トップ :: G 物理学 :: G01 測定;試験




【発明の名称】 自己抗体検出用試薬及び検出方法
【発明者】 【氏名】窪田 良

【氏名】小澤 安則

【氏名】片桐 慶子

【氏名】柴田 昌夫
【要約】 【課題】自己免疫疾患のマーカーとなる新規な自己抗体の検出方法の提供。

【解決手段】本発明は、ミオシリンを認識する自己抗体の検出用試薬、検出方法、並びに自己免疫疾患の検出方法を提供する。抗ミオシリン抗体は、橋本病やバセドウ病のような自己免疫性内分泌疾患等で高い陽性率を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】ミオシリン、またはその断片を含む自己抗体検出用試薬。
【請求項２】次の工程を含む、自己抗体の検出方法。
ｉ）生体試料をミオシリン、またはその断片と接触させる工程ｉｉ）ミオシリン、またはその断片に結合する抗体を検出する工程【請求項３】ミオシリン、またはその断片を含む自己免疫疾患の診断剤。
【請求項４】自己免疫疾患が、自己免疫性の内分泌疾患である請求項３の診断剤。
【請求項５】自己免疫性の内分泌疾患が、甲状腺疾患である請求項４の診断剤。
【請求項６】生体試料中に含まれるミオシリンを認識する抗体を検出することにより、自己免疫疾患を検出する方法。
【請求項７】ミオシリン、またはその断片を含む自己抗体の吸収剤。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は自己免疫疾患、自己免疫現象の予知、診断、経過観察等に利用される抗ミオシリン抗体の検出用試薬及び抗ミオシリン抗体の検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】自己免疫疾患(autoimmune disease)は、自己抗体や自己抗原感作リンパ球によって引き起こされる疾患である。免疫機能は本来ならば外来抗原を認識するが、なんらかの原因により自己に対して免疫作用が及んで障害をもたらすとき、自己免疫疾患が成立する。一般には、自己抗体の存在が病変の成立と密接に関連していると考えられる疾患が、自己免疫疾患と呼ばれている（免疫学辞典、東京化学同人、1993.11/15発行）。
【０００３】以下に代表的な自己免疫疾患と、その患者血清中に観察される自己抗体が認識する抗原を示した。なお以下に示した自己免疫疾患のうち、橋本病やバセドウ病は甲状腺組織に対する自己抗体を特徴としているのに対して、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、あるいは自己免疫性溶血性貧血のような自己免疫疾患は全身性の抗原を認識する自己抗体によって特徴付けられる。このような特徴に基づいて、前者は臓器特異的な自己免疫疾患、後者を全身性自己免疫疾患と呼ぶことができる。
【０００４】
橋本病 サイログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼバセドウ病 サイロトロピン受容体重症筋無力症 アセチルコリン受容体インスリン依存性糖尿病 膵ランゲルハンス島全身性エリテマトーデス DNA慢性関節リウマチ IgG自己免疫性溶血性貧血 赤血球膜抗原【０００５】また自己抗体が直接機能障害にかかわっている疾患は、２型アレルギー性の自己免疫疾患とされている。２型アレルギーに対して、自己抗体と抗原との免疫複合体が標的組織への沈着を通じて機能障害の原因となる場合には、３型アレルギーとして区別されている。全身性エリテマトーデスは、３型アレルギーの代表的な疾患である。更に自己免疫性のT細胞によって組織が障害を受ける場合には、４型アレルギーとして区別されている。たとえば自己免疫性のインスリン依存性糖尿病は、４型アレルギーとされている。
【０００６】従来これらバセドウ病を始めとする内分泌系の組織を傷害する自己免疫疾患の検査としては、甲状腺疾患であれば抗サイログロブリン抗体、膵臓疾患であれば抗膵島抗体など各臓器に特異的な既知の抗原に対する抗体の検出や、これら臓器から分泌されるホルモンの量を測定することによって診断および病態の把握が行われてきた。特に自己抗体の検出は自己免疫疾患を確定するものであり、治療方針の確立の上からも特に重要なものであった。
【０００７】上記のように、自己免疫が疑われる患者においては既知の抗原に対する自己抗体を検出することによって疾病の診断等が行われていたが、すべての患者においてこれら既知抗原に対する自己抗体が検出されるわけではない。また、患者によって出現する自己抗体の種類は一様でないこと、未知の抗原に対する抗体の検出は不可能であることから、適切な診断、病態の把握には問題を残していた。
【０００８】本発明は、これら自己免疫疾患、特に内分泌系の臓器における自己免疫疾患の適切な診断方法及び診断用試薬を提供するためになされたものであって、本発明者らによって新たに見出された蛋白質「ミオシリン」に対する抗体を検出する方法及び検出用試薬を提供するためになされたものである。
【０００９】ミオシリン(myocilin)は、本発明者らによって遺伝性眼疾患の病因遺伝子として単離された遺伝子がコードする蛋白質である。網膜色素性変性症は遺伝性眼疾患であり、その約２０％については既知の遺伝子の変異との関連が明らかにされている。しかし、残りの約８０％については病因遺伝子は明らかになっていない。他の眼科関連の遺伝子疾患についても、分子生物学的手法によりいくつかの疾患は病因遺伝子が単離され、病体の理解が進んできたが、レーベル先天黒内障、先天性網膜分離症などの疾患については全ての病因遺伝子は見つかっていない。また、黄斑変性症、アッシャー症候群の一部では既知の遺伝子の変異が報告されているが、他の大部分についてはその原因は未知である。
