| 【発明の名称】 |
改変雄蕊細胞を有する植物 |
| 【発明者】 |
【氏名】セレステイナ・マリアニ
【氏名】ジヤン・レーマンス
【氏名】ウイリー・デ・グレーフ
【氏名】マルク・デ・ブツケレール
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| 【要約】 |
【課題】本発明は、外来ＤＮＡ配列が核ゲノム中に安定に組み込まれるよう細胞が形質転換される雄性不稔植物および種子等のその繁殖材料、核ゲノムが外来ＤＮＡ配列により形質転換される植物細胞および植物細胞培養物、核雄性不稔植物およびその繁殖材料、並びに外来ＤＮＡ配列を含有するその細胞培養物、ハイブリッド植物に成長する種子の生産方法、並びに植物ゲノム由来のタペータム特異性プロモータを提供する。
【解決手段】雄性不稔植物は、植物細胞を周知の方法で細胞の核ゲノム中、すなわち本発明の外来ＤＮＡ配列中に安定挿入することにより形質転換させて、植物の単一細胞から作成され、外来ＤＮＡ配列は少なくとも１個の雄性不稔ＤＮＡ、少なくとも１個のマーカーＤＮＡを含む。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 全ての細胞の核ゲノム中に外来ＤＮＡを保有する雄性不稔植物であって、前記外来ＤＮＡが、(a) 前記植物の雄蕊細胞中に発現された際に、雄蕊細胞を死滅又は無力にして稔性雄性配偶子の産生を防止することを可能にする雄性不稔ＤＮＡ、および(b) 前記植物の雄蕊細胞中で遺伝子発現を選択的に誘起する第１プロモータを含み、ここで前記雄性不稔ＤＮＡは前記第１プロモータと同じ転写単位に存在しかつその制御下にあり、但し、前記第１プロモータが小胞子および／または花粉細胞中で前記雄性不稔ＤＮＡを選択的に発現することを可能にするプロモータである場合、前記植物の細胞核ゲノムがホモ接合型である、ことを特徴とする前記植物。
【請求項２】 アグロバクテリウムにより形質転換し得る、請求項１記載の植物。
【請求項３】 前記第１プロモータが、葯細胞中で前記雄性不稔ＤＮＡの発現を誘起する請求項１又は２に記載の植物。
【請求項４】 前記第１プロモータが、前記植物のタペータム細胞又は葯表皮細胞中で前記雄性不稔ＤＮＡの発現を誘起する請求項３記載の植物。
【請求項５】 前記第１プロモータがＴＡ29遺伝子のプロモータである請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物。
【請求項６】 前記第１プロモータが、ＴＡ26遺伝子のプロモータ、ＴＡ13遺伝子のプロモータ、または前記ＴＡ29遺伝子，前記ＴＡ26遺伝子もしくは前記ＴＡ13遺伝子にハイブリダイズしうるタペータム特異性ｍＲＮＡをコードするＤＮＡのプロモータである請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物。
【請求項７】 植物がホモ接合型植物であり、かつ前記第１プロモータが前記ホモ接合型植物の花粉細胞中で前記雄性不稔ＤＮＡの選択的発現を誘起することができる請求項１又は２に記載の植物。
【請求項８】 前記雄性不稔ＤＮＡが、前記雄蕊細胞中に産生された際に、雄蕊細胞を死滅又は無力にして稔性雄性配偶子の産生を防止することを可能にする蛋白もしくはポリペプチドをコードするものである請求項１〜７のいずれか一項に記載の植物。
【請求項９】 前記雄性不稔ＤＮＡがＲＮアーゼＴ1 等のＲＮアーゼをコードする請求項８記載の植物。
【請求項１０】 前記雄性不稔性ＤＮＡがバルナーゼをコードする請求項８記載の植物。
【請求項１１】 前記雄性不稔ＤＮＡが、ＥcoＲＩ等のＤＮアーゼ；パパインチモーゲンもしくはパパイン活性蛋白等のプロテアーゼ；グルカナーゼ；リパーゼ；脂質ペルオキシダーゼ；細胞壁インヒビター；または細菌毒素をコードする請求項８記載の植物。
【請求項１２】 前記雄性不稔ＤＮＡが、Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡのｃｙｔ、ａｕｘ−１および／またはａｕｘ−２によってコードされる酵素等の植物ホルモンの合成を触媒する酵素をコードする請求項8記載の植物。
【請求項１３】 前記外来ＤＮＡが、(e) 前記第１蛋白もしくはポリペプチドを前記雄蕊細胞の葉緑体もしくはミトコンドリア中に輸送しうる運搬体ペプチドをコードし、前記雄性不稔ＤＮＡおよび前記第１プロモータと同じ転写単位に存在すると共に前記雄性不稔ＤＮＡと前記第１プロモータとの間に位置する第１運搬体ＤＮＡをさらに含む請求項8〜12のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１４】 馬鈴薯、トマト、菜種、アルファルファ、ヒマワリ、綿、セロリ、玉ネギ、クローバー、大豆、タバコ、アブラナ属野菜もしくは甜菜から選択される請求項１〜13のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１５】トウモロコシである請求項2〜13のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１６】 外来ＤＮＡが、(c) マーカーとなるマーカーＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドをコードするマーカーＤＮＡ、および(d) 少なくとも特定組織もしくは特定細胞中で前記マーカーＤＮＡの発現を誘起することができる第２プロモータをさらに含み、前記マーカーＤＮＡは前記第２プロモータと同じ転写単位に存在しかつその制御下にある請求項１〜15のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１７】 前記マーカーＤＮＡが、除草剤の作用を阻害するかもしくは中和するタンパク質をコードする請求項16に記載の植物。
【請求項１８】 前記マーカーＤＮＡが、除草剤耐性遺伝子特に、ホスフィノトリシン等のグルタミンシンテターゼ阻害剤に対し耐性を付与する遺伝子である請求項17に記載の植物。
【請求項１９】 前記マーカーＤＮＡがｓｆｒ又はｓｆｒｖ遺伝子である請求項18に記載の植物。
【請求項２０】 前記マーカーＤＮＡが、グリホセートの標的としての改変5-エノールピルビルシキメート-3- ホスフェートシンターゼ、またはホスフィノトリシン等のグルタミンシンテターゼ阻害剤の標的としての改変グルタミンシンテターゼ等の除草剤に対しより低い親和性を有する除草剤用の改変標的酵素をコードする請求項17に記載の植物。
