分間保持した。リファンピシン（シグマ社）を２００μｇ／ｍｌになるまで添加し、培養物を４２℃においてさらに１０分間保持し、次いで３０℃に２０分間移した。試料に５分間３０℃において、３５Ｓ−メチオニン１０μＣｉを適用した。この細胞を遠心分離により集め、クラッキング緩衝液（６０ｍＭトリス−ＨＣｌ６．８、１％ＳＤＳ、１％２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノールブルー）６０〜１２０μｌ中に懸濁した。少量の試料を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での電気泳動に付し、１０容量の酢酸−メタノール−水（１０：３０：６０）中に６０分間浸漬した後、ゲルを製造者の指示に従ってＥＮＬＩＧＨＴＮＩＮＧＴＭ（デュポン製）中に浸漬し、乾燥させ、−７０℃においてＸ線フィルムに暴露した。３５Ｓ−メチオニンで標識された約４５ｋｄのサイズのタンパク質が、ｐＭＯＮ１７０７６を含む多数のコスミド中で検出された。
【００５７】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株ＣＰ４からのＥＰＳＰＳの精製全てのタンパク質精製方法を、３〜５℃において実施した。ＥＰＳＰＳ酵素アッセイを、１ｍＭホスホエノールピルベート（ＰＥＰ、ベーリンガー）及び２ｍＭシキミ酸−３−ホスフェート（Ｓ３Ｐ）基質濃度を使用して、パジェットらにより１９８７年に記載されたホスフェート放出または放射性ＨＰＬＣ方法のいずれかにより実施した。放射性ＨＰＬＣアッセイでは、１４Ｃ−ＰＥＰ（アマースハム）を利用した。Ｓ３Ｐは、ウィベンマイヤーらにより１９８８年に記載された方法により合成された。Ｎ末端アミノ酸の配列決定を、乾燥しながら試料をアリコートに分割してポリブレンプリサイクルフィルター上に充填することによって行った。自動エドマン分解化学を使用して、アプライドバイオシステムズ１２０ＡＰＴＨ分析装置を含むアプライドバイオシステムズモデル４７０Ａ気相配列決定装置（ハンカピラーら、１９８３）によりＮ末端タンパク質配列を決定した。
【００５８】５の１０ｌの発酵を、液体培地中で生長した場合に少ない凝集塊を示す株ＣＰ４の自然発生的な「滑らかな」単離物上で行った。この減少された凝集回及び滑らかなコロニー形態は、この単離物により減少された多糖類の生成によるものであり得る。下記のＥＰＳＰＳ酵素の精製を扱うセクションにおいて、ＣＰ４を「滑らかな」単離物−ＣＰ４−Ｓ１と称する。高特異活性を示す３つのバッチに由来の細胞を集めた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＣＰ４の細胞ペースト（３００ｇ）を、０．９％生理食塩水０．５Ｌで２回洗浄し、遠心分離（３０分間、ＧＳ３ソーバルローター中、８０００ｒｐｍ）により集めた。この細胞ペレットを抽出緩衝液（１００ｍＭトリスＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＢＡＭ（ベンズアミジン）、５ｍＭ ＤＤＴ、１０％グリセロール、ｐＨ７．５）０．９Ｌ中に懸濁し、マントンガウリンセルを２回通過させることにより溶解させた。得られた溶液を遠心分離し（３０分間、８０００ｒｐｍ）、得られた上清を１．５％プロタミン硫酸塩０．２１Ｌ（１００ｍＭトリスＣｌ中、ｐＨ７．５、０．２％ｗ／ｖ最終プロタミン硫酸塩濃度）により処理した。１時間撹拌した後、混合物を遠心分離し（５０分間、８０００ｒｐｍ）、得られた上清を固形硫酸アンモニウムにより処理し、４０％飽和とし、１時間撹拌した。遠心分離（５０分間、８０００ｒｐｍ）の後、得られた上清を固形硫酸アンモニウムにより処理して７０％の飽和とし、５０分間撹拌し、不溶性のタンパク質を遠心分離（１時間、８０００ｒｐｍ）により集めた。次いで、この４０〜７０％硫酸アンモニウム画分を抽出緩衝液中に溶解し、最終容量を０．２Ｌとして、抽出緩衝液２Ｌに対して２回、全体で１２時間透析した（スペクトラム１０，０００ＭＷカットオフ透析チューブ）。
【００５９】得られた透析された４０〜７０％の硫酸アンモニウム画分（０．２９Ｌ）に、固形硫酸アンモニウムを添加して最終濃度を１Ｍとした。この材料を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む抽出緩衝液により平衡化されたフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）樹脂を充填したカラム（５ｃｍ×１５ｃｍ、２９５ｍｌ）上に充填し（２ｍｌ／分）、同じ緩衝液により洗浄した（１．５Ｌ、２ｍｌ／分）。ＥＰＳＰＳを、１Ｍから０．００Ｍの硫酸アンモニウムの抽出緩衝液の線状勾配により溶離した（全容量１．５Ｌ、２ｍｌ／分）。画分を集め（２０ｍｌ）、ホスフェート放出アッセイによりＥＰＳＰＳ活性をアッセイした。高ＥＰＳＰＳ活性を有する画分（画分３６〜５０）を集め、１０ｍＭトリスＣｌ、２５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＤＴＴ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８に対して透析した。
【００６０】透析されたＥＰＳＰＳ抽出物（３５０ｍｌ）を、１０ｍＭトリスＣｌ、２５ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＤＴＴ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８（Ｑセファロース緩衝液）により平衡化されたＱ−セファロースファーストフロー（ファルマシア製）樹脂を充填したカラム（２．４ｃｍ×３０ｃｍ、１３６ｍｌ）上に充填した（５ｍｌ／分）。ＥＰＳＰＳを０．０２５Ｍ〜０．４０ＭＫＣｌのＱセファロース緩衝液の線上勾配により溶離した（全体の容量が１．４Ｌ、５ｍｌ／分）。画分を集め（１５ｍｌ）、ホスフェート放出アッセイによりＥＰＳＰＳ活性をアッセイした。高ＥＰＳＰＳ活性（画分４７〜６０）を有する画分を集め、固形硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように添加して沈殿させ、１時間撹拌した。沈殿したタンパク質を遠心分離（２０分間、ＧＳＡソーバルローター中１２０００ｒｐｍ）により集め、Ｑセファロース緩衝液中に溶解し（全容量１４ｍｌ）、同じ緩衝液に対して透析した（２×１Ｌ、１８時間）。
【００６１】得られた透析され、部分的に精製されたＥＰＳＰＳ抽出物（１９ｍｌ）をＱセファロース緩衝液により平衡化されたモノＱ１０／１０カラム（ファルマシア製）上に充填し（１．７ｍｌ／分）、同じ緩衝液（３５ｍｌ）により洗浄した。ＥＰＳＰＳを０．０２５Ｍから０．３５ＭＫＣｌの線状勾配により溶離した（全容量１１９ｍｌ、１．７ｍｌ／分）。画分を集め（１．７ｍｌ）、ホスフェート放出アッセイによりＥＰＳＰＳ活性をアッセイした。高ＥＰＳＰＳ活性を有する画分（画分３０〜３７）を集めた（６ｍｌ）。
【００６２】固形硫酸アンモニウムを添加することにより、モノＱプールを硫酸アンモニウム１Ｍとし、２ｍｌを、１００ｍＭトリスＣｌ、５ｍＭＤＴＴ、１Ｍ硫酸アンモニウム、１０％グリセロール、ｐＨ７．５（フェニルスペローズ緩衝液）で平衡化されたフェニルスペローズ５／５カラム（ファルマシア製）上でクロマトグラフィー処理した。試料を充填し（１ｍｌ／分）、フェニルスペローズ緩衝液（１０ｍｌ）により洗浄し、１Ｍから０．００Ｍの硫酸アンモニウムのフェニルスペローズ緩衝液の線状勾配により溶離した（全容量６０ｍｌ、１ｍｌ／分）。画分を集め（１ｍｌ）、ホスフェート放出アッセイによりＥＰＳＰＳ活性をアッセイした。高ＥＰＳＰＳ活性を有する各流れから得られた画分（画分〜３６〜４０）を一緒に集めた（１０ｍｌ、２．５ｍｇタンパク質）。Ｎ末端アミノ酸配列決定のために、１の画分の１部分（流れ１から得た＃３９）を５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３ に対して透析した（２×１Ｌ）。得られた純度の高いＥＰＳＰＳ試料（０．９ｍｌ、７７μｇタンパク質）は、下記の単一Ｎ末端アミノ酸配列：ＸＨ（Ｇ）ＡＳＳＲＰＡＴＡＲＫＳＳ（Ｇ）ＬＸ（Ｇ）（Ｔ）Ｖ（Ｒ）ＩＰＧ（Ｄ）（Ｋ）（Ｍ）（配列番号：１８）を示すことが判明した。
【００６３】このアミノ酸配列及び以下の全てのアミノ酸配列は、標準一文字名称を使用した。下記の記載において示される全ペプチド構造は、Ｎ末端のアミノ酸が左で、Ｃ末端のカルボキシル基が右に示される従来の方式で示す。同様に、タンパク質中に見られる天然発生のアミノ酸のアミノ酸名称は、下記の通りとする：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
【００６４】アミノ酸残基が知られていない場合に「Ｘ」を用い、カッコは、明白な指定が可能でないこと及び括弧内のアミノ酸の指定が知られた情報に基づいて最も可能性の高い推定であることを示している。
【００６５】残りのフェニルスペローズＥＰＳＰＳプールを、５０ｍＭトリスＣｌ、２ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭＫＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．５（２×１Ｌ）に対して透析した。Ｑセファロース緩衝液で平衡化したモノＱ５／５カラム（ファルマシア製）上にアリコート（０．５５ｍｌ、０．６１ｍｇタンパク質）を充填し（１ｍｌ／分）、同じ緩衝液で洗浄し（５ｍｌ）、０〜０．１４ＭＫＣｌのＱセファロース緩衝液の線状勾配により１０分間溶離し、次いで、０．１４ＭＫＣｌで保持した（１ｍｌ／分）。画分を集め（１ｍｌ）、ホスフェート放出アッセイによりＥＰＳＰＳ活性をアッセイし、ＳＤＳＰＡＧＥに付し（１０〜１５％、ファストシステム、ファルマシア製、銀染色を伴う）、タンパク質純度を決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質の単一のバンドを示す画分（２２〜２５、２２２μｇ）を集め、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ８．１に対して透析した（２×１Ｌ、９時間）。
【００６６】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． 株ＣＰ４ＥＰＳＰＳのトリプシノリシス及びペプチド配列決定得られた純粋なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株ＣＰ４ＥＰＳＰＳ（１１１μｇ）に、トリプシン３μｇ（カルバイオケム）を加え、トリプシノリシス反応を１６時間３７℃において進行させた。次いで、トリプシンの消化物をパジェットらが１９８８年にＥ．ｃｏｌｉＥＰＳＰＳについて開示した方法により、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（バイダック）上でクロマトグラフィー処理した（１ｍｌ／分）。全てのペプチド精製について、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、ピアス）を緩衝液「ＲＰ−Ａ」と称し、アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡを緩衝液「ＲＰ−Ｂ」と称した。トリプシン処理されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＣＰ４ＥＰＳＰＳの溶離のために使用された勾配は：０．８分、０％ＲＰ−Ｂ；８〜２８分、０〜１５％ＲＰ−Ｂ；２８〜４０分、１５〜２１％ＲＰ−Ｂ；４０〜６８分、２１〜４９％ＲＰ−Ｂ；６８〜７２分、４９〜７５％ＲＰ−Ｂ；７２〜７４分、７５〜１００％ＲＰ−Ｂであった。画分を集め（１ｍｌ）、２１０ｎｍにおける溶離グラフに基づいて、少なくとも７０のはっきりしたペプチドをトリプシン処理されたＥＰＳＰＳから生成した。画分４０〜７０を蒸発乾固し、１０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸各１５０μｌ中に再溶解した。
【００６７】画分６１のペプチドを下記勾配によりＣ１８カラム上でさらに精製した：０〜５分、０％ＲＰ−Ｂ、５〜１０分、０〜３８％ＲＰ−Ｂ；１０〜３０分、３８〜４５％Ｂ。画分を２１０ｎｍにおけるＵＶシグナルに基づいて集めた。画分２４中の大きなペプチドピークを４２％ＲＰ−Ｂにおいて溶離し、次いで乾燥させ、上記と同様にして再懸濁させ、下記勾配によりＣ１８カラム上で再びクロマトグラフィー処理した：０〜５分、０％ＲＰ−Ｂ；５〜１２分、０〜３８％ＲＰ−Ｂ；１２〜１５分、３８〜３９％ＲＰ−Ｂ；１５〜１８分、３９％ＲＰ−Ｂ；１８〜２０分、３９〜４１％ＲＰ−Ｂ；２０〜２４分、４１％ＲＰ−Ｂ；２４〜２８分、４２％ＲＰ−Ｂ。４１％ＲＰ−Ｂで溶離されペプチド６１−２４−２５と称される画分２５中のペプチドをＮ末端アミノ酸配列決定に付し、下記の配列が決定された：ＡＰＳＭ（Ｉ）（Ｄ）ＥＹＰＩＬＡＶ（配列番号：１９）
ＣＰ４ＥＰＳＰＳ画分５３トリプシンのペプチドを、０％Ｂ（５分）、０〜３０％Ｂ（５〜１７分）、３０〜４０％Ｂ（１７〜３７分）の勾配によりＣ１８ＨＰＬＣによりさらに精製した。３４％Ｂにおいて溶離し、ペプチド５３〜２８と指定された画分２８中のペプチドをＮ末端アミノ酸配列決定に付し、下記の配列を決定した：ＩＴＧＬＬＥＧＥＤＶＩＮＴＧＫ（配列番号：２０）
ＣＰ４ＥＰＳＰＳコスミドクローンを確かめるために、多数のオリゴヌクレオチドプローブを、ＣＰ４酵素由来の２のトリプシン配列の配列に基づいて設計した（表ＩＩＩ）。ＭＩＤと同定されたプローブは、非常に低い変性であり、最初のスクリーニングに使用した。ＥＤＶ−Ｃ及びＥＤＶ−Ｔであると同定されたプローブは、同じアミノ酸配列を基礎として、１の位置において異なり（下記表ＩＩＩ中のアンダーライン）、これら２つのプローブのうちの一方のみから期待される確実性を有する確認のプローブとして使用された。下記のオリゴヌクレオチドにおいて、特定の位置における代替的な許容され得るヌクレオチドは、Ａ／Ｃ／Ｔのように「／」により示される。
【００６８】
【表４】