【００１０】本発明者らは、遺伝性網膜眼疾患の病因遺伝子を探るため、ヒト網膜特異的cDNAライブラリーを作製し（窪田 良、工藤 純、真島行彦、清水信義、小口芳久：網膜特異的cDNAのクローニング、厚生省特定疾患網膜脈絡膜萎縮症調査研究班平成５年度研究報告書、13-15、1994）、この中から新たな蛋白質「ミオシリン」をコードする遺伝子を見出した(Biochem Biophys Res Commun, 1998 Jan, 242:2, 396-400、Kubota R.et al. A novel myosin-like protein (myocilin) expressed in the connecting cilium of the photoreceptor：molecular cloning, tissue expression, and chromosomal mapping. Genomics 41：360-369, 1997)。またほぼ同時期にポランスキーらも原発性開放隅角緑内障の原因遺伝子としてTIGR(Trabecular meshwork Inducible Glucocorticoid Response)蛋白の遺伝子を見出し(Stone EM, Fingert JH, Alward WLM, Nguyen TD, Polansky JR, Sunden SLF, Nishimura D, Clark AF, Nystuen A, Nichols BE, Mackey DA, RitchR, Kalenak JW, Craven ER, Sheffield VC：Identification of a gene that causes primary open angle glaucoma. Science 275：668-670, 1997)、緑内障の診断方法として特許出願を行っている（特願平８−５１５３７２）。
【００１１】後にこれらは同一の遺伝子であることが明らかにされた。正式名称はhuman genom organizationにより「ミオシリン」に統一され、現在では「ミオシリン」が一般的な名称として用いられている（以下の文献を参照）。
1) Allingham RR, Wiggs JL, De La Paz MA, et al.: Gln368STOP myocilin mutation in families with late-onset primary open-angle glaucoma [In Process Citation]. Invest Ophathalmol Vis Sci 39:2288-2295, 19982) Alward WLM, Fingert JH, Coote MA, et al.:Clinical Features Associatedwith Mutations in Chromosome 1 Open-Angle Glaucoma Gene (GLC1A). New Engl J Med 338: 1022-1027, 1998【００１２】一方、現在難病として知られる多くの疾患（例えば全身性エリテマトーデス、天疱瘡等）においては何らかの形で自己免疫的機序が関与しているものが多い事も知られていた。自己免疫疾患の中でも橋本病、バセドウ病などの甲状腺疾患は比較的患者数が多く、バセドウ病の患者においても原発性開放隅角緑内障を併発する例が多いことが知られていたが、原発性開放隅角緑内障の原因遺伝子であるミオシリンと、自己免疫疾患の関係については知られていなかった。
【００１３】なお網膜細胞においては、自己抗体によって認識される次のような抗原の存在が知られている。しかし本発明において見出された自己抗体は、これらの公知の抗原とは全く異なるタンパク質を認識するものである。
S抗原（後藤 浩 他、日本眼科紀要,37,156,1987）
IRBP;interphotoreceotor retinoid-binding protein (B.P.Visca, et al. Curr.Eye Res.6,409,1987)PRE;retinal pigment epithelium （加藤 秋成 他、日本眼科紀要,36,243,1985）
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、自己免疫疾患の診断指標とすることができる新規な自己抗体の検出方法、ならびにこの自己抗体の検出に基づく自己免疫疾患の検出方法の提供を課題とする。より具体的には、自己免疫疾患の中でも患者数の多い、自己免疫性の甲状腺疾患（橋本病やバセドウ病）患者の血清中に高率に見出される自己抗体の検出方法の提供を課題としている。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ノーザンブロッティングによって甲状腺にミオシリンの発現が認められたことから、甲状腺疾患とミオシリンの関係を探る中から自己免疫疾患の診断に有用な新たな自己抗体を見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の自己抗体検出用試薬、検出方法、自己免疫疾患の検出方法、そして自己抗体の吸収剤に関する。