【請求項２１】 前記マーカーＤＮＡが、遺伝子Ａ1 もしくはＧＵＳ遺伝子等の少なくとも前記特定組織もしくは特定細胞に色を与える蛋白もしくはポリペプチドをコードする遺伝子；Ｍｎ−スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子等の前記植物にストレス耐性を付与する蛋白もしくはポリペプチドをコードする遺伝子；あるいは昆虫耐性を付与するBacillus thuringiensisのエンドトキシンをコードする遺伝子もしくは細菌耐性を付与する殺細菌性ペプチドをコードする遺伝子等の病気または害虫耐性を付与する蛋白もしくはポリペプチドをコードする遺伝子；である請求項16に記載の植物。
【請求項２２】 前記第２プロモータが、35Ｓプロモータ、35Ｓ′3 プロモータ、ＰＮＯＳプロモータもしくはＰＯＣＳプロモータ等の構成プロモータ；ＴＲ1'もしくはＴＲ2'プロモータ等の傷誘発性プロモータ；ＳＳＵプロモータ等の光合成活性を有する植物組織中にて遺伝子発現を選択的に誘起するプロモータ；または葉細胞、花弁細胞もしくは種子被覆細胞等の種子細胞中にて遺伝子発現を選択的に誘起するプロモータである請求項16〜21のいずれか一項に記載の植物。
【請求項２３】 前記第２プロモータが35ＳプロモータまたはＳＳＵプロモータである請求項22記載の植物。
【請求項２４】 前記外来ＤＮＡが、マーカー蛋白もしくはポリペプチドを少なくとも前記特定組織もしくは特定細胞の葉緑体もしくはミトコンドリア中に輸送しうる運搬体ペプチドをコードし、前記マーカーＤＮＡおよび前記第２プロモータと同じ転写単位に存在すると共に前記マーカーＤＮＡと前記第２プロモータとの間に位置する第２ＤＮＡをさらに含む請求項16〜23のいずれか一項に記載の植物。
【請求項２５】 Agrobacterium に感染しうる植物であり、かつｐＴＴＭ4，ｐＴＴＭ6 ，ｐＴＴＭ6 Ａ- ，ｐＴＴＭ8 ，ｐＴＶＥＰ1 ，ｐＴＶＥＰ2 ，ｐＴＶＥ62もしくはｐＴＶＥ63のＴ−ＤＮＡを含むベクターで形質転換された植物の子孫に属する請求項2〜24のいずれか一項に記載の植物。
【請求項２６】 請求項1〜25のいずれか一項に記載の植物の細胞。
【請求項２７】 請求項１〜25のいずれか一項に記載の植物の細胞培養物。
【請求項２８】 前記外来ＤＮＡを含有することを特徴とする請求項１〜25のいずれか一項に記載の植物の種子。
【請求項２９】 ハイブリッド植物である請求項１〜６、８〜2５のいずれか一項に記載の植物。
【請求項３０】 マーカーＤＮＡを含有する請求項29記載のハイブリッド植物。
【請求項３１】 前記マーカーＤＮＡが、ホスフィノトリシン等のグルタミンシンテターゼ阻害剤を含む除草剤に対し耐性を付与しうるｓｆｒもしくはｓｆｒｖ遺伝子等の除草剤耐性遺伝子であるか、または前記除草剤用の改変標的酵素をコードする遺伝子である請求項30記載のハイブリッド植物。
【請求項３２】 前記外来ＤＮＡを含有する請求項29〜31のいずれか一項に記載のハイブリッド植物の種子。
【請求項３３】 請求項29〜31のいずれか一項に記載の植物の細胞。
【請求項３４】 下記のヌクレオチド配列に含まれるＴＡ29遺伝子のプロモータ。
【化１】
【請求項３５】 (a) 植物の雄蕊細胞中に発現された際に、雄蕊細胞を死滅又は無力にして稔性雄性配偶子の産生を防止することを可能にする雄性不稔ＤＮＡと、(b) 前記植物の雄蕊細胞中で遺伝子発現を選択的に誘起しうる第１プロモータとからなる第１キメラＤＮＡであって、ここで前記雄性不稔ＤＮＡは前記第１プロモータと同じ転写単位に存在しかつその制御下にあり、但し、前記第１プロモータが小胞子および／または花粉特異性プロモータではない、前記第１キメラＤＮＡを含有する組換えＤＮＡカセット。
【請求項３６】 前記第１プロモータが、前記植物のタペータム細胞等の葯細胞中で前記雄性不稔ＤＮＡの発現を誘起しうる請求項35記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項３７】 前記第１プロモータが、前記植物のタペータム細胞又は葯表皮細胞中で前記雄性不稔ＤＮＡの発現を誘起しうる請求項35又は36に記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項３８】 前記第１プロモータがＴＡ29遺伝子のプロモータである請求項37記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項３９】 前記第１プロモータが、ＴＡ26遺伝子のプロモータ、内在性のＴＡ13遺伝子のプロモータ、または前記ＴＡ29遺伝子，前記ＴＡ26遺伝子もしくは前記ＴＡ13遺伝子にハイブリダイズしうるタペータム特異性ｍＲＮＡをコードするＤＮＡのプロモータである請求項37記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項４０】 前記雄性不稔ＤＮＡが、前記雄蕊細胞中に産生された際に、雄蕊細胞を死滅又は無力にして稔性雄性配偶子の産生を防止することを可能にする蛋白もしくはポリペプチドをコードするものである請求項35〜39のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項４１】 前記雄性不稔ＤＮＡがＲＮアーゼＴ1 等のＲＮアーゼをコードする請求項40に記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項４２】 前記雄性不稔性ＤＮＡがバルナーゼをコードする請求項40に記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項４３】 前記雄性不稔ＤＮＡが、ＥcoＲＩ等のＤＮアーゼ；パパインチモーゲンもしくはパパイン活性蛋白等のプロテアーゼ；グルカナーゼ；リパーゼ；脂質ペルオキシダーゼ；細胞壁インヒビター；または細菌毒素をコードする請求項35〜39のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項４４】 前記雄性不稔ＤＮＡが、Agrobacterium Ｔ−ＤＮＡのｃｙｔ、ａｕｘ−１および／またはａｕｘ−２によってコードされる酵素等の植物ホルモンの合成を触媒する酵素をコードする請求項35〜39のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項４５】 前記蛋白もしくはポリペプチドを前記雄蕊細胞の葉緑体もしくはミトコンドリア中に輸送しうる運搬体ペプチドをコードし、前記雄性不稔ＤＮＡおよび前記第１プロモータと同じ転写単位に存在すると共に前記雄性不稔ＤＮＡと前記第１プロモータとの間に位置する第１運搬体ＤＮＡをさらに含む請求項40〜44のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項４６】 (c) マーカーとなるマーカーＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドをコードするマーカーＤＮＡと、(d) 植物の少なくとも特定組織もしくは特定細胞中で前記マーカーＤＮＡの発現を誘起することができる第２プロモータとからなる第２キメラＤＮＡをさらに含み、前記マーカーＤＮＡは前記第２プロモータと同じ転写単位に存在しかつその制御下にある請求項35〜45のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項４７】 前記マーカーＤＮＡが、除草剤の作用を阻害するかもしくは中和するタンパク質をコードする請求項46記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項４８】 前記マーカーＤＮＡが、除草剤耐性遺伝子特に、ホスフィノトリシン等のグルタミンシンテターゼ阻害剤に対し耐性を付与する遺伝子である請求項47記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項４９】 前記マーカーＤＮＡがｓｆｒ又はｓｆｒｖ遺伝子である請求項48記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項５０】 前記マーカーＤＮＡが、グリホセートの標的としての改変5-エノールピルビルシキメート-3- ホスフェートシンターゼ、またはホスフィノトリシン等のグルタミンシンテターゼ阻害剤の標的としての改変グルタミンシンテターゼ等の除草剤に対しより低い親和性を有する除草剤用の改変標的酵素をコードする請求項47記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項５１】 前記マーカーＤＮＡが、遺伝子Ａ1 もしくはＧＵＳ遺伝子等の少なくとも前記特定組織もしくは特定細胞に色を与える蛋白もしくはポリペプチドをコードする遺伝子；Ｍｎ−スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子等の前記植物にストレス耐性を付与する蛋白もしくはポリペプチドをコードする遺伝子；あるいは昆虫耐性を付与するBacillus thuringiensis のエンドトキシンをコードする遺伝子もしくは細菌耐性を付与する殺細菌性ペプチドをコードする遺伝子等の病気または害虫耐性を付与する蛋白もしくはポリペプチドをコードする遺伝子である請求項46記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項５２】 前記第２プロモータが、35Ｓプロモータ、35Ｓ′3 プロモータ、ＰＮＯＳプロモータもしくはＰＯＣＳプロモータ等の構成プロモータ；ＴＲ1'もしくはＴＲ2'プロモータ等の傷誘発性プロモータ；光合成活性を有する植物組織中にて遺伝子発現を選択的に誘起するプロモータ；または葉細胞、花弁細胞もしくは種子被覆細胞等の種子細胞中にて遺伝子発現を選択的に誘起するプロモータである請求項46〜51のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項５３】 前記第２プロモータが35ＳプロモータまたはＳＳＵプロモータである請求項52記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項５４】 (f) マーカー蛋白もしくはポリペプチドを少なくとも前記特定組織もしくは特定細胞の葉緑体もしくはミトコンドリア中に輸送しうる運搬体ペプチドをコードし、前記マーカーＤＮＡおよび前記第２プロモータと同じ転写単位に存在すると共に前記マーカーＤＮＡと前記第２プロモータとの間に位置する第２ＤＮＡをさらに含む請求項46〜53のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセット。
【請求項５５】 請求項35〜54のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセットを含有する植物。
【請求項５６】 アグロバクテリクムにより形質転換し得る、請求項55に記載の植物。
【請求項５７】 馬鈴薯、トマト、菜種、アルファルファ、ヒマワリ、綿、セロリ、玉ネギ、クローバー、大豆、タバコ、アブラナ属野菜もしくは甜菜から選択される請求項56に記載の植物。
【請求項５８】 トウモロコシである請求項56に記載の植物。
【請求項５９】 請求項35〜54のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセットを、その全ての細胞に含む請求項55に記載の植物。
【請求項６０】 雄性不稔である請求項55に記載の植物。
【請求項６１】 ハイブリッド植物である請求項55〜60のいずれか一項に記載の植物。
【請求項６２】 請求項55〜61のいずれか一項に記載の植物の細胞。
【請求項６３】 請求項35〜54のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセットを含有する植物種子。
【請求項６４】 雄性不稔植物、その再生物質もしくは種子等の子孫の生産方法であって、請求項35〜54のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセットを植物細胞の核ゲノム中に導入して形質転換植物細胞を得、この形質転換植物細胞から前記雄性不稔植物を再生し、必要に応じて、前記雄性不稔植物から、前記外来ＤＮＡを含有する再生物質もしくは子孫を得ることを包含する前記方法。
【請求項６５】 植物がアグロバクテリウムにより形質転換し得る植物である請求項64に記載の方法。
【請求項６６】 植物が馬鈴薯、トマト、菜種、アルファルファ、ヒマワリ、綿、セロリ、玉ネギ、クローバー、大豆、タバコ、アブラナ属野菜もしくは甜菜から選択される請求項65に記載の方法。
【請求項６７】 植物がトウモロコシである請求項65に記載の方法。
【請求項６８】 種子形成性かつ雄性不稔植物の種子を生産する方法であって、− ｉ）種子形成性かつ雄性不稔植物であり、この植物中のマーカーＤＮＡが除草剤に対し耐性を付与する遺伝子又は前記除草剤用の改変標的酵素をコードする遺伝子である、請求項46〜54のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセットを全細胞の核ＤＮＡ中に安定に組込んで含有する植物、または請求項16〜24のいずれか一項に記載の植物を、ii）前記マーカーＤＮＡ及び第２プロモータを含有しない雄稔性植物と他家受粉させ、− 前記植物に前記除草剤を散布して雄稔性植物を排除し、− 前記受粉した雄性不稔植物の種子を得ることを包含する前記方法。
