白血病抑制因子を用いる胚の増強移植、増殖及び維持

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【発明の名称】	白血病抑制因子を用いる胚の増強移植、増殖及び維持
【発明者】	【氏名】リチャード・チャールズ・フライ【氏名】ロナルド・アレン・パー
【要約】	【課題】胚又は前胚の生存性保護剤を提供すること。【解決手段】白血病抑制因子(ＬＩＦ)を有効成分として使用する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】胚または前胚を移植、イン・ビボ受精および／または遺伝子操作で使用するに先立ってイン・ビトロ培養する培地に添加することにより使用される、ＬＩＦを有効成分とする、胚又は前胚の生存性保護剤。
【請求項２】胚が哺乳動物、鳥または魚起原のものである、請求項２の剤。
【請求項３】哺乳動物がヒトまたは家畜動物である、請求項３の剤。
【請求項４】家畜動物が反芻動物である、請求項４の剤。
【請求項５】ＬＩＦがヒト、ネズミまたは家畜起原のものである、請求項５の剤。
【請求項６】ＬＩＦが反芻動物起原のものである、請求項５の剤。
【請求項７】ＬＩＦが組換えまたは合成ＬＩＦである、請求項５または６の剤。
【請求項８】ＬＩＦが真核細胞で産生されたものである、請求項７の剤。
【請求項９】ＬＩＦが原核細胞で産生されたものである、請求項７の剤。
【請求項１０】ＬＩＦの添加量が約１００単位／mlから約１０,０００単位／mlである、請求項１ないし２３のいずれかの剤。
【請求項１１】ＬＩＦの添加量が約５００単位／mlから約５,０００単位／mlである、請求項１０の剤。
【請求項１２】ＬＩＦの添加量が約１,０００単位／mlから約５,０００単位／mlである、請求項１２の剤。
【請求項１３】胚を培養する培地がＳＯＦおよび／またはＭ２培地である、請求項１の剤。
【請求項１４】ＬＩＦの添加量が約１００単位／mlから約１０,０００単位／mlである、イン・ビトロで動物胚を保持及び／または発育させるための培地用組成物。
【請求項１５】ＬＩＦがヒト、ネズミまたは家畜動物起原のものである、請求項１４の組成物。
【請求項１６】ＬＩＦが反芻動物起原のものである、請求項１５の組成物。
【請求項１７】ＬＩＦが組換え又は合成ＬＩＦである、請求項１４ないし１６のいずれかの組成物。
【請求項１８】組換えＬＩＦが真核細胞で産生されたものである、請求項１７の組成物。
【請求項１９】組換えＬＩＦが原核細胞で産生されたものである、請求項１７の組成物。

【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動物又は哺乳動物胚の増殖及び維持の増強での白血病抑制因子(ＬＩＦ)の用途並びに受胎を増強するための同じものの用途に関する。ＬＩＦは、これまでにイー・コリ及び酵母細胞から組換え形に大量にクローンされ、生成されそして精製された蛋白である(国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ８８／０００９３)。ＬＩＦは、以下の性質を含む因子として定義されて来た。
【０００２】１．白血病細胞の結合分化と共に、骨髄性白血病細胞、例えばＭ１細胞の増殖を抑制する能力、及び【０００３】２．Ｍ１細胞或いはネズミ又はヒトマクロファージの特異的細胞レセプターに結合するためのネズミＬＩＦ又はヒトＬＩＦ(国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ８８／０００９３で定義された)特定の配列を有する分子と競合する能力【０００４】現在のインビボ受精(ＬＶＦ)及び胚移植(ＥＴ)プログラム、特にヒトに於て、に関連する主な困難は、受精胚の移植に「達成される」低成功率である。現在、ヒトＩＶＦプログラムで、移植率は１０％と低く、交替で時々多生児に導く各処理で４受精胎まで用いる現実施に導く。従ってヒトＩＶＦプログラムで移植率を改良する必要がある。同様に家畜、例えばヒツジ、ウシ、ブタ及びヤギでのＩＶＦ及びＥＴ処理で、失われた受精胚及びなされた不成功の処理方法の数を減ずるため出来るだけ高い移植率をもつことが経済的理由から望まれる。さらに、ヒトＩＶＦ方法で、妊娠を確実にするため、１以上の胚のレシピエント動物への移植の実施は希望しない多生児となる。