【００１６】〔１〕ミオシリン、またはその断片を含む自己抗体検出用試薬。
〔２〕次の工程を含む、自己抗体の検出方法。
ｉ）生体試料をミオシリン、またはその断片と接触させる工程ｉｉ）ミオシリン、またはその断片に結合する抗体を検出する工程〔３〕ミオシリン、またはその断片を含む自己免疫疾患の診断剤。
〔４〕自己免疫疾患が、自己免疫性の内分泌疾患である〔３〕の診断剤。
〔５〕自己免疫性の内分泌疾患が、甲状腺疾患である〔４〕の診断剤。
〔６〕生体試料中に含まれるミオシリンを認識する抗体を検出することにより、自己免疫疾患を検出する方法。
〔７〕ミオシリン、またはその断片を含む自己抗体の吸収剤。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明において、自己抗体を検出するための抗原として用いられるミオシリンは、公知の方法によって得ることができる。すなわち、網膜や甲状腺のようなミオシリン発現組織、あるいはその培養細胞を材料として、ミオシリンを精製することができる。また、これらの組織からミオシリンをコードするcDNAを単離し、適当な発現系に組みこんで組み換え体としてミオシリンを得ることもできる。安価に、そして大量にミオシリンを得ることができることから、組み換え体の利用は望ましい。
【００１８】ミオシリンをコードするcDNAは、pMyocilin-His-tagとしてクローン化されているので、このベクターを増幅することによって得ることができる。あるいは、ミオシリン発現組織から回収したmRNAを鋳型として配列番号：１および配列番号：２に示すようなプライマーを利用しPCRを行うことで増幅することができる。mRNAのみならず、市販の網膜細胞に由来するcDNAライブラリー（クローンテック社など）を鋳型として用いることもできる。いずれかの方法によって増幅されたミオシリンをコードするcDNAを、発現ベクターのクローニングサイトに挿入し、更にこの組み換えベクターで適当な宿主を形質転換することによって、ミオシリン発現細胞とすることができる。
【００１９】ミオシリンを組み換えタンパク質として生産するために用いられる宿主ーベクター系における宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、あるいは動物細胞等が考えられ、宿主に応じたベクターが特定される。ベクターとしては、例えば、大腸菌ではpGEX5X-3（ファルマシア）など、酵母ではpYES2（インビトロゲン）など、昆虫細胞ではpVL1392（インビトロゲン）など、そして動物細胞では pRc/CMV2（インビトロゲン）が挙げられる。ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などが当業者に知られており、これらの方法を用いることが可能である。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法が、物理的方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、ジーンガン(GENEGUN)法、マイクロインジェクション法が挙げられる。また、化学的方法としては、例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、DEAE-Dextran法が挙げられる。
【００２０】宿主内で生産された組換えタンパク質の精製方法としては、公知の方法、例えば、イオン交換カラム、アフィニティーカラム等を利用する方法などが用いられる。また、組み換えタンパク質は、検出や精製の利便のために、例えば、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)やヒスチジンタグ(6×His)などとの融合タンパク質とすることもできる。GSTやHisタグは、これらに対する抗体によって検出や精製を容易に行うことができる。また、Hisタグではニッケルカラムによるアフィニティクロマトグラフィーで精製することもできる。
【００２１】本発明において自己抗体の検出に用いられるミオシリンは、ミオシリンの完全なアミノ酸配列を備えたもののみならず、その抗原決定基を含む断片を利用することもできる。タンパク質抗原の抗原決定基は、少なくとも数個のアミノ酸残基によって構成される場合があるといわれている。したがって、ミオシリンを断片として用いる場合には、自己抗体の抗原決定基となる少なくとも５アミノ酸残基を含むドメインペプチドを抗原として利用することができる。自己抗体が一次構造ではなくタンパク質の立体構造を認識する場合には、単なるドメインペプチドではなく、自己抗体によって認識される立体構造の再現に必要な領域を含む断片とする。
【００２２】ミオシリンは約５００アミノ酸残基からなる分子量約57kDaのタンパク質で、多様な抗原決定基を持つものと推測される。しかし一般的に自己抗体は限られた抗原決定基のみに対して生じることが多いので、当業者は本発明に基づいて臨床的な用途に応じた抗原決定基を容易に選択することができる。たとえば、一次構造によって構成される抗原決定基であれば、ミオシリンのアミノ酸配列に基づいて、２−３アミノ酸残基づつずらした１０アミノ酸残基程度のドメインペプチドを化学的に合成してペプチドライブラリーとし、それを自己免疫疾患の患者血清パネルでスクリーニングすれば、自己抗体が認識するアミノ酸配列を特定することができる。あるいは立体構造に基づく抗原決定基の構造を明らかにするためには、X線を用いた結晶構造解析により抗体が結合するミオシリンのエピトープを決定することが可能である。
