| 【発明の名称】 |
エゾウコギ細胞培養による幼植物体の大量生産方法及びその幼植物体の保管方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】金 明助
【氏名】金 載▲フン▼
【氏名】呉 承哲
【氏名】卞 景祿
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| 【要約】 |
【課題】エゾウコギ胚発生細胞を液体培地で懸濁培養し、体細胞胚発生過程を通じて幼植物体を大量に培養し得る幼植物体の大量生産方法及びその幼植物体の保管方法を提供することである。
【解決手段】エゾウコギ胚発生細胞をフラスコ容器で懸濁培養し、体細胞胚発生過程を経るか、または空気送り込み装置の取り付けられた生物反応器で培養することにより幼植物体を大量に供給する。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 エゾウコギ（Eleutherococcus senticosus Max）の幼植物体を培養することにおいて、植物生長調節物質が添加されていないＭＳ液体培地で胚発生細胞KCTC 0504BPを継代培養して、均一な体細胞胚に生長させる段階と、前記体細胞胚を空気送り込み型生物反応器に移してから培養して幼植物体を得る段階とから構成されることを特徴とするエゾウコギ幼植物体の培養方法。
【請求項２】 エゾウコギ体細胞胚の継代培養は２〜３週間間隔に継代培養して、均一な魚雷形または子葉形時期の体細胞胚に生長させることを特徴とする請求項１記載のエゾウコギ幼植物体の培養方法。
【請求項３】 体細胞胚は、魚雷形が１〜３ｍｍであり、子葉形が３〜５ｍｍであるものを、生物反応器に移して１０〜１５日間培養することを特徴とする請求項２記載のエゾウコギ幼植物体の培養方法。
【請求項４】 生物反応器への空気は、０．２μｍ以下のフィルタを通過した無菌状態のもので、空気送り込み装置により反応器の下部から供給されることを特徴とする請求項１記載のエゾウコギ幼植物体の培養方法。
【請求項５】 体細胞胚を生物反応器に移し、２５±１℃の温度で培養することを特徴とする請求項１記載のエゾウコギ幼植物体の培養方法。
【請求項６】 エゾウコギ幼植物体を培養することにおいて、エゾウコギ胚発生細胞KCTC 0504BPを液体培地で約２０余日間暗所で懸濁培養して、胚発生細胞を大量に分裂増殖させる段階と、胚発生細胞及び細胞塊を１５０〜３００μｍの目を有する網で濾し、この網を通過した胚発生能を有する細胞が含有された濾液と、網を通過し得なかった細胞塊とを分離する段階と、前記網を通過した胚発生細胞が含有された濾液を前記と同培地に移し同一過程を繰り返し、前記網を通過し得なかった胚発生細胞塊は、植物ホルモンが添加されていない液体培地で懸濁培養して、体細胞胚発生過程により幼植物体を得る段階とからなることを特徴とするエゾウコギ幼植物体の培養方法。
【請求項７】 請求項１または請求項６で得られた大量の幼植物体を０．５〜１．０％のスクロース溶液で洗った後、蒸留水を１．０％の寒天で固形させた培地を含有した使い捨て滅菌ペトリディッシュに生重量約３〜４ｇずつ無菌的に移し、２５±１℃の温度で３〜４日程度培養し、汚染の有無を確認した後、無菌状態のものを識別し８〜１２℃の冷蔵庫に保管することを特徴とする幼植物体の保管方法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はエゾウコギ（Eleutherococcus senticosus Maxまたは Acanthopanaxsenticosus）胚発生細胞（Eleutherococcus senticosus／Embryogenic cells）を液体培地で懸濁培養して、体細胞胚発生過程を通じて幼植物体（seedlingsまたはplantlets）を大量に培養し得る技術を世界最初に開発し、エゾウコギを生食用の食品及びエキスまたは有用成分の抽出用材料として供給する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】エゾウコギは薬用としての価値が高く評価されて、ロシアなどの諸国で自然産エゾウコギの成分分析研究が多く進行されたところ、その効能が卓越したことが立証された。すなわち、エゾウコギには、消炎作用がアスピリンより５倍強いアカント酸（acanthoic acid）、β−シトステロール（β−sitosterol）、エレウテロサイド（eleutheroside）Ａ〜Ｇ、スチグマステロール（stigmasterol）などの有用成分が含有されて、精力増進、高血圧、糖尿、抗癌作用、抗炎症作用、鎮痛解熱作用、神経痛、健康状態平衡維持、生命延長などに薬効が卓越し、その効能が山参に等しいと知られている。とくに、エゾウコギは疲労回復剤の妙薬で、運動選手または精神労働者に大きい効果があると知られている。