【０００５】胚移植に関して一つの大きな抑制は、胚を培養培地中に、比較的短期間、多分移植前数時間又は顕微操作後、数日のより長い期間、保持することが必要なことである。
【０００６】哺乳動物胚の増殖において、受精卵は桑実胚及び胚盤胞段階を含む数多くの段階を通過する。胚盤胞段階で、細胞は、栄養外胚葉(これは胎盤の前駆体である)として知られる外細胞層及び内細胞塊(これから全ての好ましい胚が誘導される)を形成する。胚盤胞は透明帯により囲まれ、それは胚盤胞がかえると、続いて失われる。次いで栄養外胚葉の細胞は移植段階で子宮壁と密に接触するようになる。原腸形成による内細胞塊による好ましい胚の形成の前に、全細胞塊は「前胚」として引用しうる。
【０００７】胚死亡率は透明帯から胚盤胞の不完全ふ化及び／又は子宮壁への胚の不成功な移植に、多分、移植前の培養でのそれらの期間に胚幹細胞(ＥＳ)の自然分化に帰されて来た。
【０００８】本発明によりＬＩＦがインビトロ胚培養培地に含まれるとき、ふ化工程が増強され移植に関連する発育変化を受けることにより、増殖段階を完全にする多数の胚に導くことが判った。従ってＬＩＦは胚防御剤である。結果としてＩＶＦ及びＥＴプログラムについての移植率は、インビトロ胚培養培地中、ＬＩＦの使用により有意に改良でき、又、改良される。
【０００９】さらにＬＩＦ含有培地は、胚の生存率が低い、卵母細胞／胚、たとえばインビトロ受精、胚分裂及び核移植で早く操作できる方法に使用するのに適する。ＬＩＦは、又、冷却又は凍冷胚／精液の輸送に用いられた培地への封入にクローニング用全能幹細胞系の生育に重要な適用性を有する。
【００１０】特に指定しない限り、明細書中での「ＬＩＦ」の使用は、合成組換え体又は天然に発生するヒト、ネズミ及び／又は家畜類又は反芻動物ＬＩＦ、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、ロバ及びウマからの、及び他の動物、例えばイヌ、ネコ又はトリ(例えばニワトリ)からの、及びその誘導体又は部分をいう。その誘導体又は部分は、上記ＬＩＦ分子のいずれか１つに含まれる１又はそれ以上の連続的系列のアミノ酸を含み、又、天然又は合成ＬＩＦ分子への又は中での単一又は多重アミノ酸置換、削除及び／又は付加を含む。組換えＬＩＦを調製するための条件は国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ８８／０００９３及びＰＣＴ／ＡＵ９０／００００１に開示されるが、これらの条件の変更及び／又は修飾は用いる宿主細胞により変りうる。これらの変更及び／又は修飾も主題発明の範囲内にある。宿主細胞は真核生物(例えば酵母、哺乳動物、昆虫、植物等)又は原核生物(例えばエセリキア・コリ、バチルス・スピシーズ、シュードモナス・スピシーズ等)細胞でありうる。
【００１１】従って、本発明の一局面は、一又はそれ以上の胚を有する動物の妊娠率を増強する方法を意図し、該方法は、有効量の白血病抑制因子(ＬＩＦ)を含む培地中、十分時間、適当な条件下、胚を維持及び／又は分化させること、次いで胚を動物中に移植することを含む。
【００１２】「妊娠」は、成功した移植及び受精胚インビボの続く増殖の率を意味する。
【００１３】本発明の他の局面は、胚又は前胚をインビトロ培養中維持し、一方、胚移植、ＩＶＦ及び／又は遺伝的操作での使用のため生存度を維持する方法を意図し、その方法は有効量のＬＩＦを含む培地中、十分時間、適当な条件下、該胚を培養することを含む。
【００１４】培養中、胚の生存度を維持するこの方法は、全胚の遺伝的操作を行わせる可能性を有する。このような成功した操作は、現在、生きている胚への実験を実施するのに利用できる限られた量の時間に限定される。