【００２３】ミオシリンの断片は、ミオシリンを化学的に、あるいはアミノ酸配列特異的なプロテアーゼを用いて酵素的に切断することによって得ることができる。また、必要なアミノ酸配列をコードするDNAを発現させることによって得ることも可能である。本発明に用いるミオシリンは、ヒトに由来するものが望ましいが、自己抗体が交差反応するものであれば、ヒト以外の種に由来するものを利用することもできる。またミオシリンを断片として用いる場合には、複数種の断片を組み合わせて利用しても良い。
【００２４】本発明に基づく自己抗体の検出は、ミオシリン、またはその断片（以下、特に断らない場合には「ミオシリン」はその断片も含むものとする）に、患者に由来する体液試料を接触させることによって行うことができる。ミオシリンに結合する自己抗体は、公知のイムノアッセイにより検出することができる。具体的には、以下のような方法を挙げることができる。
【００２５】非競合的イムノアッセイ：ミオシリンに結合する自己抗体を、抗ヒト・イムノグロブリン抗体によって検出する。このとき、ミオシリン、あるいは抗ヒト・イムノグロブリン抗体を予め固相化しておくと、未反応成分の除去（一般にB/F分離と呼ばれる）を洗浄によって容易に行うことができるので便利である。たとえば固相化ミオシリンを患者血清に接触後、血清を除去してから抗ヒト・イムノグロブリン抗体を加える。抗ヒト・イムノグロブリン抗体を標識しておけば、自己抗体に比例して固相に結合する標識が増加する。この抗ヒト・イムノグロブリン抗体は、第２抗体と呼ばれる抗体に相当する。抗ヒト・イムノグロブリン抗体として、抗体のクラスを識別しうる抗体を利用すれば、自己抗体をクラス別に検出することもできるミオシリン、試料、および抗ヒト・イムノグロブリン抗体とは、同時に反応させることもできる。ただし血清等の血液試料を用いた場合、未反応成分を除かない状態では自己抗体以外にも多量のイムノグロブリンが存在する。これら反応に無関係なイムノグロブリンによる抗ヒト・イムノグロブリン抗体の消費が、感度の低下につながらないように注意する必要がある。
【００２６】非競合的なイムノアッセイとして、粒子凝集反応やイムノクロマトグラフィーを利用することもできる。粒子凝集反応は、ミオシリン感作粒子が自己抗体によって凝集する現象に基づく検出方法である。一方イムノクロマトグラフィーでは、先に述べた固相化ミオシリンがクロマトグラフ媒体中に存在し、これに対して試料中の自己抗体、そして標識した抗ヒト・イムノグロブリン抗体とを反応させ、更に未反応成分の分離がクロマトグラフ媒体中で反応と並行して行われるように設計される。
【００２７】競合的イムノアッセイ：ミオシリンと抗ミオシリン抗体との免疫学的な反応を、自己抗体が阻害する現象を利用して、自己抗体の検出が可能である。この場合にも、未反応成分の除去を固相を利用して簡便に行うことができる。すなわち、抗ミオシリン抗体と体液試料の存在下でミオシリンと接触させるとき、抗ミオシリン抗体とミオシリンのいずれかを固相化し、他方を標識して用いるのである。B/F分離の後に固相に結合した標識量に基づいて自己抗体の検出が可能である。競合的なイムノアッセイを行う場合、反応成分として用いる抗ミオシリン抗体は、自己抗体と競合するものであればポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体であってもかまわない。
【００２８】抑制的イムノアッセイ本発明による自己抗体の検出には、競合的なイムノアッセイと並んで、抑制的なイムノアッセイを利用することもできる。抑制的イムノアッセイでは、ミオシリンと試料とを接触させた後に、ミオシリン抗体との反応を行う。ミオシリンに対する自己抗体を含まない場合にはミオシリンと抗ミオシリン抗体との反応が阻害されないが、試料中にミオシリンに対する自己抗体が存在すれば阻害をもたらす。具体的には、まず固相化ミオシリンに試料を加え、十分に反応させた後に抗ミオシリン抗体を加える。ミオシリン抗体を標識しておけば、固相に結合した（またはしなかった）標識量を測定することによって自己抗体の存在を確認することができる。あるいは、標識したミオシリンと試料を接触させ、これを固相化した抗ミオシリン抗体と接触させるという方法も可能である。特にイムノクロマトグラフィーに応用する場合には有利な方法である。
【００２９】これらのイムノアッセイにおいて、体液試料としては、全血、血清、あるいは血漿といった血液試料のほか、唾液、髄液、関節液、あるいは尿のような血液以外の体液試料を用いることもできる。一方、イムノアッセイに用いる標識には、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、補酵素、あるいはラジオアイソトープ等が知られている。中でも、アルカリホスファターゼやパーオキシダーゼのような酵素標識は、安全性や経済性に優れ、しかも必要な感度を比較的容易に達成できることから、有利な標識成分である。抗ヒト・イムノグロブリン抗体やミオシリンのような反応成分は、これらの標識成分によって直接標識することもできるし、あるいは更にこれらの成分を認識する抗体やアビジン−ビオチン系などを利用して間接標識することもできる。ミオシリンや各種の抗体を固相に結合させるには、マイクロプレート、プラスチックビーズ、あるいは合成樹脂微粒子のような固相担体を用い、物理吸着や化学的な結合、あるいはアビジン−ビオチンを用いた間接的な結合方法が一般に利用される。これらの免疫成分を固相化した担体は、ウシ血清アルブミンやスキムミルクなどの不活性タンパク質で処理することによって、非特異的な反応を抑制することができる。なお、固相と酵素標識を組み合わせたとき、このイムノアッセイは特にELISAと呼ばれる。