【請求項６９】 種子がアグロバクテリウムにより形質転換し得る植物の種子である請求項68に記載の方法。
【請求項７０】 植物が馬鈴薯、トマト、菜種、アルファルファ、ヒマワリ、綿、セロリ、玉ネギ、クローバー、大豆、タバコ、アブラナ属野菜もしくは甜菜から選択される請求項69に記載の方法。
【請求項７１】 種子がトウモロコシ種子である請求項69に記載の方法。
【請求項７２】 前記他家受粉の前に前記除草剤を散布することを含む請求項64〜71項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】 前記他家受粉の後に前記除草剤を散布することを含む請求項72に記載の方法。
【請求項７４】 マーカーＤＮＡが、ホスフィノトリシン等のグルタミンシンテターゼ阻害剤に対し耐性を付与しうるｓｆｒもしくはｓｆｒｖ遺伝子等の遺伝子であり、かつ、前記グルタミンシンテターゼ阻害剤を前記植物に散布することを含む請求項64〜71のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】 前記雄性不稔植物が、前記雄性不稔ＤＮＡと同じ遺伝子座中に、前記マーカーＤＮＡの他に、植物細胞の核ゲノム内に安定に組み込まれた他の除草剤耐性遺伝子もしくは他の除草剤用改変標的酵素をコードする遺伝子等の第２マーカーＤＮＡを含有し、かつ受粉に使用する前記雄稔性植物が、その植物細胞の核ゲノム内に安定に組み込まれた第２マーカーＤＮＡのみを含有することを特徴とする請求項64〜74のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】 前記雄性不稔植物と前記雄稔性植物がハイブリッド種子を生じさせることができ、及び前記雄性不稔植物のハイブリッド種子を回収することを含む請求項64〜75のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】 請求項46〜54のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセットに関してヘテロ接合型である種子形成性かつ雄性不稔植物であって、前記組換えＤＮＡカセットがその全細胞の核ＤＮＡ中に安定に組み込まれて含み、及びその植物中のマーカーＤＮＡが除草剤に対し耐性を付与する遺伝子であるか又は前記除草剤用の改変標的酵素をコードする遺伝子である前記植物の近親交配系を維持するための方法であって、− ｉ）前記近親交配系の雄性不稔植物を、ii）前記マーカーＤＮＡと前記第２プロモータを含有しない近親交配系の雄稔性植物と他家受粉させ、その他家受粉後、− 前記雄性不稔植物から種子を得、− 前記種子を成長させて植物となし、及び− その植物に前記除草剤を散布して雄稔性植物を排除することを包含する前記方法。
【請求項７８】 前記マーカーＤＮＡが、グルタミンシンテターゼ阻害剤に対し耐性を付与しうるｓｆｒもしくはｓｆｒｖ遺伝子等の遺伝子であり、かつ前記方法が前記グルタミンシンテターゼ阻害剤を前記植物に散布することを含む請求項77記載の方法。
【請求項７９】 (a) 請求項35〜54のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡカセットを含有する雄性不稔親植物と、(b) 雄稔性親植物とからなる、種子を生産するための一対の親植物。
【請求項８０】 アグロバクテリウムにより形質転換し得る植物である請求項77〜79のいずれか一項に記載の一対の親植物。
【請求項８１】 馬鈴薯、トマト、菜種、アルファルファ、ヒマワリ、綿、セロリ、玉ネギ、クローバー、大豆、タバコ、アブラナ属野菜もしくは甜菜から選択される請求項80に記載の一対の親植物。
【請求項８２】 トウモロコシ植物である請求項80に記載の一対の親植物。
【請求項８３】 前記雄性不稔親植物および雄稔性親植物が異なる育種系に属するものである請求項77〜82のいずれか一項に記載の一対の親植物。
【請求項８４】 前記雄性不稔親植物および雄稔性親植物が同じ育種系に由来するものである請求項77に記載の一対の親植物。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、外来ＤＮＡ配列が核ゲノム中に安定に組込まれるよう細胞が形質転換される雄性不稔植物およびその繁殖材料（たとえば種子）に関するものである。本発明の外来ＤＮＡ配列は少なくとも１個の第１外来ＤＮＡ（以下、「雄性不稔ＤＮＡ」と称する）を有し、この雄性不稔ＤＮＡは (1)植物の雄蕊細胞にて産生もしくは過剰産生された際に雄蕊細胞の代謝、機能および／または発育を顕著に阻害する第１ＲＮＡまたは蛋白もしくはポリペプチドをコードし、かつ (2)植物の雄蕊細胞にて雄性不稔ＤＮＡの発現を選択的に誘起しうる第１プロモータと同じ転写単位に存在しかつその制御下にある。特に本発明はこの種の核雄性不稔（nuclear male-sterile）植物およびその繁殖材料に関し、ここで本発明の外来ＤＮＡ配列は少なくとも１個の第２外来ＤＮＡ（以下「マーカーＤＮＡ」と称する）をも含有する外来キメラＤＮＡ配列であって、このマーカーＤＮＡは(1) 植物の少なくとも特定組織もしくは特定細胞に存在する際に、その全植物を、少なくとも特定組織もしくは特定細胞中に第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドを含有しない他の植物から容易に分離させうるような第２ＲＮＡまたは蛋白もしくはポリペプチドをコードし、 (2)植物の少なくとも特定組織もしくは特定細胞にてマーカーＤＮＡの発現を誘起しうる第２プロモータと同じ転写単位に存在しかつその制御下にあり、さらに (3)雄性不稔ＤＮＡと同じ植物細胞の核ゲノムの遺伝子座に存在する。
【０００２】さらに本発明は、核ゲノムが外来ＤＮＡ配列により形質転換される植物細胞および植物細胞培養物に関するものである。
【０００３】さらに本発明は、核雄性不稔植物およびその繁殖材料、並びに外来ＤＮＡ配列を含有するその細胞培養物にも関し、ここで雄性不稔ＤＮＡは (1)第１プロモータの制御下にありかつ必要に応じ第２プロモータの制御下でマーカーＤＮＡと同じ遺伝子座に存在し、 (2)植物細胞の核ゲノム中に安定に組込まれ；かつ (3)第１ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドとして植物の雄蕊細胞中で選択的に発現することができる。