このプローブをγ−３２Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼを使用して標識した。上記の１４のコスミド由来のＤＮＡをＥｃｏＲＩにより制限し、膜に移し、オリゴヌクレオチドプローブによりプローブした。採用した条件は下記の通りである：前ハイブリッド形成を６ＸＳＳＣ、１０Ｘデンハルト中で２〜１８時間６０℃において行い、ハイブリッド形成を６ＸＳＳＣ、１０Ｘデンハルト、１００μｇ／ｍｌｔＲＮＡ中で、プローブのＴｄの下で１０℃において行った。プローブのＴｄは、式２℃×（Ａ＋Ｔ）＋４℃×（Ｇ＋Ｃ）から概算される。次いで、フィルターを室温においてそれぞれ１０分間、６ＸＳＳＣにより３回洗浄し、乾燥し放射能写真を撮影した。ＭＩＤプローブを使用して、ｐＭＯＮ１７０７６コスミド中の〜９．９ｋｂの断片が１の正のシグナルを与えた。次いでこのコスミドＤＮＡを、ＥＤＶ−Ｃ（配列番号：２２）及びＥＤＶ−Ｔ（配列番号：２３）プローブにより別個にプローブし、再びこの〜９．９ｋｂバンドがＥＤＶ−Ｔプローブのみを伴い１のシグナルを与えた。
【００６９】グリホセート耐性発現型、Ｅ．ｃｏｌｉａｒｏ Ａ−発現型の相補性、〜４５Ｋｄタンパク質の発現及びＣＰ４ＥＰＳＰＳアミノ酸配列に由来する２つのプローブとのハイブリッド形成に関する合わせられたデータは、ｐＭＯＮ１７０７６コスミドがＥＰＳＰＳ遺伝子を含むことを強く示した。
【００７０】ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子の配置及びサブクローニングＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子をさらに下記のようにして配置した：多数の追加のサザン分析を、ＭＩＤ（配列番号：２１）及びＥＤＶ−Ｔ（配列番号：２３）プローブを別個に使用して、ｐＭＯＮ１７０７６の異なる制限消化物上で行なった。これらの分析及び結果として得られたｐＭＯＮ１７０７６由来の〜９．９ｋｂ断片のｐＢｌｕｓ Ｓｃｒｉｐｔ（ストラータジーン）サブクローンの詳細な制限地図に基づいて、両プローブがそれにハイブリッド形成する３．８ｋｂＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を同定した。この分析はまた、ＭＩＤ（配列番号：２１）及びＥＤＶ−Ｔ（配列番号：２３）プローブがＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ及びＳａｃＩＩ部位の異なる部位にハイブリッド形成することを示した。この３．８ｋｂの断片は、ｐＢｌｕｅ Ｓｃｒｉｐｔ中の両配向にクローニングされて、ｐＭＯＮ１７０８１及びｐＭＯＮ１７０８２を生成した。次いでこれらのクローンによりＥ．ｃｏｌｉに与えられる発現型を測定した。グリホセートを３ｍＭ含有するＭ９寒天培地上のｐＧＰ１−２（ｐＢｌｕｅ ＳｃｒｉｐｔはＴ７プロモーターをも含む）を含むＥ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４への形質転換の後に、グリホセート耐性を測定した。ｐＭＯＮ１７０８１及びｐＭＯＮ１７０８２の両者は、グリホセートを欠く同じ培地上の対照の約半分のサイズの３０℃での３日目におけるグリホセート耐性コロニーを示した。この結果は、３．８ｋｂの断片が完全なＥＰＳＰＳ遺伝子を有していることを示唆している。この発現型の配向依存の明らかな欠如は、クローニング部位の１の側部における７プロモーター及び他方におけるｌａｃプロモーターによって説明されることができる。ａｒｏ Ａ発現型は、芳香族補給物のないＭ９寒天培地上のＥ．ｃｏｌｉＧＢ１００の形質転換体において測定した。Ｐｌａｃ誘導物質ＩＰＴＧを使用してまたは使用しないで行なわれたこの実験において、ｐＭＯＮ１７０８２は、ｐＭＯＮ１７０８１よりもはるかに大きな成長を示したが、それは、ＥＰＳＰＳ遺伝子がＳａｌＩ部位からＥｃｏＲＩ 部位の方向に発現されることを示唆している。
【００７１】ヌクレオチド配列決定は、上記のＢａｍＨＩ部位を含む多数の制限部位末端から開始される。Ｎ末端タンパク質配列と近接に適合しトリプシン断片５３〜２８（配列番号：２０）（ＥＤＶ−Ｔプローブの基礎）のタンパク質配列をコードする配列は、このＢａｍＨＩ部位のＳａｌＩ部位に配置されている。これらのデータは、ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子のクローニング及びこの遺伝子の転写の方向の決定的な証拠を提供した。制限地図データに関連するこれらのデータはまた、完全な遺伝子が〜２．３ｋｂＸｈｏＩ断片上に配置され、この断片がｐブルースクリプト中にサブクローニングされることを示している。この断片の約２ｋｂのヌクレオチド配列は、クローニングされた制限断片からの配列決定の組合せ及び配列を延長する特異的プライマーの使用によって決定される。ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子のヌクレオチド配列及び側面に位置する領域を図３（配列番号：２）に示す。ペプチド６１−２４−２５に対応する配列（配列番号：１９）も配置された。この配列を、ＩＢＩ（インターナショナルバイオテクノロジーズインコーポレイテッド）のシーケナーゼキット及びファルマシア製のＴ７配列決定／デアザキットの両方を使用して決定した。
【００７２】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株ＣＰ４から精製されたＥＰＳＰＳ活性をコードするクローニングされた遺伝子を下記の方法により確認した：一連の部位特異的突然変異生成により、ＢｇｌＩＩ及びＮｃｏＩ部位をＮｃｏＩ認識配列内に含まれるｆＭｅｔとともにＮ末端において存在させ、第１の内部ＮｃｏＩ部位を除去し（第２の内部ＮｃｏＩ部位はその後除去した）、ＳａｃＩ部位を終結コドンの後に存在させた。後の段階において、内部ＮｏｔＩ部位も部位特異的突然変異生成により除去した。下記の表は、ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子の部位特異的突然変異生成（制限部位の添加または除去）のためのプライマーを含む。突然変異生成を、実質的にはサムブルックら（１９８９）により記載された方法と同じクンケルら（１９８７）の方法により行なった。
【００７３】
【表５】

次いでこのＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子を、文献記載された（ウォングら、１９８８；オリンズら、１９８８）ものと類似のＰｒｅｃＡ−遺伝子１０Ｌ表現ベクター中に、ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩＮ末端断片及びＢａｍＨＩ−ＳａｃＩＣ末端断片として、クローニングし、ｐＭＯＮ１７１０１を生成した。ＰＥＰのＫｍ 及びグリホセートのＫｉを、ナリジキシン酸による誘導の後に、ｐＭＯＮ１７１０１／ＧＢ１００形質転換体の粗溶解物中のＥＰＳＰＳ活性について決定したところ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株ＣＰ４から得られた精製及び粗の調製物について決定されたものと同じであることが判明した。
【００７４】Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．株ＬＢＡＡ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．株ＰＧ２９８２由来のＥＰＳＰＳ遺伝子の特性化部分的にＨｉｎｄＩＩＩにより制限されたＬＢＡＡＤＮＡのコスミドバンクを、ベクターｐＨＣ７９（ホーン及びコリンズ、１９８０）においてＥ．ｃｏｌｉＭＭ２９４中で構成した。このバンクをコロニーハイブリッド形成により全長ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子プローブを使用してプローブし、正のクローンを４００コスミド当り〜１の割合で同定した。ＬＢＡＡＥＰＳＰＳ遺伝子をさらに、サザン分析によりこれらのコスミド中に配置させた。この遺伝子を〜２．８ｋｂＸｈｏＩ断片上に配置させ、制限断片端部から一連の配列決定工程により、及びＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子の配列決定からオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより、ＬＢＡＡＥＰＳＰＳ遺伝子のヌクレオチド配列を完全にして、図４（配列番号：４）中に示す。ＰＧ２９８２由来のＥＰＳＰＳ遺伝子もクローニングした。
【００７５】ＥＰＳＰＳタンパク質を、下記の点について異なる他はＣＰ４酵素について記載した方法と実質的に同じ方法で精製した：セファロースＣＬ−４Ｂカラムの後に、高ＥＰＳＰＳ活性を有する画分を集め、固形硫酸アンモニウムを８５％の飽和状態となるまで添加して１時間撹拌することによってタンパク質を沈殿させた。沈殿したタンパク質を遠心分離により集め、Ｑセファロース緩衝液中に再懸濁し、同じ緩衝液に対する透析の後に、カラム上に充填した（ＣＰ４酵素の場合と同じ方法で）。Ｑセファロースカラム上での精製の後に、１００ｍＭトリスｐＨ７．８、１０％グリセロール、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ及び１Ｍ硫酸アンモニウム中のタンパク質〜４０ｍｇを、フェニルスペローズ（ファルマシア）カラム上に充填した。カラムを上記緩衝液中の１．０Ｍ〜０．００Ｍ硫酸アンモニウムの勾配４０ｍｌにより１．０ｍｌ／分で溶離した。
【００７６】フェニルスペローズ１０／１０カラムの活性画分由来のタンパク質約１．０ｍｇを、流速０．７５ｍｌ／分のファルマシアモノＰ５／１０クロマトフォーカシングカラム上に充填した。開始緩衝液は、２５ｍＭビス−トリス、ｐＨ６．３であり、カラムをポリバッファー７４の３９ｍｌ、ｐＨ４．０により溶離した。クロマトフォーカシングカラムから得たピーク画分約５０μｇを、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中に透析した。次いでこの試料を使用してＮ末端アミノ酸配列を決定した。
【００７７】得られたＮ末端配列は：ＸＨＳＡＳＰＫＰＡＴＡＲＲＳＥ（式中Ｘ＝未同定の残基）（配列番号：３０）であった。多数の変性したオリゴヌクレオチドプローブをこの配列に基づいて設計し、使用して緩和条件下のコロニーハイブリッド形成によりコスミドｐＨＣ７９（ホーン及びコリンズ、１９８０）中のＰＧ２９８２部分−ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡのライブラリーをプローブした。最終洗浄条件は、５５℃において１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを１５分間使用することであった。配列ＧＣＧＧＴＢＧＣＳＧＧＹＴＴＳＧＧ（式中Ｂ＝Ｃ、ＧまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ、及びＹ＝ＣまたはＴ）（配列番号：３１）を有する１のプローブが１組のコスミドクローンを同定した。
【００７８】このようにして同定されたコスミド組は、種々のＨｉｎｄＩＩＩ断片のコスミドにより構成された。しかしながら、この組がＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子プローブによりプローブされたときに、ＰＧ２９８２ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むコスミドが同定された（元来コスミド９Ｃ１と称され、後にｐＭＯＮ２０１０７と称された）。一連の制限地図作成及びサザン分析の後に、この遺伝子を〜２．８ｋｂＸｈｏＩ断片に配置させ、この遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。このＤＮＡ配列（配列番号：６）を図５に示す。ＥＰＳＰＳ遺伝子配列はＬＢＡＡ（配列番号：４）及びＰＧ２９８２（配列番号：６）との間にヌクレオチドの相違がなかった。２つの酵素の反応動力学的因子は、実験誤差の範囲内であった。
【００７９】Ｅ．ｃｏｌｉ中のグリホセート耐性に影響を与えるＰＧ２９８２由来の遺伝子の配列は決定されている（フィッツギボン、１９８８；フィッツギボン及びブレイマー、１９９０）。ＰＧ２９８２ＥＰＳＰＳクラスＩＩ遺伝子の配列は、既に報告された配列と相同関係がなく、従来の研究のグリホセート耐性表現型がＥＰＳＰＳと関係がないことを示している。
【００８０】その他のクラスＩＩＥＰＳＰＳ構造遺伝子の代替的単離方法多数のクラスＩＩ遺伝子が単離されており、本明細書中に記載されている。ＣＰ４由来の遺伝子のものである、第１遺伝子クローニングは、クラスＩ及びクラスＩＩ酵素及び遺伝子の間において類似の程度が低いことにより困難であることは明らかである。しかしながら、その他の遺伝子の同定は、プローブとしてこの第１の遺伝子を使用することによって多いに促進された。ＬＢＡＡＥＰＳＰＳ遺伝子のクローニングにおいて、ＣＰ４遺伝子プローブは、コスミドクローンの迅速な同定及び完全な遺伝子の小制限断片への配置を可能にし、いくつかのＣＰ４配列プライマーを用いて、ＬＢＡＡ（及びＰＧ２９８２）ＥＰＳＰＳ遺伝子の配列決定をした。ＣＰ４遺伝子プローブをも使用してＰＧ２９８２遺伝子クローンを確認した。クラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子の高低度の類似性を利用して、クラスＩ ＥＰＳＰＳ遺伝子プローブを使用してその他のクラスＩ遺伝子をクローニングしたのとほとんど同じ方法により、追加の遺伝子を同定及びクローニングした。後者の例は、プローブとしてＰ．ｈｙｂｒｉｄａ遺伝子を利用するＡ．ｔｈａｌｉａｎａＥＰＳＰＳ遺伝子のクローニングにおけるものであった（リーら、１９８７）。
【００８１】グリホセート耐性ＥＰＳＰＳ活性は、多数の起源に由来するＥＰＳＰシンターゼについてすでに報告されている。これらの酵素はほとんどの場合においてまったく特性化されていなかった。クラスＩ及びクラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子プローブまたは抗体プローブの使用は、ＥＰＳＰＳの特性の最初のスクリーニングのための迅速な方法を提供し、そのような酵素の遺伝子の迅速なクローニング及び特性化のための手段を提供する。
【００８２】記載された３つの遺伝子の２つがグリホセート処理設備から単離された細菌から単離された（株ＣＰ４及びＬＢＡＡ）。３番目（ＰＧ２９８２）は培養採集株から単離された細菌から得られた。この後者の単離は、グリホセートへの接触は高グリホセート耐性ＥＰＳＰＳ酵素の単離のための必要条件ではなく、細菌の採集物のスクリーニングは追加の単離物を生成することができたことを示唆している。そのような微生物を豊富にすることがクラスＩＩＥＰＳＰＳ微生物の単離頻度を高めると考えられる場合において、グリホセート分解またはグリホセート耐性微生物母集団（クインら、１９８８；タルボットら、１９８４）を豊富にすることは可能である。クラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子を含むその他の細菌も同定されている。ＣＰ４（上記参照）と同じ処理カラムビーズから、しかしグリホセートが炭素及びリンの両源として供給された培地中で単離されたＣ１２と称される細菌が、サザン分析によって、ＣＰ４ＥＰＳＰＳコード配列からなるプローブとハイブリッド形成することが示された。株ＬＢＡＡについての結果と関連して、この結果はこの豊富化方法がクラスＩＩＥＰＳＰＳ単離物の同定を促進することを示唆している。クラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子を含む新規の細胞単離物は、グリホセート廃棄処理施設以外の環境から同定されている。接種原は、土壌（イリノイ州ジャージービルの最近収穫されたダイズの畑から得られた）及び炭素原として１０ｍＭのグリホセート（及び１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドにより真菌の成長を防止する）を含むドウォルキン−フォスター培地中での２８℃における成長により選択された細菌の母集団を採集することによって調製された。Ｌ寒天培地上で培養したら、５のコロニータイプが同定された。染色体ＤＮＡをこれらの単離物のＬブロス培地２ｍｌから調製し、クラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子の存在を、厳格なハイブリッド形成及び洗浄条件下で、サザン分析によりＣＰ４ＥＰＳＰＳコード配列プローブを使用してプローブした。土壌単離物の１、Ｓ２はこのスクリーニングにより正であった。
【００８３】異なるＥＰＳＰＳ遺伝子間の関係多数のクラスＩ及びクラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素の推定アミノ酸配列を、ＵＷＧＣＧパッケージに与えられたベストフィットコンピュータープログラムを使用して（デベルーら、１９８４）比較した。このプログラムを使用して決定された類似及び同一の程度を報告する。クラスＩ及びクラスＩＩタンパク質配列において測定された類似／同一の程度は、著しく高く、例えばＥ．ｃｏｌｉとＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍとの比較（類似／同一＝９３％／８８％）及びＥ．ｃｏｌｉと植物ＥＰＳＰＳとの比較（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ；７２％／５５％）である。しかしながら、クラスＩ及びクラスＩＩの間の配列の比較は、クラス間の関連が非常に低い程度であることを示す（類似／同一＝５０〜５３％／２３〜３０％）。Ｅ．ｃｏｌｉ（配列番号：８）及びＣＰ４（配列番号：３）配列のベストフィット分析の表示は、保有された残基の位置を示し、図６に示されている。ＥＰＳＰＳ配列の先の分析は、酵素配列の保有の程度が高いことと２つの領域、「２０〜３５」及び「９５〜１０７」領域中の配列（ガッサーら、１９８８；Ｐｅｔｕｎｉａ ＥＰＳＰＳ配列に従って番号を付けた）のほとんどの不変性及びクラスＩ細菌及び植物ＥＰＳＰＳ配列と比較したときにＣＰ４及びＬＢＡＡの場合において、これらの領域の保有程度が低いことに注目していた（Ｅ．ｃｏｌｉ及びＣＰ４ＥＰＳＰＳ配列の比較について図６を参照。Ｅ．ｃｏｌｉ配列は、図の最上の配列として示されている）。ＣＰ４クラスＩＩＥＰＳＰＳ中の対応する配列は：ＰＧＤＫＳＩＳＨＲＳＦＭＦＧＧＬ（配列番号：３２）及びＬＤＦＧＮＡＡＴＧＣＲＬＴ（配列番号：３３）である。
【００８４】これらの比較は、クラスＩ及びクラスＩＩＥＰＳＰＳタンパク質の全体の関連性が低く、仮定の保有された領域中の配列が相当に分岐したことを示す。
【００８５】ＣＰ４ＥＰＳＰＳにおいて、アラニン残基は「グリシン１０１」位置に存在する。保有されたグリシン（「９５〜１０７」領域）をアラニンにより置換することは、クラスＩ ＥＰＳＰＳにおけるグリホセートのＫｉ及びＰＥＰのＫｍを高める結果となる。この位置においてアラニンを有するＣＰ４ＥＰＳＰＳの場合において、ＰＥＰのＫｍは低い範囲にあり、クラスＩＩ酵素が先に特性化されたＥＰＳＰＳ酵素と多くの点において異なることを示している。
【００８６】クラスＩＩ単離物内では、類似性／同一性の程度は、クラスＩ内のものについて述べたものと同じ程度に高い（表ＩＶ）。図７は、ＣＰ４（配列番号：３）及びＬＢＡＡ（配列番号：５）ＥＰＳＰＳの仮定アミノ酸配列のベストフィットコンピュータープログラムによる配列を示し、ＣＰ４配列を図中の上の配列として示す。図６及び７中で使用される記号は、類似性及び同一性の程度を示すためのベストフィットコンピュータープログラム中で使用される標準記号である。
【００８７】
【表６】