【００３０】本発明に基づくイムノアッセイに必要なミオシリンや、抗ヒト・イムノグロブリン抗体、あるいは抗ミオシリン抗体は、予め組み合わせた試薬キットとして供給することもできる。試薬キットには、必要に応じて標識の検出に必要な成分や、陽性や陰性の標準試料を組み合わせることもできる。
【００３１】加えて本発明による自己抗体の検出用試薬は、公知の自己免疫疾患のマーカーを検出するための試薬成分を組み合わせた多項目アッセイ用のキットとすることもできる。たとえば、自己免疫性甲状腺疾患の診断を目的とするときには、ミオシリンに加えて、サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム、TSH受容体、あるいは甲状腺ペルオキシダーゼ等に対する自己抗体の検出に必要な試薬成分を組み合わせることもできる。
【００３２】実施例に示すとおり体液中におけるミオシリンに対する自己抗体の存在は、自己免疫疾患のマーカーとなる。したがって、ミオシリンの自己抗体によって自己免疫疾患の検出が可能である。特に甲状腺を中心とする内分泌系の組織に対する自己抗体によって引き起こされる自己免疫性内分泌疾患において、ミオシリンの自己抗体が陽性となるケースが多い。具体的には、橋本病やバセドウ病を示すことができる。このような背景から、ミオシリンを含む自己抗体の検出用試薬は、自己免疫疾患の診断剤として有用である。
【００３３】更に本発明は、ミオシリンを含む自己抗体の吸収剤をも提供する。自己免疫疾患では、自己抗体が疾患の原因となっていることから、自己抗体の吸着除去は疾患の治療方法として期待できる。したがってミオシリンを固定した自己抗体の吸収剤は、ミオシリンに対する自己抗体による自己免疫疾患の治療に有用である。以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
【００３４】
【実施例】１． ミオシリン抗原の作製ヒトミオシリンのアミノ酸配列を配列番号：７に示す。ミオシリン遺伝子の全塩基配列は既に文献(Biochemical and Biophysical Research Communications 242, 396-400(1998))に記載されている。この塩基配列からなるcDNAを挿入したベクターpMyocilin-His-tagを用い、ミオシリン抗原をヒスチジンタグとの融合タンパク質として発現させた。pMyocilin-His-tagは、以下のような操作に基づいて本発明者によって作製されたものである。すなわち、以下のプライマーを用いて増幅したPCR産物をBamHI/HindIII double digestionし、同様の酵素で切断したベクターpEGFP-N3（クローンテック社製）に挿入することによって構築した。
HindIII MYOCF CCCAAGCTTAAGCCTCTGCAATGAGGTTCTTC：配列番号：３BamHI MYOCR CCCGGATCCCATCTTGGAGAGCTTGATGTCA：配列番号：４【００３５】トランスフォーメーションを行い得られたプラスミドの塩基配列を決定して目的のDNAがクローニングされていることを確認した。続いてpEGFP-N3/Myocilin(full length)をもとに、myocilin遺伝子のc末端ヒスチジンタグを付加したコンストラクト(pMyocilin-His-tag)を作製した。すなわち、上記のプラスミドのBamHI/NotI double digestion断片に、以下の配列からなるオリゴヌクレオチドをアニールさせた２本鎖オリゴヌクレオチドをライゲーションすることによってヒスチジンタグを付加した。
5’-GCAGGATCCCACCACCACCACCACCACTGAGCGGCCGCACC-3’：配列番号：５5’-GGTGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGATCCTGC-3’：配列番号：６ライゲーション後の生成物を再びpEGFP-N3に挿入し、大腸菌に形質転換してクローニングし、目的とするミオシリン−ヒスチジンタグ融合タンパク質発現ベクターpMyocilin-His-tagを得た。pMyocilin-His-tagの構造を図１に示した。pEGFP-N3は、動物細胞、大腸菌のいずれでも増幅および薬剤選択可能であり、強力な発現プロモーターを持つベクターである。もともとGFPが結合した融合蛋白質を作製することを目的としたベクターであるが、pMyocilin-His-tagではヒスチジンタグをコードするオリゴヌクレオチドをライゲーションすることによって、ヒスチジンタグとの融合タンパクをコードするように設計した。
【００３６】１）ミオシリンcDNAの調製大腸菌から抽出したプラスミドに対し、以下の条件でPCRを行った。