【０００３】韓国産エゾウコギは、多くの生理活性があるエレウテロサイドＥ（eleutheroside E）の含量が韓国の土産種ウコギ（Acanthopanax Chilsanensis、Acanthopanax Seoulensis、Acanthopanax Siebololianum、Acanthopanax Koreanmなど）に比べ、１．７〜５．５倍程度多いと報告された（バクホギ、全北大学校博士学位論文、１９９７）。しかし、一般農家でエゾウコギを栽培する場合に要求される気候条件が複雑で種子を結びにくく、挿木も困難で、増殖に多くの難しさがある。また、潅木であるエゾウコギは、根皮及び樹皮を薬用として採取するため、比較的長い栽培期間が必要であり、一旦、根皮及び樹皮を採取すると、その植物体はそれ以上生存し得ないため、薬用としてこれらを得ることは１回に過ぎなくて、繰り返して生産することができない問題点がある。
【０００４】最近、高麗人参の場合には、細胞を培養容器内で大量に培養してサポニンを抽出することに成功し、その培養体を加工しないでそのままで乾燥、粉末化して健康食品として市販している（日本国、日東電工）。また、多くの企業で注目細胞を培養して抗癌成分であるタクソルを抽出している。
【０００５】しかし、これまで、本発明のように、細胞培養により再分化された小植物体を大量に生産し、これを生食用として商品化した例はほとんどないのが実情である。
【０００６】組織培養によるエゾウコギの不精芽発生及び体細胞発生による植物体再分化が報告（Plant Cell Reports 9：514-516, 1991；Korean J Plant Tissue Culture20：216-266, 1993）されたが、これは、寒天培地で小規模でなされたもので、本発明のように、液体培地から胚発生細胞株を確立させた後、これから幼植物体を大量に生産する方法とは異なる。したがって、これまで、エゾウコギを組織培養により大量に生産して健康食品及び健康補助食品として商業化するシステムに関する研究は行われていないのが実情である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、エゾウコギの胚発生細胞（Eleutherococcus senticosus／Embryogenic cells）を植物ホルモンの添加されていないＭＳ（Murashiage and Skoog）液体培地で懸濁培養して増殖させた後、所定サイズの目を有する網で濾し、網を通過した胚発生細胞は培地用として再使用し、網を通過し得なかった細胞塊は、体細胞胚発生過程により大量の幼植物体を得、これを寒天培地に移植し、このエゾウコギ幼植物体を無菌状態の生食用食品及びエキスまたは有用成分抽出用材料として提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため、本発明は、エゾウコギの胚発生細胞を植物生長調節物質が添加されていないＭＳ液体培地で懸濁培養して、均一に成長した魚雷形（約１〜３ｍｍ）または子葉形（約３〜５ｍｍ）の時期の体細胞胚を空気送り込み装置の取りつけられた生物反応装置を用いて、無菌で汚染していない状態の幼植物体を大量に培養する方法を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明は、エゾウコギの胚発生細胞２を、ＭＳ液体培地が入っている三角フラスコで２０日程度懸濁培養（以下、すべてｒｐｍ１００）して約１０倍程度増殖させた後、１５０〜３００μｍのサイズの目を有する網４で濾し、網４を通過した胚発生細胞２（全体生重量の約１／１０）は培養用として再使用する。前記網４を通過し得なかった細胞塊３（全体生重量の約９／１０）は植物ホルモン無添加ＭＳ液体培地が入っている容器で２〜３週間間隔に４〜６回継代培養した場合、体細胞胚５の発生過程により幼植物体６に発達し得る。前記幼植物体は、蒸留水のみを、１．０％の寒天で固形させた培地を含有した滅菌されたペトリディッシュに生重量約３〜４ｇずつ無菌的に移して２５±１℃の温度で３〜４日程度培養し汚染の有無を確認した後、無菌状態のものは製品に包装し、８〜１２℃の冷蔵庫に移して保管する。
【００１０】前記過程で得られた体細胞胚から幼植物体への発生過程は、前記のような懸濁培養による方法以外にも、空気送り込み装置７が取り付けられた生物反応器１によっても可能である。前記生物反応器を用いる場合、幼植物体を得る過程は次のようである。