【０００４】さらに本発明は、ハイブリッド植物に成長するハイブリッド種子の生産方法にも関し、この方法は (1)好ましくは除草剤耐性を植物に付与する蛋白をコードするマーカーＤＮＡを核ゲノム中に有する本発明の雄性不稔植物と、 (2)ゲノム中にマーカーＤＮＡを持たない雄稔性植物とを交配させることを特徴とする。特に本発明は、商業規模で、好ましくは殆んど手作業の必要なしにほぼランダムな集団としてハイブリッド種子を生産する方法に関する。
【０００５】さらに本発明は、植物ゲノム由来のタペータム(tapetum) 特異性プロモータにも関するものである。このプロモータは、植物を核雄性不稔となるよう形質転換させるために本発明の外来ＤＮＡ配列における第１プロモータとして使用され得る。
【０００６】
【従来の技術】植物のハイブリッド化は、親植物の所望の形質の組合せを備えた子孫を生産するための重要な方法として認識される。得られるハイブリッド子孫は、しばしばたとえば収量、環境変化に対する適応性および病気抵抗性のような各種の形質において親を凌ぐ能力を有する。この能力は「ヘテローシス(heterosis) 」もしくは「雑種強勢(hybrid vigor)」と呼ばれる。その結果、ハイブリッド化はたとえばトウモロコシ、甜菜およびヒマワリのような主作物を改良するため広範に使用されている。主として殆んどの植物は自家受粉および他家受粉の両者を受けうるという事実に関する多くの理由から、ハイブリッド種子の収穫を得るべく顕著な自家受粉なしに制御された植物の他家受粉を行なうことは、商業規模にて達成困難であった。
【０００７】天然において、大多数の作物は同一植物の雄性および雌性の繁殖器官を通常同じ花の互いに近接した部位に形成する。これは自家受粉に好適である。しかしながら或る種の植物は例外であって、その繁殖器官の特定形態により、他家受粉に好適である。これらの植物は向上した活力および適応性を持ったハイブリッド子孫を生産する。Cannabis ssp. （麻）におけるこの種の１つの形態は、別個の植物に雄性繁殖器官および雌性繁殖器官を有する。Zea mays（トウモロコシ）におけるこの種の他の形態は、同一植物の種々異なる部分に雄性繁殖器官および雌性繁殖器官を有する。Elaeis guineensis （油椰子）におけるこの種の他の形態は雄性配偶子と稔性の雌性配偶子とを有しており、植物の発育における異なる時期に稔性となる。
【０００８】たとえばAnanas comosus（パイナップル）のような或る種の他の植物は、その繁殖器官の特定の生理学を介し他家受粉を促進する。この種の植物はいわゆる「自家不和合系」を発生して、１つの植物の花粉が同じ植物の雌性配偶子または同じ遺伝子型を有する他の植物の雌性配偶子を受精することができない。
【０００９】或る種の他の植物は、いわゆる「雄性不稔」のゲノム特性を天然に示すことにより他家受粉に好適である。この特徴により、植物の葯はこれら葯により生産された花粉が成熟に達する前に退化する〔「高等植物における雄性不稔（Male-Sterility in Higher Plants）」，Ｍ．Ｌ．Ｈ．Kaul（1987）；モノグラフス・オン・セオレチカル・アンド・アプライド・ジェネチックス （Monographs onTheoretical and Applied Genetics）10，スプリンガー・フェアラーク出版，参照〕。この種の天然の雄性不稔の特徴は特にしばしば劣性欠失を含む広範囲の自然突然変異から生ずると思われ、かつこの特徴は主として自家受粉する植物種には容易に維持されない。何故なら、自然条件下において種子が産生されないからである。
【００１０】天然には、主として 4種類の雄性不稔が観察される。これら4 種類の雄性不稔を全て商業上の育種計画に用いて、たとえばトウモロコシ、甜菜、アブラナおよびヒマワリのような作物のハイブリッド種子を生産すべく他家受粉するよう確保する。
【００１１】１つの種類の雄性不稔は核コード化され、かつ劣性対立形質として遺伝すると思われる。育種の目的で、劣性の雄性不稔親植物は、これを劣性の雄性不稔対立形質を持ったヘテロ接合性の雄稔性植物と交配させることにより維持され、子孫は50％劣性の雄性不稔植物である。他の50％は雄稔性植物であり、この雄稔性植物は間引かれなければならないが、劣性雄性不稔対立形質が選択可能なもしくはスクリーニング可能なマーカーと共に分離される場合にのみ効果的に間引くことが可能である。米国特許第 4,727,219号には、ハイブリッドトウモロコシを生産するため劣性雄性不稔を使用する方法が記載されている。
【００１２】第２の種類の雄性不稔は核コード化されるが、優性対立形質として遺伝する。劣性雄性不稔植物と比較して優性雄性不稔植物の利点は、雄稔性植物と交配することにより優性雄性不稔植物を維持して50％優性の雄性不稔植物の子孫を産生しうる点にある。しかしながら、この優性核雄性不稔植物の有用性は限度がある。何故なら、大抵の場合、その優性雄性不稔対立形質は選択可能もしくはスクリーニング可能なマーカーに緊密に連鎖しない（すなわち、同一の遺伝子座に存在しない）からである。
【００１３】第３の種類の雄性不稔は細胞質に（cytoplasmatically)コード化される。大抵の場合、細胞質コードは植物のミトコンドリアゲノム中に存在し、極く少数の場合には植物の葉緑体ゲノム中に存在する。細胞質コード化された雄性不稔の遺伝はメンデル法則にしたがわず、寧ろ細胞質因子に依存する。細胞質雄性不稔植物と雄稔性植物との間の交配により得られる子孫は全て細胞質雄性不稔遺伝子を有し、したがって不稔性である。その結果、この種の植物の子孫は、この子孫の経済的生産物が種子として使用されずに寧ろたとえば観賞植物および甜菜のような植物である場合のみ商業的価値がある。
【００１４】第４の種類の雄性不稔は、核コード化された雄性不稔と細胞質コード化された雄性不稔との両者の組合せの結果である。雄性不稔を誘発する核対立遺伝子は一般に劣性であり、また雄性不稔の細胞質対立遺伝子を有しかつ雄性不稔を誘発する核対立遺伝子に対してホモ接合性である植物のみが表現型として雄性不稔である。この種の植物において、対応の優性雄稔性−誘発対立遺伝子または「稔性回復系」は雄−稔性表現型を発生する。その結果、この種の植物の雄性不稔子孫は、これら雄性不稔植物に稔性回復系を有する花粉を受粉させて雄稔性にすることができる。その結果、この種の植物の子孫は、経済的生産物が種子である場合、すなわちたとえばトウモロコシ、ソルガムおよびヒマワリのような植物につき商業的価値がある。