【００１５】方法は、又、現在行なわれている技術に比べて輸送条件下、胚の生存度を維持するのに優れており、胚の保存に有利である。
【００１６】本発明の他の局面は、哺乳動物胚のインビトロ増殖を移植段階に上昇する方法に関し、その方法は、有効量の哺乳動物ＬＩＦを含む培養培地中、インビトロで胚を培養する段階を含む。
【００１７】以下に示すように、胚盤胞の形成前、又は胚盤胞形成前及び後、培養培地中ＬＩＦの封入も、移植と関連した増殖変化を受けることにより増殖段階を含む前胚の数をも増加する。ＬＩＦの添加は、又、培養中、退歩する前胚の数を減ずる。結果として、ＩＶＦ及びＥＴプログラムに対する移植率はインビトロ培養培地中、ＬＩＦの使用により有意に改良できる。
【００１８】「動物胚」は、哺乳動物、例えばヒト、反芻動物及び他の家畜動物及び他の動物、例えば鳥及び魚からの胚を含む最も広い意味で用いられる。主題発明は、インビトロ移植ヒツジ胚により本明細書で例証される一方、本発明は、ヒト、反芻動物及び、例えばウシ、ウマ、ロバ、ヤギ等の動物を含む他の動物又は哺乳動物種の胚の移植でのＬＩＦの使用に及ぶ。
【００１９】又、本発明は、インビトロでの受精及び続く哺乳動物胚の移植に及び、それは、胚を動物又は哺乳動物宿主(ここに「宿主」は適当に受容する雌動物又は哺乳動物として定義される)に移植する前、有効量の哺乳動物ＬＩＦを含む培養培地中、インビトロで培養することを特徴とする。
【００２０】本発明のそのうえの局面は、ＬＩＦ含有培養培地中、インビトロで保持されたＥＳ細胞を用いる公知技術により作られた、非ヒト動物、特にキメラ非ヒト動物又は該動物の遺伝子導入子孫に関する。本発明のこの局面により、ＥＳ細胞は、該ＥＳ細胞が、挿入された付加遺伝物質を有するＬＩＦ含有培養培地中で継代された動物胚から誘導される。意図する遺伝子導入動物は非ヒト哺乳動物、例えば家畜動物及び反芻動物及び家畜を含む。
【００２１】本発明により、「同種」又は「異種」系は、ＬＩＦが誘導された動物が胚が分離された同じ動物(同種)か又は異なる動物(異種)である意味に用いうる。ＬＩＦは自然発生でありうるが好ましくは組換え又は合成ＬＩＦである。ＬＩＦは、ＬＩＦが望ましい効果を有するならば如何なる起原、例えばヒト、マウス又は家畜動物(反芻動物を含む)ＬＩＦでありうる。例えば、１つの動物からのＬＩＦは他の動物からのＬＩＦと同じように活性でないこともありうる。適当な動物から適切なＬＩＦを容易にスクリーンすることは受取人の技量内にある。組換えＬＩＦが用いられる場合は、真核又は原核細胞で生成されうる。
【００２２】本発明は又、有効量のＬＩＦを、動物(例えば哺乳動物)胚を維持する媒体と組合せて含む組成物に向けられる。本発明は、又、１又はそれ以上のヒツジ栄養膜蛋白、インターロイキン１及び／又は２、マクロファージコロニー刺激因子、マウス線維芽細胞３Ｔ３系における因子及び／又はプラスミノーゲンと組合せてＬＩＦを含む胚栄養及び／又は胚防御性質を有する組成物を提供する。上記組成物は、又胚維持培地と組合せうる。
【００２３】本明細書で意図する胚維持媒体はＳＯＦ及び／又はＭ２を含むがこれに限定されない。
【００２４】本発明により用いられるＬＩＦの量は、胚を維持及び／又は分化し、及び／又は受精を増強するのに要するものであり、１００単位／mlないし１０,０００単位／ml、好ましくは５００単位／mlないし５,０００単位／mlで最も好ましくは１,０００単位／mlないし５,０００単位／mlの範囲である。ＬＩＦの単位はＰＣＴ／ＡＵ８８／０００９３に定義される。
【００２５】
【発明の実施の形態】さらに本非限定実施例で本発明を示す。
【実施例】