ＣＰ４及びＬＢＡＡＥＰＳＰＳタンパク質の仮定アミノ酸配列間で着目することができる１の相違点は、ＣＰ４酵素の場合にアラニンが見られ、ＬＢＡＡ酵素の場合にグリシンが見られる位置１００である。クラスＩ ＥＰＳＰＳ酵素において、グリシンは通常対応する位置、即ち、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ中ではグリシン９６、Ｐｅｔｕｎｉａではグリシン１０１中に見られる。これらの３つの酵素の場合に、グリシンからアラニンへの転化はグリホセートの見かけのＫｉを高め及びＰＥＰの見かけのＫｍを付随的に高める結果となり（キショアら、１９８６；キショア及びシャー、１９８８；ソスト及びアムルハイン、１９９０）、それは上記したように、より低いＰＥＰ濃度の条件下において酵素を特に低効率とすることが報告されている。ＬＢＡＡＥＰＳＰＳのグリシン１００は、アラニンに転化され、ＰＥＰの見かけのＫｍ及びグリホセートの見かけのＫｉの両方を変異体について測定した。このグリシン１００のアラニンへの変化は、下記のプライマー：ＣＧＧＣＡＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣ（配列番号：３４）中に変異により挿入して行い、野性型及び変異体の遺伝子がＲｅｃＡプロモーター表現ベクター中のＥ．ｃｏｌｉ中で発現され（それぞれｐＭＯＮ１７２０１及びｐＭＯＮ１７２６４）、見かけのＫｍ及び見かけのＫｉを粗溶解物中で測定した。このデータは、Ｇ１００Ａ変異体の見かけのＫｉが約１６倍に高められることを示す（表Ｖ）。この結果は、クラスＩ ＥＰＳＰＳ酵素の見かけのＫｉ（グリホセート）の上昇におけるＧ−Ａの変化の重要性の観察と一致している。しかしながら、クラスＩ Ｇ−Ａ変異体における結果とは対照的に、クラスＩＩ（ＬＢＡＡ）Ｇ−Ａ変異体の見かけのＫｍ（ＰＥＰ）は変化しない。これはクラスＩＩ及びクラスＩ ＥＰＳＰＳ酵素の間のその他の相違点を提供する。
【００８８】
【表７】