【００１５】典型的にはハイブリッド種子の生産は、細胞質雄性不稔植物および雄稔性植物の大規模な成育によりかつ得られるハイブリッド種子を非ハイブリッド種子と混合しないよう或る程度防止することにより（たとえば明確なマーカーを用いて）達成されている。米国特許第 3,842,538号によれば、ハイブリッド種子は色によって非ハイブリッド種子から面倒な手法で分離される。米国特許第 4,351,130号によれば、ハイブリッド種子を非ハイブリッド種子から分離する問題は、背丈の低い雄性不稔植物と背丈の高い雄稔性植物とを用い、次いで受粉後に背丈の高い雄稔性植物を死滅させることにより回避される。米国特許第 4,658,085号、第4,517,763 号および第 4,658,084号によれば、雄稔性植物には存在しない除草剤耐性を細胞質雄性不稔植物に与え、受粉後に雄稔性植物を除草剤で死滅させる。米国特許第 4,305,225号によれば、雄性不稔の稲植物に成長ホルモン（たとえばジベレリン）を噴霧して稲の葉鞘から円錐花序を完全に出現させることにより、花が雄稔性植物から花粉を受入れる能力を増大させる。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】雄性不稔植物からハイブリッド種子を生産するためのこれら全ての方法において、 (1)各雄性不稔植物からの高いハイブリッド種子生産； (2)殆んど専ら雄稔性植物の花粉と雄性不稔植物の卵とから得られかつ殆んど雄稔性植物からの非ハイブリッド種子を含まないハイブリッド種子群； (3)雄性不稔植物および雄稔性植物の両者の容易な生産；および (4)雄性不稔植物に受粉した後の雄稔性植物のほぼ完全な除去もしくは撲滅、或いは雄稔性植物により生産された非ハイブリッド種子の、雄性不稔植物により生産されたハイブリッド種子からの選択的分離を商業的規模で簡単かつ安価に得るための方法が探求されている。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、外来ＤＮＡ配列、好ましくは外来キメラＤＮＡ配列により形質転換された核ゲノムを有する植物の細胞において、(a) 前記植物の雄蕊細胞で産生されまたは過剰産生された際に前記雄蕊細胞の代謝、機能および／または発育を顕著に阻害する、好ましくは雄蕊細胞を死滅又は無力にして稔性雄性配偶子の産生を防止することを可能にする第１ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドをコードする雄性不稔ＤＮＡ、および(b) 前記雄性不稔ＤＮＡの発現を前記植物の雄蕊細胞中にて選択的に誘起する第１プロモータを含み、前記雄性不稔ＤＮＡは前記第１プロモータと同じ転写単位に存在しかつその制御下にあり、但し、前記第１プロモータが花粉細胞中で前記雄性不稔ＤＮＡを選択的に発現することを可能にするプロモータである場合、前記植物の核ゲノムがホモ接合型である、ことを特徴とする植物が提供される。
【００１８】形質転換された植物細胞の核ゲノムにおける外来ＤＮＡ配列は、好ましくは雄性不稔ＤＮＡと同じ遺伝子座に、(c) 植物の少なくとも特定組織または少なくとも特定細胞に存在する際に前記植物を少なくとも前記特定組織もしくは特定細胞に第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドを含有しない他の植物から容易に分離しうるようにする前記第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドをコードするマーカーＤＮＡ、および(d) 前記マーカーＤＮＡの発現を少なくとも前記特定組織もしくは特定細胞中にて誘起しうる第２プロモータをさらに含むことができ、マーカーＤＮＡは第２プロモータと同じ転写単位に存在しかつその制御下にある。
【００１９】さらに本発明によれば、それぞれ形質転換細胞よりなる雄性不稔植物および植物細胞培養物；雄性不稔植物の種子；雄性不稔植物を雄稔性植物と交配させて得られるハイブリッド種子および植物；並びにこの種のハイブリッド種子の生産方法も提供される。
【００２０】さらに本発明によれば、タペータム特異性の第１プロモータも提供される。
【００２１】
【発明の実施の形態】本発明によれば、雄性不稔植物は、植物細胞を周知方法で細胞の核ゲノム中、すなわち本発明の外来ＤＮＡ配列中に安定挿入することにより形質転換させて、植物の単一細胞から作成される。外来ＤＮＡ配列は、第１プロモータの制御下にありかつ5'末端が第１プロモータに融合し、さらにその3'末端が適する転写制御シグナル（ポリアデニル化シグナルを含む）に融合した少なくとも 1個の雄性不稔ＤＮＡを含む。これにより第１ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドは植物の雄蕊細胞にて選択的に生産されもしくは過剰生産されて、植物を雄性不稔にする。好ましくは、外来ＤＮＡ配列はさらに第２プロモータの制御下にありかつそこに5'末端が融合し、さらにその3'末端が適する転写制御シグナル（ポリアデニル化シグナルを含む）に融合した少なくとも 1個のマーカーＤＮＡをも含む。マーカーＤＮＡは好ましくは雄性不稔と同じ遺伝子座に位置し、これにより第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドが少なくとも植物の特定組織もしくは特定細胞中で産生されて、植物を、特定組織もしくは特定細胞中に第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドを持たない他の植物から容易に区別しかつ／または分離することができる。これは、高い確信度を持って雄性不稔ＤＮＡとマーカーＤＮＡとの両者が植物の子孫で一緒に分離することを保証する。
【００２２】植物（特にアグロバクテリウム（Agrobacterium ）に感染しうる植物）の細胞は、好ましくは外来ＤＮＡ配列を含有しかつアグロバクテリウムが有する非病原性（disarmed）Ｔｉ−プラスミドであるベクターを用いて、本発明により形質転換される。この形質転換は、たとえばヨーロッパ特許出願公開第 0,116,718号および第 0,270,822号に記載された方法を用いて行なうことができる。好適なＴｉ−プラスミドベクターはＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡの境界配列の間、或いは少なくともＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡの右側境界配列の左側に位置する外来ＤＮＡ配列を有する。勿論、他の種類のベクターを用いて植物細胞を、たとえば直接的遺伝子導入（たとえばヨーロッパ特許公開第 0,223,247号に記載）、花粉媒介形質転換（たとえばヨーロッパ特許公開第 0,270,356号、ＰＣＴ出願公開ＷＯ85/01856号およびヨーロッパ特許公開第 0,275,069号に記載）、in vitroのプロトプラスト形質転換（たとえば米国特許第 4,684,611号）、植物ＲＮＡウイルス媒介形質転換（たとえばヨーロッパ特許公開第 0,067,553号および米国特許第 4,407,956号に記載）、並びにリポソーム媒介形質転換（たとえば米国特許第4,536,475 号に記載）のような方法により形質転換させることができる。