【００２６】実施例１材料及び方法胚収集４０匹の成熟メリノ雌羊を１４日間０．３gプロゲステロン(リベリナ・アーティフィシャル・ブリーダース、ＮＳＷ)を含むＣＩＤＲで処置し、ＣＩＤＲ使用中止４８時間前、５mgの脳下垂体卵胞刺激ホルモンＦＳＨ－Ｐ(インターベット・オーストラリア・プティ,リミテッド、シドニィ、ＮＳＷ)及び２００国際単位のＰＭＳＧ(筋肉内)(プレグネコール;ヘリオット・アグベット・プティ、リミテッド、メルボルン、Ｖic)の注射(筋肉内)、次いで各１２時間後、減量していく投与量のＦ８Ｈ－Ｐ(４、３、３、２及び１mg)の注射により過排卵した。排卵はＣＩＤＲ使用中止２４時間後ゴナドトロピン－放出ホルモン(ＧnＲＨ;アウスペップ・プリティ、リミテッド、メルボルン、Ｖic)の５０μg注射(筋肉内)により確実にし、それは、ほとんどの雌羊が標識クレヨンと適合した去精雄羊により発情期に検出される時間と一致した。雌羊は、発情８－１２時間後、腹腔鏡により約１００×１０⁶の新鮮な動き得る精子を各子宮角に注入した。精液を４稔性雄羊から集め、リン酸緩衝食塩水(フロウ・ラボラトリーズ、ノース・ライド、ＮＳＷ)中に１に希釈し、媒精前、外界温度に保った。発情６日後、雌羊をバルビツール酸ナトリウムチオペントン(イントラバル;メイ・アンド・ベーカー、フットスクレイ、Ｖic)の注射(筋肉内)により麻酔し、ハロタン(メイ・アンド・ベイカー)及び酸素の混合物により一般的麻酔下に維持した。子宮を中央腹開腹により外部に出し、各角を分岐約１cm下でホレイカテーテル(プロメデイカ・モーラビン、Ｖic)でカニューレした。洗浄媒体を満した２０ml管に付着した２０g針を、子宮卵管接合部に近い子宮の管腔に通した。子宮の各角を洗浄し、媒体プラス胚をホレイカテーテルを経てガラス容器に集めた。胚を４mg／mlマイルスＢＳＡ(ペンテックス・クリスタリン;マイルス・ダイアグノスティックス、カナキー、イリノイズ、ＵＳＡ)を含むＭ２保持培地に集め、処置群に配分前、増殖の健康及び段階に従って、等級づけした。
胚の培養【００２７】胚(健康と評価された１６６及び低品質とされた１７)を無差別に３つの処理群の１つに配分した。処理１の胚(桑実胚又は初期胚盤胞段階で８０健康及び５低品質胚)は、対として(グループ１:n＝３８)又は単一で(グループ２:n＝４７)発情サイクルの６日にレシピエント雌羊に移植する前に５mlのＭ２保持培地中、１－２時間、１０のロットで培養した。グループ３胚(桑実胚又は初期胚盤胞段階で４４健康及び６低品質胚)は移植４８時間前、ＳＯＦ培地中、別々に培養した。ＳＯＦ培養培地の３分割１００μl小滴を３５×１０mmプラスチックペトリ皿に置き、２．５mlパラフィン油(ラブケム、アジャクス・ケミカルズ、アウバーン、ＮＳＷ)で覆った。次いで１つの胚を各小滴中に置き、ペトリ皿を水ジャケットをつけたインキュベーター中に置き、２０％Ｏ₅、５％ＣＯ₂及び７５％Ｎ₂を含むガス体中、３９℃に保った。グループ４胚(桑実胚又は初期胚盤胞で４４健康及び６低品質)は、ヒト組換ＬＩＦを１０００単位１mの割合で培地に加えた以外、グループ３と同様にＳＯＦ培養培地中、４８時間培養した。
【００２８】健康又は低品質(退化)胚、桑実胚、胚盤胞又は移植の孵化胚盤胞段階に達しているものの数を、胚収集、各１２時間後及び発情後８日にレシピエント雌羊に移植する直前の時間に記録した。
培養培地【００２９】用いた新鮮な培地は１０％(v／v)ウシ胎仔血清、ペニシリンＧカリウム塩(０．０６０g／l)及びストレプトマイシン硫酸塩(０．０５０g／l)を含む、トルベッコリン酸緩衝食塩水であった。
【００３０】Ｍ２培養培地(キィン等１９８２)はヘペス緩衝液で置き換え幾らかの重炭酸塩を含む修飾クレープスーリンガー溶液であった。成分は、ヘペス緩衝液(４．９６９g／l)、ＮaＣl(５．５３３g／l)、ＫＣl(０．３５６g／l)、ＣaＣl₂・２Ｈ₂Ｏ(０．２５２g／l)、ＫＨ₂ＰＯ₄(０．１６２g／l)、ＭgＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ(０．２９３g／l)、ＮaＨＣＯ₃(０．３４９g／l)、ペニシリンＧカリウム塩(０．０６０g／l)ストレプトマイシンリン酸塩(０．０５０g／l)、ミリポアＨ₂Ｏで１リットルとするであった。