ＬＢＡＡＧ１００Ａは、その優れた反応動力学的特性により、ｐｌａｎｔａにおけるグリホセートの改良を与えることができる。
【００８９】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子配列の変異及び再合成Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．株ＣＰ４由来のＥＰＳＰＳ遺伝子は、植物中の遺伝子の高表現に対して有害な配列を含む。これらの配列は、頻繁に存在しＡ＋Ｔに富む潜在的ポリアデニル化部位、植物遺伝子に多く見られるものよりも高いＧ＋Ｃ％（６４％対〜５０％）、Ｇ及びＣ残基の高濃度のストレッチ、植物遺伝子中において殆んど使用されていないコドンを含む。ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子中の高いＧ＋Ｃ％は、下記を含む多数の潜在的結果を有する：コドンの第３の位置において植物遺伝子中に見られるよりも高いＧまたはＣを使用すること及びＲＮＡの発現または安定性に影響を与え得る強力なヘアピン構造を生成する能力。ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子のＧ＋Ｃ含量の減少、Ｇ及びＣのストレッチの破壊、潜在的ポリアデニル化配列の除去及び植物遺伝子においてより頻繁に使用されるコドン利用における改良は、植物中のＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子の表現を高める結果をもたらし得る。
【００９０】上記の有害な配列を可能な限り完全に変化させるために合成ＣＰ４遺伝子を設計した。要約すると、遺伝子配列を、下記の配列または配列特性を可能な限り多く除去するように再設計した（一方で不要な制限部位の導入を避けながら）：５またはそれより大きい直線状のＧ及びＣ；（優勢的に）ポリアデニル化部位として作用し得るＡ＋Ｔに富む領域または潜在的ＲＮＡ脱安定領域。この遺伝子の配列を図８に示す（配列番号：９）。このコード配列を、ＲｅｃＡプロモーター由来のＥ．ｃｏｌｉ中で表現し、ＥＰＳＰＳ活性をアッセイし、天然ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子のものと比較した。天然及び合成遺伝子のＰＥＰの見かけのＫｍはそれぞれ、１１．８及び１２．７であり、合成遺伝子から表現された酵素が変化していないことを示唆している。コード配列のＮ末端を突然変異生成して、ＳｐｈＩ部位をＡＴＧに配置して葉緑体移入のためのＣＴＰ２−ＣＰ４合成融合体の構成を可能にした。下記のプライマーはこの突然変異生成を達成するために使用された：ＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＴＴＧＣＡＣＣＧＴＧＡＡＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧ（配列番号：３５）。
【００９１】葉緑体特異的ＣＰ４ＥＰＳＰＳの発現植物中のグリホセート標的、５−エノールピルビル−シキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素は葉緑体中に配置されている。ＥＰＳＰＳを含む多くの葉緑体配置されたタンパク質は、前駆体として核遺伝子から表現され、移入工程中に除去される葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ）により葉緑体を標的とする。その他のこのような葉緑体タンパク質の例は、リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小サブユニット（ＳＳＵ）、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドリダクターゼ、光−収穫−複合体タンパク質Ｉ及びＩＩ並びにチオレドキシンＦを包含する。非葉緑体タンパク質はＣＴＰとのタンパク質融合体の使用により葉緑体を標的とすることができ、ＣＴＰ配列はタンパク質をして葉緑体を標的とさせるのに十分であることが生体内及び生体外において示されている。
【００９２】ＣＴＰ−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ融合体は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＥＰＳＰＳＣＴＰ（リーら、１９８７）及びＣＰ４ＥＰＳＰＳコード配列の間で構成される。Ａｒａｂｉｃｏｐｓｉｓ ＣＴＰは、部位特異的変異生成によりＳｐｈＩ制限部位をＣＴＰプロセシング部位に配置することにより操作された。この変異生成は、この存在位置におけるＧｌｕ−ＬｙｓをＣｙｓ−Ｍｅｔにより置換した。ＣＴＰ２と称されるこのＣＴＰの配列（配列番号：１０）を図９に示す。ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子のＮ末端を変異させて、Ｍｅｔコドンを回転させるＳｐｈＩ部位を配置した。この第２コドンは、この工程におけるロイシンのものに転化された。この変化は、ａｒｏＡ対立遺伝子の相補の割合により判断されたように、Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣＰ４ＥＰＳＰＳの生体内活性に明らかな影響を与えなかった。次いでこの変異されたＮ末端をＳａｃＩＣ末端と結合し、ＣＴＰ２配列の下流でクローニングした。ＣＴＰ２−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ融合体をｐブルースクリプトＫＳ（＋）中にクローニングした。このベクターは、Ｔ７ポリメラーゼ及び３５−メチオニンにより翻訳されたＲＮＡを使用して生体内で転写されて、下記に記載の方法（デラ−シオッパら、１９８６、１９８７）を使用してＬａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａから単離された葉緑体中への移入について評価され得る物質を提供することができる。この鋳型をＴ７ポリメラーゼを使用して生体外で転写し、３５Ｓ−メチオニン標識されたＣＴＰ２−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ物質が対照Ｐｅｔｕｎｉａ ＥＰＳＰＳと匹敵し得る効率で葉緑体中に移入されることが示された（対照＝３５Ｓ標識されたＰｒｅＥＰＳＰＳ［ｐＭＯＮ６１４０；デラ−シオッパら、１９８６］）。
【００９３】その他の例において、ＣＴＰ３と称されるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＥＰＳＰＳＣＴＰは、ＥｃｏＲＩ部位を介してＣＰ４ＥＰＳＰＳと融合した。このＣＴＰ３の配列（配列番号：１２）を図１０に示す。１のＥｃｏＲＩ部位をアミノ酸２７のまわりのＡｒａｂｉｃｏｐｓｉｓ ＥＰＳＰＳ成熟領域中に導入し、配列−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−をプロセス中の−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−により置換した。下記配列のプライマーを使用してＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子のＮ末端を変異して、ＥｃｏＲＩ部位を付加してＣＴＰ３への融合を達成した：ＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＧＧＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＣＧＧ（配列番号：３６）（ＥｃｏＲＩ部位に下線を引いた）。
【００９４】このＣＴＰ３−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ融合体もｐブルースクリプトベクター中にクローニングし、Ｔ７表現された融合体は、対照Ｐｅｔｕｎｉａ ＥＰＳＰＳと匹敵可能な効率で葉緑体中に移入されることが判明した（ｐＭＯＮ６１４０）。
【００９５】ＣＴＰ４（ＳｐｈＩ）及びＣＴＰ５（ＥｃｏＲＩ）と称される関連する一連のＣＴＰは、Ｐｅｔｕｎｉａ ＥＰＳＰＳＣＴＰ及び遺伝子に基づいて、ＳｐｈＩ−及びＥｃｏＲＩ変異されたＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子配列と融合された。ＳｐｈＩ部位を、部位特異的突然変異生成により付加して、葉緑体プロセシング部位に、この制限部位を配置した（及びアミノ酸配列を−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−に変化させた）。ＣＴＰ−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ融合体の全てが概ね等しい効率で葉緑体中に輸入されることが示された。ＣＴＰ４（配列番号：１４）及びＣＴＰ５（配列番号：１６）配列を図１１及び１２に示す。
【００９６】ＣＴＰ２−ＬＢＡＡＥＰＳＰＳ融合体は、ＳｐｈＩ部位の付加によりＬＢＡＡＥＰＳＰＳ遺伝子のＮ末端の変異の後に構成された。この融合体はまた、葉緑体中に効率良く輸入されることが判明した。
【００９７】類似の方法により、ＣＴＰ２−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ及びＣＴＰ４−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ融合体は、コーンの葉鞘から調製された葉緑体中に効率良く移入されることが示されている。これらの結果は、これらのＣＴＰ−ＣＰ４融合体が単子葉植物種にグリホセート耐性を与える有用な遺伝子を提供することができるであろうことを示している。
【００９８】当業者は、特定のＣＴＰがクラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素を植物細胞葉緑体中に移入する機能を利用する種々のキメラ構造を生成することができることを理解するであろう。クラスＩＩＥＰＳＰＳの葉緑体移入は、下記のアッセイを使用して測定することができる。
【００９９】葉緑体取り込みアッセイ完全な葉緑体を、バートレットら（１９８２）の方法の変形によりパーコル／フィコル勾配中の遠心分離によりレタス（Ｌａｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ，ｖａｒ．ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ）から単離する。完全な葉緑体の最終ペレットを、５０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．７中の３３０ｍＭソルビトール０．５ｍｌ中に懸濁し、クロロフィルについてアッセイし（アーノン、１９４９）、最終クロロフィル濃度が４ｍｇ／ｍｌになるように調節（ソルビトール／Ｈｅｐｅｓを使用）した。単頭レタスの完全葉緑体の収量は、３〜６ｍｇのクロロフィルである。
【０１００】典型的な３００μｌの取り込み実験は、５ｍＭＡＴＰ、８．３ｍＭ未標識のメチオニン、３３２ｍＭソルビトール、５８．３ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、５０μｌ網状赤血球溶解物翻訳生成物及びＬ．ｓａｔｉｖａ由来の完全葉緑体（２００μｇクロロフィル）を含有していた。取り込み混合物を最大光濃度（１５０ワット灯）に設定された光ファイバー照明器の直前で室温において穏やかに振盪した（１０×７５ｍｍのガラス管中）。この取り込み混合物の少量試料（約５０μｌ）を種々の時間において採取し、１１，０００Ｘｇで３０秒間遠心分離することによりシリコーン−油勾配１００μｌ上で分画した（１５０μｌのポリエチレン管中）。これらの条件下で、シリコーン油層の下で、完全葉緑体はペレットを形成し、（網状赤血球を含む）インキュベート培地は表面上に浮遊する。遠心分離の後、シリコーン−油勾配を乾燥氷中で直ちに凍結する。次いで葉緑体ペレットを溶解緩衝液５０〜１００μｌ（１０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭベンズアミジン、５ｍＭｅ−アミノ−ｎ−カプロン酸及び３０μｇ／ｍｌアプロチニン）中に再懸濁し、１５，０００Ｘｇで２０分間遠心分離して、チラコイド膜をペレット化する。この遠心分離から得られた清澄な上清（ストロマタンパク質）及び各取り込み実験に由来の網状赤血球溶解物インキュベート培地を少量、電気泳動のために等容量の２ＸＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合する（レムリ、１９７０）。
【０１０１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、レムリ（１９７０）の方法に従って、３〜１７％（ｗ／ｖ）アクリルアミドスラブゲル（６０ｍｍ×１．５ｍｍ）及び３％（ｗ／ｖ）アクリルアミドスタッキングゲル（５ｍｍ×１．５ｍｍ）中で行なった。このゲルを４０％メタノール及び１０％酢酸を含む溶液中に２０〜３０分間固定する。次いで、このゲルをＥＮ３ ＨＡＮＣＥＴＭ（デュポン製）中に２０〜３０分間浸漬し、ゲル乾燥器上でこのゲルを乾燥する。ゲルを増強スクリーンを使用して一晩露出して放射能写真を撮影し、ＣＰ４ＥＰＳＰＳが単離された葉緑体中に移入されているか否かを測定する。
【０１０２】植物形質転換本発明の実施によってグリホセート耐性を与えられることができる植物は、これらに限定されないが、ダイズ、ワタ、コーン、キャノーラ、脂肪種子ナタネ、アマ、テンサイ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、コムギ、コメ、アルファルファ、及びレタス並びに、種々の木、堅果及びつる植物を包含する。
【０１０３】本発明の二本鎖ＤＮＡ分子（「キメラ遺伝子」）は、いずれの適当な方法によっても１の植物のゲノム中に挿入されることができる。適当な植物形質転換ベクターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミド由来のものの他、例えば、ヘレラ−エストレラ（１９８３）、ビーバン（１９８４）、リー（１９８５）及びＥＰＯ公開第１２０，５１６号（シルペルートら）により開示されたものを含む。ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴｉまたは根誘導（Ｒｉ）プラスミド由来の植物形質転換ベクターに加えて、代替的な方法を使用して本発明のＤＮＡ構造物を植物細胞中に挿入することができる。このような方法は例えば、リポソーム、エレクトロポレーション、遊離ＤＮＡ取り込みを増加させる化学物質、微発射衝撃による遊離ＤＮＡ送達及びウィルスまたは花粉を使用する形質転換の使用を包含する。
【０１０４】クラスＩＩＥＰＳＰＳ植物形質転換ベクタークラスＩＩＥＰＳＰＳＤＮＡ配列は、知られた技術を使用して植物を形質転換することができるベクター中に操作されることができる。下記の説明は、説明のためのものであり、限定の意味において読まれるべきものではない。当業者は、その他のプラスミド、ベクター、標識、プロモーター等を使用して適当な結果を得ることができることを理解するであろう。ＣＴＰ２−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ融合体は、植物ベクターｐＭＯＮ９７９（下記に記載する）中に、ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてクローニングされ、ｐＭＯＮ１７１１０を生成するが、その地図を図１３に示す。このベクター中でＣＰ４遺伝子は、高められたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターから発現される（Ｅ３５Ｓ；ケイら、１９８７）。ＦＭＶ３５Ｓプロモーター構造物（ｐＭＯＮ１７１１６）は下記の方法で完成される：Ｓｐｃ／ＡＡＣ（３）−ＩＩＩ／ｏｒｉＶを含むｐＭＯＮ９７９に由来のＳａｌＩ−ＮｏｔＩ及びＮｏｔＩ−ＢｇｌＩＩ断片並びにｐＭＯＮ１７１１０由来のｐＢＲ３２２／右端／ＮＯＳ３′／ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子部分を、ｐＭＯＮ９８１由来のＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩＦＭＶ３５Ｓプロモーター断片と連結した。これらのベクターをタバコ、ワタ及びキャノーラ中に導入した。
【０１０５】一連のベクターがベクターｐＭＯＮ９７７中で完成され、その中でＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子、ＣＴＰ２−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ融合体及びＣＴＰ３−ＣＰ４融合体は、ＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩ断片としてクローニングされ、それぞれｐＭＯＮ１７１２４、ｐＭＯＮ１７１１９及びｐＭＯＮ１７１２０を生成した。これらのプラスミドをタバコ中に導入した。ＣＴＰ２−ＬＢＡＡＥＰＳＰＳ遺伝子を含むｐＭＯＮ９７７誘導体もまた完成され（ｐＭＯＮ１７２０６）、タバコ中に導入された。
【０１０６】ｐＭＯＮ９７９植物形質転換／発現ベクターは、ｐＭＯＮ８８６中のネオマイシンホスホトランスフェラーゼタイプＩＩ（ＫＡＮ）を、細菌ゲンタマイシン−３−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼタイプＩＩＩ（ＡＡＣ（３）−ＩＩＩ）遺伝子（ヘイフォードら、１９８８）で置換することにより、ｐＭＯＮ８８６（下記に記載する）から得られた。キメラＰ−３５Ｓ／ＡＡ（３）−ＩＩＩ／ＮＯＳ３′遺伝子は、ゲンタマイシン耐性をコードし、それが形質転換された植物細胞の選択を可能にする。ｐＭＯＮ９７９は、高められたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ケイら、１９８７）、いくつかの特異の制限部位及びＮＯＳ３′末端（Ｐ−Ｅｎ−ＣａＭＶ３５Ｓ／ＮＯＳ３′）からなる０．９５ｋｂの発現カセットをも含む。ｐＭＯＮ９７９部分の残りは、ｐＭＯＮ８８６におけるものと全く同じである。