（プライマーの設計）
フォワード（myoc-f、配列番号：１）：CGGAATTCCatgaggttcttctgtgcacgttgctリバース（myoc-r、配列番号：２）：ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGGTGGTG（Buffer組成）
H2O 72μLpfu Buffer（×10） 10μLdNTP(2.5mM) 10μL final 250μMmyoc-f(100pmol/mL) 0.5μL final 0.5nMmyoc-r(100pmol/mL) 0.5μL final 0.5nMtemplate plasmid 1μL final 72.4μM(7.24ng/mL)DMSO 5μL final 5%pfu DNA polymarase 1μLtotal 100μL（PCR条件）94℃で５分間反応させた後、94℃で１分、35℃で１分、72℃で２分間反応させ、これを30サイクル繰り返した後、72℃で１０分間反応させ、４℃に冷却した。中間の反応温度は３０サイクルを繰り返す中で35℃〜65℃まで１サイクルごとに１℃づつ変化させた。
【００３７】２）PCR産物の精製PCR産物は１％アガロースゲルで泳動、分離し、分子量を確認して、目的とするDNAをゲルから抽出した。
【００３８】３）ライゲーション精製したDNAをEco RI及びNot Iで切断し、同様に処理したpGEX-5X-3（ファルマシア製）に組み込んだ。組み込みが正常に行われたかどうかはPCRで増幅した後、上記と同じく１％アガロースゲルを用いて電気泳動し、予測される分子量のバンドの有無により確認した。
【００３９】４）Transformation大腸菌(XL-1 Blue)にライゲーション後のpGEX-5X-3の溶液を加え、３０分間氷冷した後４２℃で９０秒間加熱し、再度３０分間氷冷した。４倍量のsoc.培地を加えて３７℃で１時間incubateした後、9,000rpmで１分間遠心し、沈殿を100mLのsoc.培地に再懸濁し、LB培地(Amp(+))に撒いた。各コロニーは5mLのLB培地中３７℃一晩培養した後最終濃度が1mMになるようIPTGを加えて３７℃３時間培養した。
【００４０】培養後の培養液を9,000rpmで１分間遠心し、沈殿物をPBCに懸濁して再度遠心して洗い、沈殿物をSDS-PAGE〜ウエスタンブロットを行って分子量を確認した。SDS-PAGEは12.5%のポリアクリルアミドゲルを用い、還元状態で行った。ウエスタンブロットは抗GST抗体（マウス）と抗マウスIgG抗体（ヤギ）の組み合わせ、および抗ヒスチジンタグ（ウサギ）と抗ウサギIgG（ヤギ）の組み合わせで行った。発現の確認されたコロニーから、ウイザードプラス（プロメガ）を用いてプラスミドを抽出し、ABI PRISM 377 DNA Sequencer（パーキンエルマー）を用いてDNA配列を確認した。
【００４１】２．組み換えミオシリンの精製の確認Transformした大腸菌を９LのフラスコでLB培地中３７℃でODが0.6となるまで培養し、IPTGを最終濃度1mMとなるまで加えて３７℃４時間培養した。菌体は超音波を用いて破砕し、遠心して沈殿物を集め、8M 尿素、10mM イミダゾール/PBSに４℃で一晩攪拌しながら溶解した。溶解液を遠心して上清を0.45μmのフィルターでろ過した後、ニッケルカラムを用いて精製した。上記形質転換体によって発現されるミオシリンは、C末端にHisタグを備えているので、ニッケルカラム吸着画分としてミオシリンを精製することができる。
【００４２】３．ELISA系の構築上記により得た組み換えミオシリン溶液を感作用緩衝液（10mMトリスヒドロキシアミノメタン、6M 尿素、0.05%オクチル-β-グルコシド、pH7.7）に溶解して20mg/mLとし、この液を９６穴マイクロプレート（ヌンク社、マキシソープ）の各ウエルに100μLづつ分注した。これを２〜８℃で一晩静置した後、0.1%NaN3加PBSで洗浄し、ブロッキングバッファー（1% BSA、5%ショ糖、0.1%ポリビニールアルコール、0.1%NaN3を含むPBS）各200μLを加えて室温（２０〜２５℃）で２時間ブロッキングした。
【００４３】４．患者及び健常者血清の測定健常者血清３０例、橋本病患者の血清１０例、バセドウ病患者１０例、慢性関節リウマチ(RA)患者５例を反応用緩衝液で２００倍希釈し、その100μLを組み換えミオシリンを感作したマイクロプレートの各ウエルに添加し、室温（２０〜２５℃）で１時間反応させた。反応液を除き、ウエルを0.1% NaN3加PBSで４回洗浄し、洗浄液を除いてペルオキシダーゼ標識抗ヒト・ヤギIgG（医学生物学研究所製、5,000倍希釈）100μLを添加して再度室温（２０〜２５℃）で１時間反応させた。反応後のウエルを0.1%NaN3加PBSで４回洗浄し、洗浄液を除いて3,3',5,5'テトラメチルベンチジン溶液（MOSS社）を基質として100μL添加した。基質溶液添加後、室温（２０〜２５℃）で３０分間反応させて発色させた後、1.5Nの硫酸を加えて反応を停止し、波長450nmにおける吸光度を測定した。結果は表１、および表２に示した。