【００３１】ＳＯＦ培養培地(テルビット等、１９７２)はＮaＣl(６．９５g／l)、ＫＣl(０．５３４g／l)、ＫＨ₂ＰＯ₄(０．１６２g／l)、ＣaＣl₂２Ｈ₂Ｏ(０．２５２g／l)、ＭgＣl₂６Ｈ₂Ｏ(０．１０g／l)、ＮaＨＣＯ₃(２,１０６g／l)、乳酸Ｎa(０．６１６g／l)、ピルビン酸Ｎa(０．０３６２g／l)グルコース(０．２７０g／l)、ＢＳＡ(３２．０g／l)、ペニシリンＧカリウム塩(０．０６０g／l)、ストレプトマイシン硫酸塩(０．０５０g／l)ミリポアＨ₂Ｏで１リットルとする、よりなる。
【００３２】全ての培地は０．２μmフィルター(ミリポア・プティ、リミテッド、リッチモンド、Ｖic)を通して無菌とした。
【００３３】胚移植２００匹の３令雌メリノ羊は１４日ＣＩＤＲ処置で同時性を持たせたそれらの発情周期を有した。４００国際単位ＰＭＳＧの注射をＣＩＤＲ使用中止の時に与えた。引き具及びクレヨンを取り付けた去精した羊を雌羊と共に置き発情期を検定した。発情期に観察した雌羊は無作為に４つのレシピエントグループの一つに配分した。レシピエント雌羊を局所麻酔剤(リグノカイン、リパード・ケミカルズ、ブライトン、Ｖic)で処置し、腹腔鏡を用いて、各卵巣上の黄体の数を記録した。子宮を位置決定し、排卵卵巣と同側の子宮角の先端は２cm中央腹切り口を経て体外に出した。子宮を先端から約４cm穿刺し、ＭＳ保持培地中に置いた胚は、１ml管に付着したトムカットカテーテル(サイズ３．５ＦＲ、リパード・ケミカルズ、ブライトン、Ｖic)を経て保管した。子宮角は腹腔にもどし切り口を縫合した。
【００３４】全てのレシピエント雌羊を引き具を付けた去精雄羊と共に２１日間放牧して移植前又は移植時に胚消失を評価した(エディ、１９６７)。妊娠の７０日に超音波を用いて走査し健康な胎児の数を測定した。
【００３５】分析グループ間の差はカイ二乗分析により測定した。
【００３６】実施例２羊胚の孵化後状態へのインビトロ増殖に対するＬＩＦの効果【００３７】胚培養ＳＯＦ培養培地への１,０００単位／mlのヒト組換えＬＩＦの添加は、４８時間インビトロ培養した健康な桑実胚及び胚盤胞胚の増殖(より桑実胚孵化及び退化少ない)を有意に改良した(表１)。
【００３８】処理グループは共に、胚回収の時に貧弱として初めに分類された６胚を有した。処理期間を越えて、それらの健康は改良されず、それらは廃棄され、レシピエント雌羊に移植しなかった。
【００３９】移植率培養胚をレシピエント雌羊に個々に移植したとき、ＳＯＦ＋ＬＩＦで培養した(グループ４)胚を受ける雌羊の２１日非復帰率(移植率のインディケーター)はＳＯＦのみで胚培養を受ける雌羊(グループ３、表２)のそれより有意に高い。さらにグループ４雌羊の移植率は、２時間の収集以内に単一胚を受けたレシピエント雌(グループ２)と同様であったが、両グループの非復帰率は収集後直ちに移植した２つの胚を有するレシピエント雌(グループ１)のそれより低かった。
【００４０】妊娠の７０日での実時間超音波走査により測定した真の妊娠率は表３に示す。
【００４１】上で得られた結果は、ヒト組換えＬＩＦの培養培地への添加は透明体から「孵化する」羊胚盤胞の数を４倍増加することを示し、又、２０％Ｏ₂、５％ＣＯ₂及び７５％Ｎ₂のふん囲気でＳＯＦ中４８時間培養の間変性する胚の数を減ずる。事実、ＳＯＦ＋ＬＩＦで培養した胚の６４％は、発情期後８日までに孵化し、それはインビボで見られたものと類似する(ロウソン及びモアー、１９６６、ビンドン、１９７１)。ＬＩＦは逆条件下に胚の健康を維持する役割を有しうる。さらに、この培養の間、ＬＩＦ含有培地中、４８時間培養した胚の移植後、レシピエント雌羊の妊娠率は、収集後直ちに胚を受けている雌羊のそれに少くとも等しかった。
【００４２】胚上のＬＩＦのこの安定役割は、４日ネズミ胚上のＬＩＦレセプターの、及び４日妊娠及び偽妊娠マウスの及び子宮内膜腺に強く表われているネズミＬＩＦの局在の最近の報告に一致する。これは、ＬＩＦが胚の存在に対するよりも妊娠に対する受身応答として生成されることを示唆する。従ってＬＩＦは、胚が卵管から子宮に入っている時に生じているように見える。ここでの結果は、ほぼこの時点で報告された胚死亡率の幾つかはＬＩＦの胚への適切な供給により防ぐことができることを示唆する。最近、ヒト及び家畜動物でのほとんどの胚移植プログラムで、一つの胚が各レシピエントに移植し生存妊娠を確実にする。我々の研究は、２胚が各雌羊に移植されるとき、約５０％損失の胚が存在しても(これらの雌の５２％は双子を有し、３７％は１匹で１１％は妊娠しなかった)妊娠率がほとんど４０％高いことを示す。従って、ＬＩＦはこの胚損失の幾らかを防ぎ単一胚の各レシピエント実施の移植を有効になす可能性がある。