【００２３】好ましくは、本発明の核雄性不稔植物は、第１プロモータの制御下にある雄性不稔ＤＮＡと第２プロモータの制御下にあるマーカーＤＮＡとの両者を有する外来ＤＮＡ配列を持った無力のＴｉ−プラスミドベクターにより植物細胞を形質転換させて得られる。マーカーＤＮＡはＴｉ−プラスミドベクターにおける雄性不稔ＤＮＡの上流もしくは下流に存在しうるが、好ましくは両者が互いに隣接しかつ境界配列の間或いは少なくともＴｉ−プラスミドベクターの右側境界配列の左側に位置して、これらは一緒になって適切に植物細胞の核ゲノム中に移行する。しかしながら、所望ならば細胞を先ず最初に雄性不稔ＤＮＡと第１プロモータとを有する外来ＤＮＡ配列により形質転換させることができ、次いで雄性不稔ＤＮＡと同じ細胞の核ゲノムにおける遺伝子座に挿入されたマーカーＤＮＡおよび第２プロモータにより形質転換することができる。この目的に適するベクターは、外来ＤＮＡ配列で細胞を形質転換させるため上記したものと同じである。好適ベクターは無力性（非病原性）のＴｉ−プラスミドベクターである。
【００２４】本発明において、雄性不稔ＤＮＡの選択は重要でない。適する雄性不稔ＤＮＡは、これが雄性不稔ＤＮＡを発現する雄蕊細胞の適切な代謝、機能および／または発育を顕著に阻害して、好ましくはこれにより全ての雄蕊細胞の死滅をもたらす第１ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドをコードするよう周知方法で選択しかつ分離することができる。雄性不稔ＤＮＡの好適例は次のものをコードする：たとえばＲＮアーゼＴ1 のようなＲＮアーゼ（これはグアニン残基の後で結合を加水分解することによりＲＮＡ分子を分解する）およびバルナーゼ(Barnase);たとえばエンドヌクレアーゼのようなＤＮアーゼ（たとえばＥcoＲＩ）；またはたとえばパパインのようなプロテアーゼ（たとえばパパインチモーゲンおよびパパイン活性蛋白）。
【００２５】雄性不稔ＤＮＡの他の例は植物ホルモンの合成を触媒する酵素、たとえば、サイトカイニン生合成における第１過程を触媒すると共にアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡの遺伝子 4（ｃｙｔ）によりコードされる酵素であるイソペンテニルトランスフェラーゼ；およびオーキシンの合成に関与しかつアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡの遺伝子 1（ａｕｘ−１）および遺伝子 2（ａｕｘ−２）によりコードされる酵素をコードする。雄性不稔ＤＮＡのさらに他の例は、グルカナーゼ；リパーゼ、たとえばホスホリパーゼＡ2 〔Verheij 等（1981）、レビュー・バイオケミカル・ファーマコロジー（Rev. Biochem. Pharmacol.），第91巻，第92〜203頁〕；脂質ペルオキシダーゼ；または植物細胞壁の阻害剤をコードする。さらに他の雄性不稔ＤＮＡの例は、植物細胞に対し毒性である蛋白、たとえば細菌毒素（たとえばジフテリアトキシンのＢ−断片、すなわちボツリン (botulin)）をコードする。
【００２６】さらに他の雄性不稔ＤＮＡの例は、たとえばヨーロッパ特許公開第 0,223,399号に記載されたような内在性プロモータの制御下で植物の雄蕊細胞中で天然に転写されるＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖をコードするアンチセンスＤＮＡである。この種のアンチセンスＤＮＡは、雄蕊細胞中で天然に産生されるＲＮＡのコード化および／または非コード化部分に結合しうるＲＮＡ配列（アンチセンスＲＮＡ）に転写されて、天然産生されたＲＮＡの翻訳を阻止することができる。この種のアンチセンスＤＮＡの例は、植物における葯のタペータム細胞中でＴＡ29プロモータの制御下に天然に発現されＴＡ29遺伝子のアンチセンスＤＮＡ（実施例２に記載）である。
【００２７】雄性不稔ＤＮＡの他の例は、Haseloffおよび Gerlach（1988），ネイチャー（Nature），第 334巻，第 585〜591 頁に記載されたような所定の標的配列に対し高特異的開裂を行ないうる特定のＲＮＡ酵素（すなわち、いわゆる「リボザイム」）をコードする。この種のリボザイムは、たとえばＴＡ29遺伝子によりコードされるＲＮＡを標的とするリボザイムである。
【００２８】さらに他の雄性不稔ＤＮＡの例は、雄蕊細胞を特定の病気、たとえばカビ感染に対し感受性にしうる物質をコードする。この種の雄性不稔ＤＮＡは、雄性不稔ＤＮＡを発現しない他の全ての細胞が特定の病気に対し耐性である植物に使用することができる。
【００２９】本発明の外来ＤＮＡ配列に関し「外来」という用語は、この外来ＤＮＡ配列が外来雄性不稔ＤＮＡおよび／または外来第１プロモータを含有することを意味する。ＤＮＡ、たとえば雄性不稔ＤＮＡおよび第１プロモータ、並びにマーカーＤＮＡ、第２プロモータおよびその他の外来ＤＮＡ配列における他のＤＮＡに関し「外来」という用語は、本発明により該ＤＮＡにより形質転換される植物細胞における同じゲノム環境に存在せず、たとえば植物、細菌、動物、カビ、ウイルスなどの細胞に天然に存在してそこから前記ＤＮＡが得られるようなＤＮＡを意味する。これは、たとえば外来雄性不稔ＤＮＡもしくはマーカーＤＮＡが次のものであってもよいことを意味する：(1) 起原植物中の核ＤＮＡであり；(2) 形質転換植物細胞に対し内在性（すなわち形質転換される植物と同じ遺伝子型を持った起原植物由来）であり；および(3) 形質転換植物細胞内における本発明の外来ＤＮＡ配列中のそれ自身の内在性プロモータおよび3'末端転写制御シグナル（起原植物由来）と同じ転写単位内に存在し；ただし(4) 起原植物に存在する位置とは異なる形質転換植物細胞の核ゲノム中の位置に挿入されるもの。さらに外来雄性不稔もしくはマーカーＤＮＡは、たとえば次のものとすることもできる：(1)起原植物中の核ＤＮＡであり；および(2) 形質転換植物細胞に対し内在性であり；ただし(3) 形質転換植物細胞内における本発明の外来キメラＤＮＡ配列中の異なる（すなわちそれ自身のものでない）内在性プロモータおよび／または3'末端転写制御シグナルと同じ転写単位内に存在するもの。