【００１１】胚発生細胞が前記過程の継代培養を経た後、均一なサイズの魚雷形（約１〜３ｍｍ）または子葉形（約３〜５ｍｍ）の時期の体細胞胚に成長し、前記段階により成長した体細胞胚を、植物生長調節物質が添加されていないＭＳ培地（２％スクロース）が入っている生物反応器に移し１０〜１５日間培養することにより、子葉と根がよく発達した幼植物体に培養することができる。培養は、たとえば、直射光線が当たらないまたは直射光線をすりガラスや障子などで遮断したような明るい場所で、夜には蛍光灯で明るくした条件で行われ得る。前記段階で得られた幼植物体は１〜２Ｌの瓶に移し、滅菌された０．５〜１．０％のスクロース溶液できれいに洗浄し、生重量３〜４ｇずつペトリディッシュに移し、２５±１℃の温度で３〜４日程度培養し汚染の有無を確認した後、無菌状態のものは製品に包装し、８〜１２℃に維持される冷蔵庫に移して保管する。
【００１２】図１および図９に示されているように、本発明に使用される生物反応器１は空気送り込み装置７が取りつけられた空気送り込み型生物反応器である。生物反応器１の容量は体細胞胚の成長状態に応じて任意に選択され、特別な制限はない。なお、本発明でいうところの空気送り込み型生物反応器１とは、空気送り込み装置７によって無菌空気をフィルタ８と通気路９を介して送り、生物反応器１の下部から上部方向へ培地１０の中に気泡１１を発生させ得る生物反応器である。生物反応器１の内部への無菌空気の注入は、前記反応器の外部に連結された空気送り込み装置７により、反応器の下部より行われる。空気送り込み装置７としては、コンプレッサまたは水族館用エアポンプを使用するとよいが、これらに限定されるものではないが、ただ、無菌空気の注入のためには、空気が０．２μｍ以下のフィルタ孔を通過するようにすることが必要である。図９では、１個の生物反応器１を示しているが、複数個の生物反応容器１を並列または直列に連結することもできる。
【００１３】
【実施例】以下、本発明の内容を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明の権利範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【００１４】実施例１ 懸濁培養によるエゾウコギ胚発生細胞（Eleutherococcus senticosus／Embryogenic cells）から大量の幼植物体生産エゾウコギの胚発生細胞（Eleutherococcus senticosus／Embryogenic cells、KCTC0504BP）を３００ｍｌのＭＳ液体培地（３％スクロース、ｐＨ５．８に調整し、１２１℃、１．２気圧下で湿熱滅菌）が入っている１，０００ｍＬの三角フラスコ内で、ｒｐｍ１００、２５±１℃、暗所（dark condition）で約２０日間懸濁培養した。本発明のエゾウコギ胚発生細胞は韓国科学技術院生命工学研究所内遺伝子銀行に１９９８年７月１４日寄託番号KCTC 0504BPで寄託した。胚発生細胞２は前記培養条件で分裂増殖を続けると、細胞が分裂して細胞塊（cell clusters）３をなし（図２参照）、２０日程度培養したとき、約１０倍程度に生重量が増加した。これを２５０μｍの目の網４で濾し（図３および図１０参照）、網４を通過した胚発生細胞２（全体生重量の約１／１０）は新たな培地に移し、先の方法と同じ方法で培養したとき、胚発生細胞２は胚発生能を維持しながら増殖した。したがって、この方法により、胚発生細胞２は永久的に維持及び増殖できる。一方、網４を通過しえなかった細胞塊３（全体生重量の約９／１０）は２，０００ｍＬの植物ホルモン無添加ＭＳ培地が入っている５，０００ｍＬの容器に移し、すりガラスを介して直射光線が当たらない明るい部屋で、夜には蛍光灯で明るくした条件で培養した。細胞塊が大部分球状胚となるまでには約３〜４週間程度が必要であり、これは体細胞胚の発生段階の後期に比べ比較的長い期間である。したがって、３週間後に継代培養すると、細胞塊と球状胚とが混在しているが、これらを均一な時期のものに分けるため、培養容器を１〜２分程度静置した後、球状胚が大部分沈むと、徐々にほかの容器に培地を注いで出す。この際に、培地とともに先に移されるものは軽い細胞塊であり、遅くまで培地とともに残るものは、細胞塊より重い球状胚が大部分である。このように、重力を用いる同調継代培養は、体細胞発生過程で比較的均一な体細胞胚５を一つの容器１２内に集めることができる（図４および図１１参照）。体細胞胚が成熟（子葉期以後）するにつれて、継代培養時、培地の量を幼い体細胞胚期より約１／３と少なくし、継代培養期間を３週間から２週間程度に短縮したときは、薄い黄緑色を呈する幼植物体（または小植物体）６が多く発達した（図５および図６参照。なお、図６は図５の幼植物体６を上方から写した写真である）。液体培地から誘導された幼植物体のうち、子葉と根の生長が良好なものは、蒸留水のみを１．０％の寒天で固形させた培地を含有した使い捨て滅菌ペトリディッシュに生重量３〜４ｇずつ無菌的に移し、２５±１℃の温度で３〜４日程度培養し、汚染の有無を確認した後、無菌状態のものは製品に包装し８〜１２℃の冷蔵庫に移し１ヵ月程度保管し得るので、幼植物体６（図６において、多数の白いひも状のからみあっているように見えるもの）を生食用食品として商品化できる。