【０１０７】プラスミドｐＭＯＮ８８６は、下記のＤＮＡ部分から構成される。第１は、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ中の選択のための決定基である細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ）をコードするトランスポゾン７から単離された０．９３ｋｂＡｖａＩから操作されたＥｃｏＲＶ断片である。これを形質転換された植物細胞を選択するキメラカナマイシン耐性をコードするＤＮＡの１．６１ｋｂ部分に接合された。このキメラ遺伝子（Ｐ−３５Ｓ／ＫＡＮ／ＮＯＳ３′）は、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタイプＩＩ（ＫＡＮ）遺伝子及びノパリンシンターゼ遺伝子の３′非翻訳化領域（ＮＯＳ３′）（フレイリーら、１９８３）からなる。次の部分は、ＲＫ２プラスミド由来の複製起点を含む０．７５ｋｂｏｒｉ Ｖである。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ中での維持のための複製の起点及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞中への接合転移のためのｂｏｍ部位を提供するｐＢＲ３２２（ｏｒｉ３２２）の３．１ｋｂＳａｌＩからＰｖｕＩ部分に接合される。この次の部分は、ノパリンタイプのＴ−ＤＮＡ右端（フレイリーら、１９８５）を担持するｐＴｉＴ３７由来の０．３６ｋｂＰｖｕＩからＢｃｌＩである。
【０１０８】ｐＭＯＮ９７７ベクターは、ＦＭＶ３５Ｓプロモーターの代りにＰ−Ｅｎ−ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが存在すること以外は、ｐＭＯＮ９８１と同じである。
【０１０９】ｐＭＯＮ９８１プラスミドは、下記のＤＮＡ部分を含む：細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性をコードするトランスポゾンＴｎ７から単離された０．９３ｋｂ断片〔Ｓｐｃ／Ｓｔｒ；Ｅ．ｃｏｌｉ及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ中の選択のための決定基（フリングら、１９８５）〕；０．３５ｋｂカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（Ｐ−３５Ｓ）（オーデルら、１９８５）、０．８３ｋｂネオマイシンホスホトランスフェラーゼタイプＩＩ遺伝子（ＫＡＮ）、及びノパリンシンターゼ遺伝子の０．２６ｋｂ３′非翻訳化領域（ＮＯＳ３′）（フレイリーら、１９８３）からなる、形質転換された組織の選択を可能にする植物表現のために操作されたキメラカナマイシン耐性遺伝子；ＲＫ２プラスミド由来の複製の０．７５ｋｂ起点（ｏｒｉ Ｖ）（スタルカーら、１９８１）；Ｅ．ｃｏｌｉ中の保持のための複製の起点（ｏｒｉ−３２２）及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞中への接合転移のためのｂｏｍ部位を提供するｐＢＲ３２２の３．１ｋｂＳａｌＩからＰｖｕＩ部分並びにノパリンタイプＴ−ＤＮＡ右端領域を含むｐＴｉＴ３７由来の０．３６ｋｂＰｖｕＩからＢｃｌＩ断片（フレイリーら、１９８５）。発現カセットは、ゴマノハグサモザイクウィルス由来の０．６ｋｂ３５Ｓプロモーター（Ｐ−ＦＭＶ３５Ｓ）（ゴウダら、１９８９）及びマメｒｂｃｓ−Ｅ９遺伝子の０．７ｋｂ３′非翻訳化領域（Ｅ９３′）（コルッジら、１９８４及びモレリら、１９８５）からなる。ＦＭＶ３５Ｓプロモーター（図１）を含む０．６ｋｂＳｓｐＩ断片を操作して、適当なクローニング部位を転写開始部位の下流に配置した。ＣＴＰ２−ＣＰ４ ｓｙｎ遺伝子融合体を、植物発現ベクター中に導入して（ｐＭＯＮ９８１を含む、ｐＭＯＮ１７１３１を生成する；図１４）、タバコ、キャノーラ、ジャガイモ、トマト、テンサイ、ワタ、レタス、キュウリ、脂肪種子ナタネ、ポプラ及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ中に形質転換した。
【０１１０】クラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子を含む植物ベクターを、所望の植物種の形質転換のためのいずれかの適当なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株中に起動させることができる。植物ベクターをＡＢＩＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株中に起動させることができる。適当なＡＢＩ株は、無力化されたＴｉプラスミドｐＴｉＣ５８を担持するＡ２０８ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ｐＭＰ９０ＲＫ）である（コンク及びシェル、１９８６）。ＴｉプラスミドはＴ−ＤＮＡ植物ホルモン遺伝子を担持しておらず、従ってその株はクラウンゴール病を引起こすことが不可能である。植物ベクターをＡＢＩ中に交配することは、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を使用する三親接合系により行なった（ジッタら、１９８０）。植物組織をＡＢＩ：：植物ベクター接合物とともにインキュベートした場合には、ベクターが、無力化されたｐＴｉＣ５８プラスミドによりコードされたｖｉｒ作用により植物細胞へ転移する。このベクターは、Ｔ−ＤＮＡ右端領域において開いており、全体の植物ベクター配列を、宿主植物染色体中に挿入することができる。ｐＴｉＣ５８Ｔｉプラスミドは、植物細胞へ転移しないがＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中に保有される。
【０１１１】クラスＩＩＥＰＳＰＳ遊離ＤＮＡベクタークラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子は、直接送達方法により植物中に導入されることができる。多数の直接送達ベクターは、ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子に関して完成された。ベクターｐＭＯＮ１３６４０（その地図を図１５に示す）をここで説明する。プラスミドベクターは、この場合、Ｔｎ９０３に由来のｎｐｔＩＩ遺伝子（カナマイシン耐性；ＫＡＮ）を含むｐＵＣプラスミド（ビエイラ及びメシング、１９８７）に基づき、Ｅ．ｃｏｌｉ中の選択可能な標識を提供する。ＣＴＰ４−ＥＰＳＰＳ遺伝子融合体は、Ｐ−ＦＭＶ３５Ｓプロモーターから発現され、ＮＯＳ３′ポリアデニル化配列断片を含み、及びＥ３５Ｓプロモーター、ＣＴＰ４−ＣＰ４遺伝子融合体及びＮＯＳ３′配列からなる第２のカセットから発現される。計測可能なＧＵＳ標識遺伝子（ジェファーソンら、１９８７）は、マンノピンシンターゼプロモーター（Ｐ−ＭＡＳ；ベルテンら、１９８４）及びダイズ７Ｓ貯蔵タンパク遺伝子３′配列（シュラーら、１９８２）が発現される。ＣＴＰ−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ融合体を高められたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターまたはその他の植物プロモーターから発現される類似のプラスミドをも生成することができる。植物中への遊離ＤＮＡ送達に適したその他のベクターを生成することができ、それらは当業者のレベルの範囲内であり、本明細書の開示の範囲内のものであると考えられる。
【０１１２】植物再生クラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子の発現が形質転換された細胞（またはプロトプラスト）中で行なわれた場合は、細胞（またはプロトプラスト）は植物全体中で再生される。再生工程の方法の選択は不可欠ではないが、適当な方法は、マメ科（アルファルファ、ダイズ、クローバー等）、セリ科（ニンジン、セロリ、アメリカボウフウ）、アブラナ科（キャベツ、ラディッシュ、ナタネ等）、ウリ科（メロン及びキュウリ）、イネ科（コムギ、コメ、コーン等）、ナス科（ジャガイモ、タバコ、トマト、カラシ）、種々の花作物並びにポプラまたはリンゴのような種々の木、堅果作物またはブドウのようなつる植物から選ばれる宿主に対して有用である。例えば、アミラート、１９８４；シマモト、１９８９；フロム、１９９０；バジル、１９９０参照。
【０１１３】下記の実施例は、本発明の実施をより詳しく説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものであるとは決して解釈されてはならない。当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載された方法及び遺伝子に種々の変更及び省略を行い得ることを理解するであろう。
【０１１４】下記の実施例において、植物中のＥＰＳＰＳ活性は、下記の方法によりアッセイした。組織試料を集めて液体窒素中において直ちに凍結させた。若葉組織１ｇを液体窒素とともに乳鉢中で凍結させ、乳棒で微粉末になるように粉砕した。この粉末を第２乳鉢に移し、抽出緩衝液を添加し（１ｍｌ／ｇ）、次いで試料をさらに４５秒間粉砕した。キャノーラ用の抽出緩衝液は、１００ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール、５ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＢＡＭ、５ｍＭアスコルビン酸塩、１．０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ７．５（４℃）から成る。タバコ用の抽出緩衝液は、１００ｍＭトリス、１０ｍＭＥＤＴＡ、３５ｍＭＫＣｌ、２０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭＢＡＭ、５ｍＭアスコルビン酸塩、１．０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ７．５（４℃）をから成る。混合物を遠心分離管に移し、５分間遠心分離した。得られた上清を、０．２５ｍｌづつに分けて、予め抽出緩衝液（ＢＳＡ無し）により平衡化されたスピンＧ−５０（ファルマシア製）カラム上で脱塩処理した。脱塩処理された抽出物を、放射性ＨＰＬＣアッセイによりＥＰＳＰシンターゼ活性をアッセイした。試料中のタンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用するバイオラッドの微量タンパク質アッセイにより測定した。
【０１１５】タンパク質濃度をバイオラッドの微量タンパク質方法を使用して測定した。ＢＳＡを使用して、２〜２４μｇの範囲の標準曲線を作成した。８００μｌの標準試料または希釈試料のいずれかを、濃縮されたバイオラッドのブラッドフォーム試薬２００μｌと混合した。この試料を渦状に回転させ、〜５分後にＡ（５９５）において目盛を読み、標準曲線と比較した。
【０１１６】ＥＰＳＰＳ酵素アッセイは、ＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ）、シキミ酸−３−リン酸塩（２ｍＭ）、ＮＨ４モリブデン酸塩（０．１ｍＭ）及びＫＦ（５ｍＭ）を含み、グリホセート（０．５または１．０ｍＭ）は含むものと含まないものがある。このアッセイ混合物（３０μｌ）及び植物抽出物（１０μｌ）を２５℃において１分間予備インキュベートし、１４Ｃ−ＰＥＰ（１ｍＭ）を添加することによって反応を開始した。この反応を３分後に９０％ＥｔＯＨ／０．１ＭＨＯＡｃ（ｐＨ４．５）５０μｌにより止めた。この試料を６０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた上清をＨＰＬＣにより１４Ｃ−ＥＰＳＰＳについて分析した。グリホセートを用いる場合と用いない場合のＥＰＳＰＳ活性から、耐性ＥＰＳＰＳの百分率を算出した。
【０１１７】１４Ｃ標識されたＰＥＰから１４ＣＥＰＳＰへの転化の百分率を、０．２８Ｍイソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）のリン酸カリウム溶離液（ｐＨ６．５）を使用するＣ１８保護カラム（ブラウンリー）及びＡＸ１００ＨＰＬＣカラム（０．４×２５ｃｍ、シンクロパック）を１ｍｌ／分で用いて、ＨＰＬＣ放射性アッセイにより測定した。初期の速度は、単位時間当りの分割回転に、標識された基質の濃度（１ｍＭ）を掛けることにより算出した。アッセイは、〜３分までの時間及びＥＰＳＰＳの３０％回転に比例していた。試料を必要であれば１０ｍＭトリス、１０％グリセロール、１０ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．５（４℃）により希釈し、比例の範囲内において結果を得た。
【０１１８】これらのアッセイにおいて、ＤＬ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ベンズアミジン（ＢＡＭ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、実質的にグロブリン無し）はシグマ社から入手した。ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）はベーリンガーマンハイムから、及びホスホエノール−〔１−１４Ｃ〕ビルベート（２８ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）はアマーシャムから入手した。
【０１１９】本発明の、配列番号：３若しくは配列番号：５のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が除去され若しくは１以上の他のアミノ酸により置換され又は配列番号：３若しくは配列番号：５のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸が付加されているアミノ酸配列を有する変異体は、それをコードする遺伝子の位置特異的変異など、既に知られている方法により得られるものであって、原酵素と実質的に同程度の酵素活性を有するものである。
【０１２０】本発明のアレル変異体は、同種由来の同一の遺伝子座を占める塩基配列に個体差レベルの変異を有する遺伝子によりコードされているアミノ酸配列を有し、原酵素と同程度の酵素活性を有する蛋白質及びそれと実質的に同じ蛋白質である。
実施例１形質転換されたタバコ植物が、ＥＰＳＰＳの適当な発現を有する上記のＣＰ４ＥＰＳＰＳＤＮＡ配列を含む多数のクラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子ベクターにより産生されている。これらの形質転換された植物は、クラスＩＩＣＰ４ＥＰＳＰＳにより移入されたグリホセート耐性を示す。
【０１２１】タバコの形質転換は、約１月齢の健常な葉組織を利用するタバコ葉ディスク形質転換方法を採用する。１０％クロロックス及び表面活性剤により１５〜２０分間表面を滅菌した後、葉を滅菌水中で３回すすぐ。滅菌紙パンチを使用して、葉ディスクに穴を開け、ＭＳ１０４培地（ＭＳ塩４．３ｇ／ｌ、シュクロース３０ｇ／ｌ、Ｂ５ビタミン５００Ｘ２ｍｌ／ｌ、ＮＡＡ０．１ｍｇ／ｌ及びＢＡ１．０ｍｇ／ｌ）上に裏返しにして置き、１日予備培養する。
【０１２２】次いで、１／５に希釈された（即ち、約０．６ＯＤ）対象ベクターを含む無力化されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＢＩ株の一晩の培養物を植付ける。この植菌は、ディスクを前記培養物とともに遠心分離管に入れることにより行われる。３０〜６０秒後に、液体を排出し、ディスクの水分を滅菌濾紙の間に吸収させる。次いでこのディスクをフィルターディスクとともにＭＳ１０４フィーダープレート上に裏返しにして置き、共培養する。
【０１２３】２〜３日間共培養した後、ディスクを裏返しにしたまま、ＭＳ１０４培地を有する選択プレート上に移す。２〜３週間後に、カルス組織が生成し、個々の塊を葉ディスクから分離する。若枝が茎と区別がつくほど十分に大きくなったら、若枝をカルスから清潔にして切断する。この若枝を、適当な抗生物質耐性の選択対象を有するホルモン無しの根付け培地（ＭＳＯ：ＭＳ塩４．３ｇ／ｌ、シュクロース３０ｇ／ｌ及びＢ５ビタミン５００Ｘ２ｍｌ／ｌ）上に置く。根は１〜２週間で発生する。滅菌しながら、根付いた若枝においていずれの葉カルスアッセイを行うことも好ましい。次いで根付いた若枝を、土中に入れ、高湿度環境中に維持する（即ち、プラスチック製容器または袋）。若枝を周囲湿度条件に徐々にさらすことによって、強化する。
【０１２４】形質転換された植物におけるＣＰ４ＥＰＳＰＳタンパク質の発現タバコ細胞を、天然ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子を含む多数の植物ベクターにより、異なるプロモーター及び／またはＣＴＰのものを使用して形質転換した。遺伝子の発現の予備的証拠は、抗生物質選択された形質転換若枝由来の葉組織がグリホセート上で再カルス生成する能力によって得られた。この場合において、グリホセート耐性カルスは形質転換の後に直接選択された。ＣＰ４ＥＰＳＰＳの発現のレベルは、グリホセート耐性ＥＰＳＰＳ活性のレベル（０．５ｍＭグリホセートの存在下でアッセイした）またはヤギ抗ＣＰ４ＥＰＳＰＳ抗体を使用するウェスタンブロット分析により測定した。ウェスタンブロットは、光度計の記録と精製ＣＰ４ＥＰＳＰＳを使用して得られた標準曲線との比較により定量された。これらのデータを可溶性葉タンパク質の％で示す。多数の形質転換された植物系及び形質転換ベクターから得られたデータを下記表ＶＩに示す。
【０１２５】
【表８】