【００４３】
【表１】
ＳＯＦ(n＝４２)又はＳＯＦ＋１０００単位／mlＬＩＦ(n＝４４)培地での４８時間培養の間、孵化又は変性する健康な胚の数及びパーセント培養孵化胚変性胚時間ＳＯＦＳＯＦ＋ＬＩＦＳＯＦＳＯＦ＋ＬＩＦ０時間００％００％００％００％１２時間００％３７％２５％００％２４時間１２％１０＊２３％２５％１２％３６時間６１４％１９＊４３％５１１％１２％40－46時間７１６％２８＊６４％１３＊２７％４９％＊はＳＯＦ及びＳＯＦ＋ＬＩＦ処理グループ間の有意差Ｐ＜０．０５を示す【００４４】
【表２】
表２発情期後２１日に種付けを受けている雌羊グループ１グループ２グループ３グループ４ M2中1時間1胚 M2中2時間2胚 SOF中48時間1胚 SOF+LIF中4時間1胚種付けした０１３２６１５種付けせず１９２８１８２７計１９４１４４４２％受けなかった 100^a ６８^b ４１^c ６４^b 異なる上付き文字は有意差(Ｐ＜０．０５)を示す【００４５】
【表３】
表３発情期後７０日でのレシピエント雌妊娠の数グループ１グループ２グループ３グループ４ M2中3時間1胚 M2中3時間2胚 SOF中48時間1胚 SOF+LIF中4時間1胚非妊娠２２０３７２１妊娠１７２２７２１計１９４２４４４２％妊娠８９^a ５２^b １６^c ５０^b 異なる上付き文字は有意差(Ｐ＜０．０５)を示す【００４６】実施例３胚培養及び移植でのＬＩＦの用途羊胚を上述したように発情期後６日にメリノ雌羊から集めた。しかしながら今回はＳＯＦ、ＳＯＦ＋ネズミＬＩＦ又はＳＯＦ＋ヒトＬＩＦで１０日間個々にそして毎日課した発達で培養した。意図はＬＩＦ含有培地で孵化後発達した胚があるか及びどの程度か、例えばインビボ約１０－１２日で起きる発達の拡大胚盤胚又は栄養膜段階に達したかどうかを見ることであった。第二に、培養した羊胚の発達に対するネズミＬＩＦの効果も調べた。
【００４７】胚は実施例１におけると正確に同じ方法でメリノ雌羊から集めた。唯一の違いは、胚が、ＦＳＨがオバーゲンを生成するか水平再生成により供給されたＲＦＳＨ－５０を生成するかにより過剰排卵したことである。処理は以下の通りであった。
グループ１(n＝１９);ＳＯＦのみで個々に培養した胚。
グループ２(n＝１８);ＳＯＦ＋ネズミＬＩＦで個々に培養した胚。
mＬＩＦはマウス幹細胞バイオアッセーにより３５００単位／mlが加え、それはＭ１細胞バイオアッセーを用い約８０００単位／mlに当る。
グループ３(n＝２０);ＳＯＦ＋ヒトＬＩＦ(hＬＩＦ)で個々に培養した胚。hＬＩＦはＭ１細胞バイオアッセーにより５０００単位／mlが加えた。
【００４８】培養条件は、胚発達が日に２回であるよりも毎日評価する点を除き上例と同一であった。大気条件は上記したように即ち２０％Ｏ₂、５％ＣＯ₂及び７５％Ｎ₂であった。
【００４９】結果は表４に示す。
【表４】
処理培養日０１２３４５６７８９１０ SOF 10B 19B 13B 11B 1HB 1HB 19D 9M 6D 8D 9B 5B 9D 13DSOF+ 9B 4M 18B 15B 14B 11B 20DmLIF 9M 14B 3D 4D 7DSOF+ 10B 4HB 4FB 12FB 14FB 14FB 14FB 14FB 12FB 11FB 20DhLIF 10M 16B 9HB 7HB 4HB 2HB 1B 1B 8D 9D 5B 2B 1B 1B 5D 5D 8D 9D 2D 2D 3D 3D 凡例: Ｍ＝桑実胚Ｂ＝胚盤胞ＨＢ＝孵化胚盤胞ＦＢ＝透明帯から自由の胚盤胞Ｄ＝変性胚【００５０】培養３日後、胚は、ＳＯＦ＋hＬＩＦに置いたとき(グループ３)ＳＯＦ(グループ１)又はＳＯＦ＋mＬＩＦ(グループ２)の胚より、有意に発達して孵化するか、透明体から完全に孵化した(Ｐ＜０．０１、カイ二乗)。さらに培養６日後、より少く有意に変性した(Ｐ＜０．０１、カイ二乗)。胚の発達又は生存へのmＬＩＦの有意な効果はなかった。透明体から孵化した胚盤胞は、変性前伸長を開始しなかった。