【００４４】健常者血清から得た吸光度の平均値＋3SDをカットオフ値としたとき、橋本病患者およびバセドウ病患者の血清は２０例中１２例で陽性となったが、慢性関節リウマチ患者では陽性となった例は見られなかった。なお、実験に用いた橋本病患者血清はいずれもサイログロブリンに対する自己抗体が陽性と判定されたものである。またバセドウ病患者血清は、いずれも甲状腺ペルオキシダーゼに対する自己抗体が陽性と判定されたものである。
【００４５】
【表１】

【００４６】
【表２】
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 橋本病患者 吸光度 バセドウ病 吸光度 RA患者 吸光度 検体 患者検体 検体━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ １ 0.673 １ 0.110 １ 0.112 ２ 0.236 ２ 0.122 ２ 0.109 ３ 0.451 ３ 0.538 ３ 0.997 ４ 0.106 ４ 1.338 ４ 0.101 ５ 0.110 ５ 1.999 ５ 0.103 ６ 0.202 ６ 0.108 ７ 0.099 ７ 0.113 ８ 0.093 ８ 0.118 ９ 0.109 ９ 0.228 １０ 0.307 １０ 0.881━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━【００４７】
【発明の効果】実施例で確認されたとおり、ミオシリンに対する自己抗体は自己免疫疾患の患者で高率で陽性を示す。特に、橋本病やバセドウ病のような自己免疫性内分泌疾患、中でも甲状腺疾患において陽性率が高い一方、健常人、あるいは同じ自己免疫疾患であっても全身性の自己免疫疾患に分類されるRAの患者血清では陽性例は検出されない。このような結果から、ミオシリンは、自己免疫疾患、特に自己免疫性内分泌疾患において、診断や病態把握に有用な新規なマーカーとなることが期待される。自己免疫疾患では、公知の抗原による自己抗体の検出のみでは、充分な診断が困難なケースも現実に生じていることから、新規なマーカーの提供の意義は大きい。
【００４８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING<110> Medical & Biological Laboratories Co.,Ltd.<120> Reagent for detecting an autoantibody, and method for detecting a same.<130> M3-101<140><141><160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.0<210> 1<211> 34<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence<400> 1cggaattcca tgaggttctt ctgtgcacgt tgct 34 <210> 2<211> 34<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence<400> 2ataagaatgc ggccgctcag tggtggtggt ggtg 34 <210> 3<211> 32<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence<400> 3cccaagctta agcctctgca atgaggttct tc 32 <210> 4<211> 31<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized primer sequence<400> 4cccggatccc atcttggaga gcttgatgtc a 31 <210> 5<211> 41<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized histidine-tag sequence<400> 5gcaggatccc accaccacca ccaccactga gcggccgcac c 41 <210> 6<211> 41<212> DNA<213> Artificial Sequence<220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially synthesized histidine-tag sequence<400> 6ggtgcggccg ctcagtggtg gtggtggtgg tgggatcctg c 41 <210> 7<211> 504<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 7Met Arg Phe Phe Cys Ala Arg Cys Cys Ser Phe Gly Pro Glu Met Pro 1 5 10 15 Ala Val Gln Leu Leu Leu Leu Ala Cys Leu Val Trp Asp Val Gly Ala 20 25 30 Arg Thr Ala Gln Leu Arg Lys Ala Asn Asp Gln Ser Gly Arg Cys Gln 35 40 45 Tyr Thr Phe Ser Val Ala Ser Pro Asn Glu Ser Ser Cys Pro Glu Gln 50 55 60 Ser Gln