グリホセート耐性は、形質転換されたタバコ植物中の全体の植物レベルで示された。タバコにおいて、ＣＴＰ２−ＣＰ４ＥＰＳＰＳのＲ０形質転換は、０．４ｌｂ／エーカー（０．４４８ｋｇ／ヘクタール）、即ち、７、１４及び２８日において、それぞれ３、１及び０の割合に応じて対照の非形質転換タバコ植物を殺滅するのに十分な割合、で噴霧され、生長性及び再生性について分析した（表ＶＩＩ）。
【０１２６】
【表９】

実施例２キャノーラ植物をｐＭＯＮ１７１１０、ｐＭＯＮ１７１１６及びｐＭＯＮ１７１３１により形質転換し、グリホセート耐性を示す、形質転換されたキャノーラの植物系を得た。
【０１２７】植物材料Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｃｖ Ｗｅｓｔａｒの種苗をメトロミックス３５０を含む２インチ（〜５ｃｍ）の容器中に定着させた。これらは２４℃、１６／８時間の光周期、４００μＥｍ−２秒−１（ＨＩＤ灯）の光濃度の生長室において生長した。それらに、ピーターズ２０−１０−２０ゼネラルパーパススペシャルの肥料を与えた。２１／２週間後に、これらを６インチ（〜１５ｃｍ）の容器に移植し、１５／１０℃昼／夜温度において、１６／８時間の光周期、８００μＥｍ−２秒−１（ＨＩＤ灯）の光濃度の生長室において培養した。これらにピーターズ１５−３０−１５ハイ−フォススペシャルの肥料を与えた。
【０１２８】形質転換／選択／再生抽薹の直前または抽薹中であるが開花前に、植物から４の頂生節間を除去し、７０％ｖ／ｖエタノール中で１分間、２％ｗ／ｖ次亜塩素酸ナトリウム中で２０分間表面滅菌し、次いで滅菌脱イオン水で３回すすいだ。付着した葉を有する茎を、滅菌前に７２時間まで、湿潤プラスチック容器中に冷蔵してもよい。６〜７の茎部分を、基底端の方向を維持しながら、レドコ植物スライサー２００を用いて５ｍｍディスクに切断した。
【０１２９】Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２４ｍｇ／ｌクロラムフェニコール及び１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含むルリアブロス２ｍｌ中において２４℃で回転器上で一晩生長させた。約９×１０８細胞／ｍｌを与えるようにＭＳ（ムラシゲ及びスクーグ）培地中で１：１０に希釈した。これを６６０ｍｕにおける光学濃度の読みで確認した。茎ディスク（外植片）にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ １．０ｍｌを植付け、過剰分をその外植片から吸引除去した。
【０１３０】この外植片を１／１０Ｘ標準ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％シュクロース、０．８％寒天、ｐＨ５．７、１．０ｍｇ／ｌ６−ベンジルアデニン（ＢＡ）を含むペトリプレート中に基底を裏にして置いた。このプレートに、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％シュクロース、ｐＨ５．７、４．０ｍｇ／ｌｐ−クロロフェノキシ酢酸、０．００５ｍｇ／ｌカイネチンを含む培地１．５ｍｌを重ね、滅菌濾紙で覆った。
【０１３１】２〜３日間共培養した後、外植片を、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％シュクロース、０．８％寒天、ｐＨ５．７、１ｍｇ／ｌＢＡ、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌセフォタキシム、選択の２００ｍｇ／ｌカナマイシンまたは１７５ｍｇ／ｌゲンタマイシンを含む深皿ペトリプレートに移した。７つの外植片を各プレート上に置いた。３週間後に、これらを新鮮な培地へ、各プレート当り５つの外植片として移した。この外植片を、２５℃の連続光（冷白色）の生長室中で培養した。
【０１３２】発現アッセイ３週間後に、若枝を外植片から摘出した。葉再カルス生成アッセイを開始して、Ｒ０ １若枝の変異を確認した。葉組織の３つの小片を、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％シュクロース、０．８％寒天、ｐＨ５．７、５．０ｍｇ／ｌＢＡ、０．５ｍｇ／ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌセフォタキシム及び２００ｍｇ／ｌカナマイシン若しくはゲンタマイシンまたは０．５ｍＭグリホセートを含む再カルス生成培地上に置いた。葉アッセイを外植片と同じ条件下で生長室中でインキュベートした。３週間後に、葉再カルスアッセイの殺草剤耐性（カルスまたは緑色葉組織）または感受性（漂白）についてスコアを付けた。
【０１３３】移植摘出の際に、若枝茎をＲｏｏｔｏｎｅ（登録商標）中に浸し、メトロ−ミックス３５０を含む２インチ（〜５ｃｍ）の容器中に入れ、密閉した湿潤環境中に置いた。これらを、２４℃、１６／８時間の光周期、４００μＥｍ−１秒−２（ＨＩＤ灯）の生長室中に、約３週間の強化期間中置いた。
【０１３４】Ｒ０植物から得られた収穫された種子は、Ｒ１植物を生産するＲ１種子である。Ｒ０植物のグリホセート耐性を評価するために、その子孫を評価する。Ｒ０植物は各挿入位置においてヘミ接合であると考えられるので、自家受粉の結果、Ｒ１最大遺伝子型分離が起こる。各挿入は、連鎖の不在下で優勢対立遺伝子として作用し、１のヘミ接合挿入のみが耐性発現のために要求されると考えられるので、１の挿入が３：１、２の挿入、１５：１、３の挿入６３：１等に分離するであろう。従って、比較的少ないＲ１植物が少なくとも１の耐性表現型を見出すために生長することが要求される。
【０１３５】Ｒ０植物から得られた種子を収穫し、脱穀し、グリホセート噴霧試験において植えられる前に乾燥する。種々の技術を使用して、Ｒ１噴霧評価のために前記植物を生長させた。試験は、グリーンハウス及び生長室の両方で行う。２つの植生系を使用する；３２または３６の細胞を含む〜１０ｃｍの容器または植物トレイ。植生のために使用された土は、メトロ３５０及び３種類の徐放性肥料または植物メトロ３５０のいずれかである。潅水は、グリーンハウスの頭上からかまたは生長室の下潅水とする。肥料は、潅水中に必要に応じて与える。キャノーラに適した温度管理を維持した。１６時間の光周期を維持した。開花が始った時に、植物を〜１５ｃｍの容器に移植し、種子を生成させる。
【０１３６】噴霧「バッチ」は、全て同じ日に噴霧された数組のＲ１子孫からなる。いくつかのバッチは、Ｒ１植物以外の評価を含んでいてもよい。各バッチはまた、形質転換されたと仮定される特定のバッチ内の遺伝子型を発現する噴霧された及び未噴霧の非トランスジェニック遺伝子型を含む。バッチ中にはまた、いくらかの耐性を有すると予め同定された１またはそれ以上の非分離形質転換された表現型が含まれる。
【０１３７】各Ｒ０子孫から得られた２〜６の植物は噴霧されず、グリホセートにより誘導されないいずれの変異性を評価するとともに、グリホセート耐性を比較し測定する対照として作用する。通常植生後１０〜２０日に、その他の植物が２〜４葉の段階に達したときに、研究の対象に応じて、グリホセートを０．２８から１．１２ｋｇ／ｈａの範囲の割合で与える。低容量を使用する少量散用技術が採用されている。実験室用トラック噴霧器に目盛を付けて、畑での条件と等しい量で供給される。
【０１３８】０〜１０の尺度を用いて、生長耐性について噴霧された植物を評価する。この尺度は同じＲ０植物由来の未噴霧の植物との比較である。０は死滅を意味し、１０は未噴霧の植物と可視的な相違がない場合を意味する。０〜１０で数値が高いほど、未噴霧の植物と比較して、損傷が少ないことを示す。処理（ＤＡＴ）後または抽薹まで、７、１４及び２８日目に植物のスコアを付け、Ｒ０植物族内の噴霧された植物の平均スコアに１の傾向が与えられる。
【０１３９】６の整数を使用して、グリホセートから与えられる再生損傷の程度を質的に示す：０：花のつぼみの生長がない２：花のつぼみは存在するが、開花前に発育不全となる４：花は開くが、葯がないかまたは葯が花弁を押し出すことができない６：実りのない葯８：部分的に実りのない葯１０：完全に受粉した花花構造の発育の段階に応じて、開花開始時または少し後に、この尺度を用いて、植物を評価する。
【０１４０】キャノーラにおけるＥＰＳＰＳの表現３週間後に、形質転換したキャノーラ植物をグリホセート耐性ＥＰＳＰＳ活性の存在についてアッセイした（０．５ｍＭのグリホセートの存在下でアッセイした）。結果を下記表ＶＩＩＩに示す。
【０１４１】
【表１０】

次いでキャノーラのＲ１形質転換体を、生長室中で生長させ、０．５６ｋｇ／ヘクタールでグリホセートを噴霧し、生長性を評価した。この結果を表ＩＸＡ〜ＩＸＣに示す。全組織中のグリホセート耐性ＥＰＳＰＳの発現は、これらのトランスジェニック植物中の最適グリホセート耐性遺伝子型を観察することが好ましいことに注意されたい。下記表中に、葉組織に関して得られた発現結果のみを示す。
【０１４２】
【表１１】