【００５１】実施例４本実施例は各第２日に胚を新鮮な培地に置き孵化胚盤胞をさらに発達させるように試みる以外実施例２を繰り返す。処理は以下の通りで結果は表５に示す。
【００５２】
【表５】
処理:コントロール－ＳＯＦグループ１－ＳＯＦ＋マウスＬＩＦ(５０００単位／ml Ｍ１バイオアッセーによる) グループ２－ＳＯＦ＋ヒトＬＩＦ(５０００単位／ml Ｍ１バイオアッセーによる) 表５処理培養日０１２３４５６７８ＳＯＦ２Ｂ２Ｂ２Ｂ８Ｄn＝８６Ｍ６Ｍ５Ｍ１ＤＳＯＦ＋３Ｂ８Ｂ１ＨＢ８ＤmＬＩＦ５Ｍ５Ｄn＝８３ＤＳＯＦ＋３Ｂ１ＨＢ２ＦＢ５ＦＢ６ＦＢ６ＦＢ６ＦＢ８ＤhＬＩＦ５Ｍ５Ｂ３ＨＢ１ＨＢ２Ｄ２Ｄ２Ｄn＝８２Ｍ１Ｂ２Ｄ１Ｍ１Ｄ本実験例もhＬＩＦが培養に保持された桑実胚及び胚盤胞の健康を改良したことを示す。孵化胚盤胞は約１mmから２mm成長したが、それらは伸長を開始しなかった。
【００５３】実施例５本実施例の目的は、ＳＯＦ培養培地へのＬＩＦの添加が非常に早い段階の胚を改良するかどうかを調べることであった。
【００５４】本実験例では、胚は、発情期後、種々の時間でドナー雌羊から取り、ＳＯＦ又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(１０００単位／ml)に特定時間培養し、それらの発達は細胞のそれらの数を数えることにより評価した。全ての胚(グループ５のものを除く)は低Ｏ₂圧力(７％)の外気条件で培養し、最も速い段階の胚を通過させて８／１６細胞ブロックとした。胚健康は、スライド上に細胞を塗布し、細胞数を数えることにより評価した。
処理:グループ１、２－４細胞胚を発情期後２日に集め、ＳＯＦ(n＝１０)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝１４)に６日培養した。
グループ２、２－４細胞胚を発情期後２日に集め、ＳＯＦ(n＝１５)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝１８)に２.５日培養した。
グループ３、８／１６細胞胚を発情期後４日に集め、ＳＯＦ(n＝１１)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝９)に２日培養した。
グループ４、桑実胚／胚盤胞を発情期後６日に集め、ＳＯＦ(n＝１９)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝２０)に培養した。
これらの全ての胚は７％Ｏ₂、５％ＣＯ₂、８８％Ｎ₂の特異的大気中で培養した。
グループ５、桑実胚／胚盤胞を発情期後６日に集め、ＳＯＦ(n＝１９)又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(n＝１８)に２日培養した。
これらの胚は２０％Ｏ₂、５％ＣＯ₂、７５％Ｎ₂の大気中で培養した。云い換えればこのグループは、実施例２、３及び４で培養した胚の繰り返しである。
【００５５】
【表６】
結果は表６に示す。
処理平均細胞数(±sem) ＳＯＦＳＯＦ＋hＬＩＦグループ１４１.２± ３.９４６９.１＊± ８.４２グループ２７.４± ０.５２８.５ ± ０.６０グループ３１７.７± １.９４２４.９ ± ５.２０グループ４７５.７±１０.４０８２.７ ±１１.４９グループ５５６.２± ５.９０６２.６＊± ８.４２＊は、グループ間列内(Ｐ＜０．０５)スチュデントt試験、有意差を示す。
要するに、本実験例は培養培地へのhＬＩＦの添加が、それらを最適以下の条件、即ち理想大気条件以下(グループ)又は、改良された大気条件下長時間(グループ１)保持したとき、健康を改良することを示す。