Ala Met Ser Val Ile His Asn Leu Gln Arg Asp Ser Ser Thr 65 70 75 80Gln Arg Leu Asp Leu Glu Ala Thr Lys Ala Arg Leu Ser Ser Leu Glu 85 90 95 Ser Leu Leu His Gln Leu Thr Leu Asp Gln Ala Ala Arg Pro Gln Glu 100 105 110 Thr Gln Glu Gly Leu Gln Arg Glu Leu Gly Thr Leu Arg Arg Glu Arg 115 120 125 Asp Gln Leu Glu Thr Gln Thr Arg Glu Leu Glu Thr Ala Tyr Ser Asn 130 135 140 Leu Leu Arg Asp Lys Ser Val Leu Glu Glu Glu Lys Lys Arg Leu Arg 145 150 155 160Gln Glu Asn Glu Asn Leu Ala Arg Arg Leu Glu Ser Ser Ser Gln Glu 165 170 175 Val Ala Arg Leu Arg Arg Gly Gln Cys Pro Gln Thr Arg Asp Thr Ala 180 185 190 Arg Ala Val Pro Pro Gly Ser Arg Glu Val Ser Thr Trp Asn Leu Asp 195 200 205 Thr Leu Ala Phe Gln Glu Leu Lys Ser Glu Leu Thr Glu Val Pro Ala 210 215 220 Ser Arg Ile Leu Lys Glu Ser Pro Ser Gly Tyr Leu Arg Ser Gly Glu 225 230 235 240Gly Asp Thr Gly Cys Gly Glu Leu Val Trp Val Gly Glu Pro Leu Thr 245 250 255 Leu Arg Thr Ala Glu Thr Ile Thr Gly Lys Tyr Gly Val Trp Met Arg 260 265 270 Asp Pro Lys Pro Thr Tyr Pro Tyr Thr Gln Glu Thr Thr Trp Arg Ile 275 280 285 Asp Thr Val Gly Thr Asp Val Arg Gln Val Phe Glu Tyr Asp Leu Ile 290 295 300 Ser Gln Phe Met Gln Gly Tyr Pro Ser Lys Val His Ile Leu Pro Arg 305 310 315 320Pro Leu Glu Ser Thr Gly Ala Val Val Tyr Ser Gly Ser Leu Tyr Phe 325 330 335 Gln Gly Ala Glu Ser Arg Thr Val Ile Arg Tyr Glu Leu Asn Thr Glu 340 345 350 Thr Val Lys Ala Glu Lys Glu Ile Pro Gly Ala Gly Tyr His Gly Gln 355 360 365 Phe Pro Tyr Ser Trp Gly Gly Tyr Thr Asp Ile Asp Leu Ala Val Asp 370 375 380 Glu Ala Gly Leu Trp Val Ile Tyr Ser Thr Asp Glu Ala Lys Gly Ala 385 390 395 400Ile Val Leu Ser Lys Leu Asn Pro Glu Asn Leu Glu Leu Glu Gln Thr 405 410 415 Trp Glu Thr Asn Ile Arg Lys Gln Ser Val Ala Asn Ala Phe Ile Ile 420 425 430 Cys Gly Thr Leu Tyr Thr Val Ser Ser Tyr Thr Ser Ala Asp Ala Thr 435 440 445 Val Asn Phe Ala Tyr Asp Thr Gly Thr Gly Ile Ser Lys Thr Leu Thr 450 455 460 Ile Pro Phe Lys Asn Arg Tyr Lys Tyr Ser Ser Met Ile Asp Tyr Asn 465 470 475 480Pro Leu Glu Lys Lys Leu Phe Ala Trp Asp Asn Leu Asn Met Val Thr 485 490 495 Tyr Asp Ile Lys Leu Ser Lys Met 500
【出願人】 【識別番号】３９０００４０９７
【氏名又は名称】株式会社医学生物学研究所
【識別番号】５９９０１３５５５
【氏名又は名称】窪田 良
【出願日】 平成１１年１月２８日（１９９９．１．２８）
【代理人】 【識別番号】１００１０２９７８
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志 （外１名）
【公開番号】 特開２０００−２１４１６７（Ｐ２０００−２１４１６７Ａ）
【公開日】 平成１２年８月４日（２０００．８．４）
【出願番号】 特願平１１−２０４５３