【０１４３】
【表１２】

【０１４４】
【表１３】

クラスＩＩＥＰＳＰＳ形質転換体について得られたデータを、同一のプロモーターを使用してＥＰＳＰＳ遺伝子を発現しグリホセート耐性ＥＰＳＰＳ活性のレベルがこの２つの型の形質転換体にとって比較可能であるグリホセート耐性クラスＩ ＥＰＳＰＳ形質転換体と比較してもよい。ｐＭＯＮ１７１１０（表ＩＸＡ）及びｐＭＯＮ１７１３１（表ＩＸＢ）のデータと、ｐＭＯＮ８９９（表ＩＸＣ；ｐＭＯＮ８９９中のクラスＩ遺伝子は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ｛リーら、１９８７｝由来であり、位置１０１のグリシンは、アラニンに変更されている）のデータとの比較は、クラスＩＩＥＰＳＰＳは少なくともクラスＩ ＥＰＳＰＳと同等に良好であることを示している。クラスＩＩＥＰＳＰＳの生長耐性における改良は、クラスＩＩ植物が２倍の割合で噴霧され、Ｒ１植物として試験されることを考慮に入れると明らかである。
【０１４５】実施例３ダイズ植物をｐＭＯＮ１３６４０（図１５）ベクターにより形質転換し、グリホセート耐性を発現する形質転換された多数のダイズの植物系を得た。
【０１４６】ダイズ植物をクリストウら（１９８８）に記載された粒子ガン技術を用いる微発射方法を使用して、ｐＭＯＮ１３６４０により形質転換した。Ｒ０植物から収穫した種子は、Ｒ１植物を生産するＲ１種子である。Ｒ０植物のグリホセート耐性を評価するために、その子孫を評価する。Ｒ０植物は、各挿入位置においてヘミ接合であると考えられるので、自己受粉の結果、Ｒ１に最大遺伝子型分離が起こる。各挿入は、連結の不在下で優勢対立遺伝子として作用し、１のヘミ接合挿入のみが耐性発現のために必要であると考えられるので、１の挿入が３：１、２の挿入、１５：１、３の挿入６３：１等に分離するであろう。したがって、比較的少ないＲ１植物が少なくとも１の耐性表現型を見出すために生長することが要求される。
【０１４７】Ｒ０ダイズ植物由来の種子を収穫し、グリホセート噴霧試験のために植生する前に乾燥する。種子をメトロ３５０を含む４インチ（〜５ｃｍ）の四角形の容器に植える。各Ｒ０植物由来の２０の種苗が試験のために適当であると考えられる。植物をグリーンハウス環境に維持し生長させる。１２．５〜１４時間の光周期並びに昼３０℃及び夜２４℃の温度を調節する。水溶性のピーターズピートライト肥料を必要に応じて与える。
【０１４８】噴霧「バッチ」は、全て同じ日に噴霧を受けた数組のＲ１子孫からなる。いくつかのバッチはＲ１植物以外の評価を含んでいてもよい。各バッチはまた、形質転換されたと仮定される特定のバッチ中の遺伝子型を発現する噴霧されたまたは未噴霧の非トランスジェニックの遺伝子型を含む。１のバッチ中には、予めいくらかの耐性を有すると同定された１またはそれ以上の非分離の形質転換された遺伝子型が含まれる。
【０１４９】各個々のＲ０子孫由来の１〜２の植物には噴霧せず、グリホセートにより誘発されないいずれかの変異を評価するとともに、グリホセート耐性を比較、測定する対照として作用する。通常植生後２〜３週間目に、その他の植物が第１の第三葉期に達した時に、グリホセートをＲｏｕｎｄｕｐ（登録商標）１２８ｏｚ．／エーカー（８．８９５ｋｇ／ｈａ）に等しい割合で処理する。実験室用トラック噴霧器に目盛を施してこれらの条件と等しい割合で排出させる。
【０１５０】０〜１０の生長スコアを使用する。このスコアは、同一のＲ０植物に由来する無噴霧の子孫との比較である。０は死滅を意味し、１０はその未噴霧の植物と可視的には相違がない場合を示す。０〜１０の間で数値が大きいほど、未噴霧植物と比較して損傷が少ないことを示す。処理（ＤＡＴ）後、７、１４及び２８日目に植物のスコアをつける。１組の形質転換されたダイズ及び対照のダイズの分析から得られたデータを表Ｘに記載するが、ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子がダイズにもグリホセート耐性を与えることを示している。
【０１５１】実施例４ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子を使用して、グリホセートを含む培地上で形質転換された植物材料を直接選択することができる。形質転換された植物材料を選択し、同定する能力は、ほとんどの場合、正常に阻害する物質の存在下で形質転換された組織の優先的及び連続的生長を可能にする優勢の選択可能な標識の使用に応じて決定される。抗生物質耐性及び殺草剤耐性遺伝子は、対応する抗生物質または殺草剤の存在下でのそのような優勢の選択可能な標識遺伝子としてほとんど排他的に使用されている。ｎｐｔＩＩ／カナマイシン選択スキームは、多分もっとも頻繁に使用されるものである。ＣＰ４ＥＰＳＰＳは、形質転換された植物を生産し同定するための有効でしかも多分優れた選択可能な標識／選択スキームである。
【０１５２】このスキーム中で使用することができる植物形質転換体は、ｐＭＯＮ１７２２７（図１６）である。このプラスミドは、上記のその他のプラスミドの多くと似ており、このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ中で複製させ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 中に導入させ複製させることを可能にする上記の細菌レプリコンシステム及び細菌選択可能な標識遺伝子（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ）から実質的になり、Ｔ−ＤＮＡ右端及び左端の間には、ＦＭＶ３５Ｓプロモーター−Ｅ９３′カセット中のＣＴＰ２−ＣＰ４合成遺伝子が存在する。このプラスミドはまた、端間及び発現カセットの外側に存在する多数の制限酵素のための単一部位を有する。これは、その他の遺伝子及び遺伝子要素を、植物への導入のためのベクターに容易に付加することを可能にする。
【０１５３】グリホセート上で形質転換された植物を直接選択する方法をタバコについて簡単に説明する。外植片を実施例１において説明したものと同じ標準方法により予備培養するために準備する：１月齢のタバコ植物から得られた葉の表面滅菌（１０％クロロックス及び表面活性剤中で１５分間；３Ｘ脱イオン水で洗浄）；外植片を均一の組織型にするために葉の端部、中央脈、先端及び葉脈端を除去して、０．５×０．５ｃｍの四角形に切断する；外植片をＭＳ１０４プレート及び２ｍｌ４ＣＯＯ５Ｋ培地上に一枚ずつ、裏返しにして置き、表面を湿潤する；１〜２日間予備培養する。外植片に４ＣＯＯ５Ｋ培地により１．２×１０９細菌／ｍｌの力価に調節された植物形質転換プラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの一晩の培養物を使用して、植菌する。外植片を遠心分離管中に入れ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を添加し、細菌と外植片の混合物を最大の設定で２５分間「フォルテックス」し、細菌の浸透を均一にする。この細菌を流出させ、外植片を乾燥滅菌濾紙層間に置いて吸収して、過剰の細菌を除去する。濾紙で吸い取った外植片をＭＳ１０４プレート、２ｍｌ４ＣＯＯ５Ｋ培地及びフィルターディスク上に裏返しにして置く。共培養を２〜３日間行う。この外植片をＭＳ１０４、カルベニシリン１０００ｍｇ／ｌ及びセフォタキシム１００ｍｇ／ｌに３日間移す（遅延期）。次いでこの外植片を、ＭＳ１０４、グリホセート０．０５ｍＭ、カルベニシリン１０００ｍｇ／ｌ及びセフォタキシム１００ｍｇ／ｌに選択期のために移す。４〜６週間目に、若枝をカルスから切除し、ＭＳＯ及びカルベニシリン５００ｍｇ／ｌ根付け培地上に置く。３〜５日間で根が生成するが、その時に葉片を根付いたプレートから採取して、グリホセート耐性及び材料が形質転換されたことを確認することができる。
【０１５４】これらの形質転換された組織中のＣＰ４ＥＰＳＰＳタンパク質の存在は、葉ディスクの免疫ブロット分析によって確認されている。ｐＭＯＮ１７２２７を使用する１の実験から得られたデータを以下に示す：４００の外植片からグリホセート上で生成された１３９の若枝にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＢＩ／ｐＭＯＮ１７２２７を植菌する；これらのうち９７がグリホセート上での再カルス生成についてプラスであった。これらのデータは、１００の外植片につき２４の形質転換率を示し、本方法が植物にとって非常に効率的で省時間型の方法であることを意味する。同様の形質転換頻度がｐＭＯＮ１７１３１についても得られており、ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子を使用するグリホセート上の形質転換体の直接的な選択は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、ジャガイモ、トマト、ワタ、レタス及びテンサイを含むその他の植物種についても示されている。ｐＭＯＮ１７２２７プラスミドは、その他の遺伝子のクローニング及びそれらの遺伝子の植物中への導入を促進するために、ＣＰ４グリホセート選択領域とベクターの左端との間に単一の制限酵素認識分割部位（ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ及びＢｓｔＸＩ）を有している。
【０１５５】実施例５ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子は、ブラックメキシカンスウィート（ＢＭＳ）コーン細胞中に導入されており、タンパク質及びグリホセート耐性の発現がカルス中で検出されている。
【０１５６】このプラスミドの骨格は、高複写プラスミドｐＵＣ１１９の誘導体である（ビエラ及びメシング、１９８７）。複製の起点を含む１．３ＫｂＦｓｐＩ−ＤｒａＩ ｐＵＣ１１９断片を、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタイプＩＩ遺伝子を含むｐＫＣ７に由来の１．３ＫｂＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを充填された断片（ラオ及びロジャーズ、１９７９）に融合し、細菌カナマイシン耐性を与えた。このプラスミドは、−９０〜−３００領域の重複を有する０．６ｋｂのカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５ＳＲＮＡプロモーター（ケイら、１９８７）、５′非翻訳化リーダー領域中のトウモロコシ遺伝子由来のイントロンを含む０．８ｋｂ断片、次いでポリリンカー及びノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子由来の３′終結配列（フレイリーら、１９８３）を含む単子葉植物発現カセットベクターを構築するために使用した。細菌ＣＰ４ＥＰＳＰシンターゼのための１．４Ｋｂコード配列にフレームにおいて融合されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＥＰＳＰシンターゼ由来の３００ｂｐ葉緑体トランジットペプチドを含む１．７Ｋｂ断片を、イントロンとＮＯＳ終結配列の間のポリリンカー内の単子葉植物発現カセット中に挿入し、プラスミドｐＭＯＮ１９６５３を生成した（図１７）。
【０１５７】ｐＭＯＮ１９６５３ＤＮＡを、ＥＣ９、トウモロコシアセトラクテートシンターゼ遺伝子のスルホニル尿素耐性体を含むプラスミドとともに、共衝撃によりブラックメキシカンスウィート（ＢＭＳ）細胞中に導入した。各プラスミド２．５ｍｇをタングステン粒子上に被覆し、文献記載（クラインら、１９８９）の方法と実質的に同じ方法によりＰＤＳ−１０００粒子ガンを使用して対数期のＢＭＳ細胞中に導入した。形質転換体を２０ｐｐｂ クロロスルフロンを含むＭＳ培地上で選択する。クロロスルフロン上の初期の選択の後、カルスをウェスタンブロットにより直接アッセイすることができる。グリホセート耐性は、カルスを５ｍＭのグリホセートを含む培地に移すことによって評価することができる。表ＸＩに示されるように、ＣＰ４遺伝子はグリホセート耐性をコーンカルスに与える。
【０１５８】
【表１４】

コーンカルス中のＣＰ４ＥＰＳＰＳ発現を測定するために、下記の方法を使用した：ＢＭＳカルス（３重量ｇ）を真空下で濾紙（ワットマン＃１）上で乾燥させ、再重量計測し、抽出緩衝液（５００μｌ／ｇ乾燥重量；１００ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール）を添加した。この組織を２．８電力設定して３０秒間フィートンのオーバーヘッド撹拌器を使用して均質化した。遠心分離後（３分間、エッペンドルフの遠心分離機）、上清を除去し、タンパク質を定量した（バイオラッドのタンパク質アッセイ）。試料（５０μｇ／ウェル）を、ＣＰ４ＥＰＳＰＳ標準（１０ｎｇ）とともにＳＤＳＰＡＧＥゲル（ジュール、３〜１７％）上に充填し、電気泳動に付し、上記記載の方法（パドジェット、１９８７）に類似の方法によりニトロセルロースに移した。ニトロセルロースブロットをヤギ抗ＣＰ４ＥＰＳＰＳＩｇＧによりプローブし、Ｉ−１２５タンパク質Ｇにより展開した。放射性ブロットを放射能写真により可視化した。結果をＬＫＢウルトラスキャンＸＬレーザー濃度計を使用する濃度測定により定量し、下記表Ｘ中に示す。
【０１５９】
【表１５】

クラスＩ ＥＰＳＰＳの発現における改良は、より強い植物プロモーターを使用して、より優れた３′ポリアデニル化シグナル配列を使用して、リボソーム充填及び翻訳開始の開始コドンの回りの配列を最適にして遺伝子を発現することにより、またはこれらのまたはその他の表現または調節配列若しくは因子を組合せることによって達成することができる。所望の植物を、その他のグリホセート耐性ＥＰＳＰＳ遺伝子またはグリホセートを分解することができる遺伝子と共に、クラスＩ ＥＰＳＰＳ遺伝子により形質転換して、形質転換された植物のグリホセート耐性を高めることも有益である。
【０１６０】上記の記載から、本発明は、明白で本発明に固有である効果を伴って、本明細書において上記した全ての目的を達成するために採用される１の発明であることが明らかとなるであろう。
【０１６１】いくつかの特徴及びサブコンビネーションが有用であり、その他の特徴及びサブコンビネーションに関係なくそれらを採用することができることが理解されるであろう。これは本発明の特許請求の範囲によって意図され、含まれるものである。
【０１６２】本発明の多くの可能な具体例を特許請求の範囲から離脱せずに作ることができるので、本明細書中に開示され、または添付の図面に示される全ての事柄は、説明のためのものであり、限定する意図はないと解釈されたい。
【０１６３】実施例６ＬＢＡＡクラスＩＩＥＰＳＰＳ遺伝子を植物中に導入し、また、グリホセート耐性を害する。ｐＭＯＮ１７２０６により形質転換されたタバコに関するデータを表ＸＩＩＩ中に示す。
【０１６４】
【表１６】

【０１６５】
【表１７】

【０１６６】
【表１８】

【０１６７】
【表１９】










【０１６８】
【配列表】
【０１６９】
【化１】
【出願人】 【識別番号】５９０００４５６７
【氏名又は名称】モンサント カンパニー
【出願日】 平成３年８月２８日（１９９１．８．２８）
【代理人】 【識別番号】１０００６２００７
【弁理士】
【氏名又は名称】川口 義雄
【公開番号】 特開２００１−１９７８４１（Ｐ２００１−１９７８４１Ａ）
【公開日】 平成１３年７月２４日（２００１．７．２４）
【出願番号】 特願２０００−３４５３８４（Ｐ２０００−３４５３８４）