【００５６】実施例６本実施例の目的は、転移培地へのhＬＩＦの添加がレシピエント雌羊の続く移植率を改良するかどうかを測定することである。
【００５７】本実験例では胚は、発情期後６日、過剰排卵したメリノ雌羊から集めた。それらをＳＯＦ又はＳＯＦ＋hＬＩＦ(５０００単位／ml)に置き、採収の１時間以内又は、３９℃で培地中６－８の間保持したのち、レシピエント雌羊に個々の内移植した。胚を培養培地に移植した。妊娠率は、発情期後６５日に超音波走査により確認した。
【００５８】結果は表７に示す。
【表７】
グループ培地培養時間妊娠非妊娠１ＳＯＦ＜１時間２１(５８％a) １５２ＳＯＦ＋ＬＩＦ＜１時間２１(５１％a) ２０３ＳＯＦ６－８時間８(２１％b) ３０４ＳＯＦ＋ＬＩＦ６－８時間２１(５３％a) １９異なる上付き文字は有意差(Ｐ＜０．０１、カイ二乗)を示す。
【００５９】本実験例は、胚が収集後直ちに移植された場合、hＬＩＦが移植率に少し効果を有することを示す。しかしながら、胚が移植前６－８時間培地に保持された場合、それは、極めてしばしばフィールドでの状態である。培地へのhＬＩＦの添加は、さもなければ変性したかもしれない生存胚を維持する。
【００６０】実施例７市販ＥＴプログラムで、２４８レシピエントメリノ又は交配種の雌羊はそれぞれ、Ｍ２又はＭ２＋hＬＩＦ(５０００単位／ml)に保持した２胚を受けた。培養時間は約１から約６－８時間まで変化した。ドナー雌羊はメリノであった。結果を表８に示す。
【００６１】
【表８】
Ｎ２胚１胚非妊娠Ｍ２メリノ１４８４４４０６４交配種２０１０４６計１６８５４(３２％) ４４(２６％) ７０(４２％) Ｍ２＋ＬＩＦメリノ５６２４１２２０交配種４４２４７１３計１００４８(４８％) １９(１９％) ３３(３３％) 胚死亡率Ｍ２＝５５％Ｍ２＋ＬＩＦ＝４３％【００６２】Ｍ２培地へのＬＩＦの添加は、移植率を有意に増加した(Ｐ＜０．０５:カイ二乗)。これはＬＩＦがＥＴプログラムに用いた培地に加えたとき、胚保護剤として、潜在性を有することを示す。この分野の当業者は、本明細書に記載された発明が特に記載されたもの以外に変形及び修飾を受けられることを理解しうるであろう。本発明がかかる変形及び修飾を全て含むことを理解すべきである。本発明は又、本明細書において引用し、又は示した全ての段階、特徴、組成物及び化合物を個々に又はまとめて、又、該段階又は特徴の全ての２又はそれ以上のいかなる、そして全ての組合せをも含む。
【００６３】引例ビンドン、ビー．エム(１９７１)羊における妊娠の前移植段階の組織的研究、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・サイエンシズ２４:１３１－１４７、エディ、(１９６７)ジャーナル・オブ・レプロダクション・アンド・ファーティリティ、１３;４３７－４４３、キン．ピー．バロス．シー．及びヴィッテイングトン．ディ．ジー．(１９８２)ヒト精子の受精能力を検定するためのハムスター卵母細胞の保存、ジャーナル・オブ・レプロダクション・アンド・ファーティリティ、６６;１６１－１６８。ローソン．エル．イー．エイ．及びモア．アール．エム．(１９６６)最初の１４日間のヒツジ胎児の発達ジャーナル・オブ・アナトミィ、１００;７７７－７８５タービット．エイチ．アール．ウイッテイントン．ディ．ジー．及びローソン．エル．イー．エイ．(１９７２)ヒツジ及びウシ卵のインビトロ成功培養、ジャーナル・オブ・レプロダクション・アンド・ファーティリティ、３０;４９３－４９６

【出願人】	【識別番号】５００２０５３８９【氏名又は名称】アムラド・コーポレイション・リミテッド
【出願日】	平成３年７月９日（１９９１．７．９）
【代理人】	【識別番号】１０００６２１４４【弁理士】【氏名又は名称】青山葆（外１名）
【公開番号】	特開２０００－３５０５３４（Ｐ２０００－３５０５３４Ａ）
【公開日】	平成１２年１２月１９日（２０００．１２．１９）
【出願番号】	特願２０００－１３２５６７（Ｐ２０００－１３２５６７）