【００１５】実施例２ 生物反応器によるエゾウコギ幼植物体の大量生産エゾウコギ（Eleutherococcus senticosus Max）の胚発生細胞を植物生長調節物質が添加されていないＭＳ液体培地で懸濁培養により球状体細胞胚を２〜３週間ごとに継代培養して、均一な魚雷形（約１〜３ｍｍ）または子葉形（約３〜５ｍｍ）の時期の体細胞胚に発達させた。植物生長調節物質が含有されていないＭＳ培地（２％スクロース）が入っている生物反応器で培養して、１０〜１５日目に幼植物体を取り去るため、魚雷形時期の体細胞胚は１０Ｌの空気送り込み型生物反応器で生長させ、魚雷形よりもっと成長した時期の体細胞胚は３〜５Ｌの生物反応器に移して培養した。生物反応器内への無菌空気の注入は、コンプレッサまたは水族館用エアポンプを使用して反応器の下部で供給するように構成されたものを使用した（図１および図９参照）。無菌空気の注入のため、目の大きさが０．２μｍであるフィルタ（Midisart 2000、sartorius）を空気が通過するようにした。体細胞胚を生物反応器に投入する量はそれぞれ１０ｇ（３Ｌ容器）、２０ｇ（５Ｌ容器）、３０ｇ（１０Ｌ容器）程度にした。体細胞胚の培養は２５±１℃の温度で直射光線が当たらない明るい場所で行い、夜には蛍光灯で明るくした。このような条件で約１０〜１５日程度培養したとき、生食用及び有用成分抽出用材料として用いることができる幼植物体６が発達した。図７において、じょうご状に見える塊全体が、生食用および有用成分抽出用材料として用いることができる発達した幼植物体６である。魚雷形時期のものは、生物反応器で約１０〜１５日間培養したとき、生重量が約４０倍増加し、子葉形時期のものは約２０倍程度増加した（図８参照）。
【００１６】魚雷形時期の体細胞胚が幼植物体となる期間は、生物反応器で培養したとき、１０〜１５日であり、懸濁培養で培養したとき、約３０日であるので、生物反応器で培養することが懸濁培養に比べ、期間が約１／３〜１／２程度に短縮された。
【００１７】実施例３ 生物反応器で生産されたエゾウコギ幼植物体の貯蔵生物反応器で得られた幼植物体は１〜２Ｌの瓶に移し、滅菌された０．５〜１％のスクロース溶液できれいに洗い、約３〜４ｇ（生重量）ずつペトリディッシュに移し、２５±１℃の温度で３〜４日程度培養し、汚染の有無を確認した。無菌状態のものは、製品に包装し、冷蔵庫（８〜１２℃）に移して保管したところ、約１ヵ月程度は変質なく良好な状態に維持された。また、生物反応器で生産されたエゾウコギ幼植物体はすぐエキス及び有用成分抽出用材料として使用するか、凍結乾燥器で凍結乾燥させた。これは、そのまま使用するか、粉末化して健康飲料及び茶の添加剤として使用することもできる。生物反応器で生産された製品は、懸濁培養により生産された幼植物体より大きさが均一であり、香り及び使用感など、全般的な官能性に優れた。
【００１８】
【発明の効果】以上説明したように、本発明によると、エゾウコギ体細胞を懸濁培養または空気送り込み型生物反応器で培養することにより、無菌で汚染していない状態の幼植物体を大量生産することができる。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５９９１３５１３４
【氏名又は名称】株式会社マイクロプランツ
【識別番号】５９９１３５１４５
【氏名又は名称】金 明助
【識別番号】５９９１３５１５６
【氏名又は名称】金 載▲フン▼
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| 【出願日】 |
平成１１年９月２４日（１９９９．９．２４） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００６５２２６
【弁理士】
【氏名又は名称】朝日奈 宗太 （外１名）
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| 【公開番号】 |
特開２０００−２２８９２４（Ｐ２０００−２２８９２４Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１２年８月２２日（２０００．８．２２） |
| 【出願番号】 |
特願平１１−２７１２８６ |
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