さらに、外来雄性不稔もしくはマーカーＤＮＡは次のものとすることもできる：(1) 起原植物内の核ＤＮＡであり；および(2) 形質転換植物細胞に対し内在性であり；ただし(3) 形質転換植物細胞内における本発明の外来キメラＤＮＡ配列中の異種プロモータおよび／または3'末端転写制御シグナルと同じ転写単位内に位置するもの。さらに、外来雄性不稔もしくはマーカーＤＮＡは、たとえば形質転換植物細胞に対し異種としかつ内在性プロモータおよび／または3'転写制御シグナル（たとえば形質転換される植物と同じ遺伝子型を有する植物の核ゲノム由来のもの）と同じ転写単位内に位置することもできる。外来雄性不稔ＤＮＡの例は、転写される植物と同じ遺伝子型を有する植物の核ゲノムから得られて、たとえば形質転換される植物の雄蕊細胞に対し内在性であるプロテアーゼもしくはリボヌクレアーゼのような酵素をコードすることができ、したがって形質転換された雄蕊細胞にて酵素が過剰産生されてその代謝、機能および／または発育を顕著に阻害する。好ましくは、雄性不稔ＤＮＡおよびマーカーＤＮＡは、それぞれ形質転換される植物細胞に対し異種である。
【００３０】ＤＮＡ、たとえば雄性不稔ＤＮＡ、第１プロモータ、マーカーＤＮＡ、第２プロモータおよびその他任意の外来ＤＮＡ配列におけるＤＮＡに関し「異種」という用語は、この種のＤＮＡが形質転換される植物と同じ遺伝子型を有する植物の細胞の核ゲノムには天然に存在しないことを意味する。異種ＤＮＡの例は、形質転換される植物と同じ遺伝子型を有する植物から得られる葉緑体およびミトコンドリアＤＮＡを包含するが、好適例は形質転換される植物とは異なる遺伝子型を有する植物からの葉緑体、ミトコンドリアおよび核ＤＮＡ、動物および細菌ゲノムからのＤＮＡ、並びにカビおよびウイルスゲノムからの染色体およびプラスミドＤＮＡを包含する。
【００３１】本発明の外来ＤＮＡ配列に関し「キメラ」という用語は、その雄性不稔ＤＮＡ配列の少なくとも１つが(1) 前記１つの雄性不稔ＤＮＡ用の第１プロモータの制御下で天然には存在せず；かつ／または(2) マーカーＤＮＡの少なくとも１つと同じ遺伝子座には天然に存在しないことを意味する。本発明の外来キメラＤＮＡ配列の例は、植物起源の第１プロモータの制御下における細菌起源の雄性不稔ＤＮＡ；並びに植物起源の第１プロモータの制御下にありかつ細菌起源のマーカーＤＮＡと同じ遺伝子座にある植物起源の雄性不稔ＤＮＡである。
【００３２】雄性不稔ＤＮＡが植物の雄蕊細胞中で選択的に発現されるよう、外来ＤＮＡ配列中の雄性不稔ＤＮＡを制御する第１プロモータが、植物の雄蕊細胞中で遺伝子発現を選択的に誘起しうるプロモータであることが好ましい〔「雄蕊」という用語は、雄性配偶子を産生しかつ葯および花糸を含む花の器官を意味する〕。この種の雄蕊特異性プロモータは内在性プロモータであっても外在性プロモータであってもよく、かつ核ゲノムから或いは植物細胞のミトコンドリアもしくは葉緑体ゲノムから得ることができる。いずれにせよ、第１プロモータは形質転換される植物細胞の核ゲノムに対し外来性である。好ましくは、第１プロモータは、雄性不稔ＤＮＡを葯、花粉もしくは花糸細胞においてのみ、特にタペータム又は葯表皮細胞においてのみ発現させる。第１プロモータは、この第１プロモータが雄蕊細胞における雄性不稔ＤＮＡの発現を選択的に誘起して雄蕊を死滅させ或いは無力にすると共に、植物が稔性雄性配偶子を産生しえなくするよう雄性不稔にするべく、植物種から周知方法で選択しかつ分離することもできる。第１プロモータは好ましくはさらに、特に植物の雌性器官における稔性花粉の産生に関与しない他の植物部分における雄性不稔ＤＮＡの発現を防止するのに有効となるよう選択されかつ分離される。たとえば、適する内在性の雄蕊特異性第１プロモータは次の工程により雄性不稔となるよう植物にて同定しかつ分離することができる：1. 雄蕊、好ましくは葯、花粉もしくは花糸の発育に際してのみ植物中に存在するｍＲＮＡを探し；
2. この雄蕊特異性ｍＲＮＡを分離し；
3. この雄蕊特異性ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作成し；
4. このｃＤＮＡをプローブとして使用することにより、雄蕊特異性ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを持った植物ゲノムにおける領域を同定し；次いで5. 雄蕊特異性ｍＲＮＡをコードするＤＮＡの上流（すなわち5'）に存在しかつこのＤＮＡのプロモータを含有する植物ゲノムの部分を同定する。
【００３３】この種の第１プロモータの例はＴＡ29プロモータ、ＴＡ26プロモータおよびＴＡ13プロモータ（これらについては後記実施例に説明し、タバコから分離されている）およびタペータム特異性プロモータである。他の植物種から得られる他のタペータム特異性第１プロモータは、上記工程４におけるようにプローブとしてＴＡ29，ＴＡ26もしくはＴＡ13遺伝子を用いることにより、そのゲノムから分離することができる。ハイブリッド化条件の下で、この種のプローブは他の植物種のゲノムから得られたＤＮＡ配列の混合物中でタペータム特異性ｍＲＮＡをコードするＤＮＡにハイブリダイズする〔Maniatis等（1982），モレキュラ・クローニング，ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning. A Laboratory Manual)，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版〕。その後、上記工程５におけるように、他のタペータム特異性第１プロモータを同定することができる。
【００３４】2個以上の雄性不稔ＤＮＡが本発明の外来ＤＮＡ配列に存在する場合、これら全ての雄性不稔ＤＮＡは単一の第１プロモータの制御下にあってもよいが、好ましくは各雄性不稔ＤＮＡはそれ自身の別個の第１プロモータの制御下にある。複数の雄性不稔ＤＮＡが外来ＤＮＡ配列に存在する場合、雄性不稔ＤＮＡは同じもしくは異なる第１ＲＮＡ、ポリペプチドおよび蛋白をコードすることができる。たとえば雄性不稔ＤＮＡがＲＮアーゼ（たとえばＲＮアーゼＴ1 ）をコードする場合、雄性不稔ＤＮＡおよびその第１プロモータの少なくとも 3個、特に 4〜6個のコピーを外来ＤＮＡ配列に与えることが好ましい。いずれにせよ、全ての雄性不稔ＤＮＡおよびその第１プロモータは、好ましくは互いに外来ＤＮＡ配列中で隣接し、かつ外来ＤＮＡ配列で植物細胞を形質転換するために使用する任意のベクター中に存在する。
【００３５】本発明においては、マーカーＤＮＡの選択も重要でない。適するマーカーＤＮＡは周知方法で選択しかつ分離することができ、マーカーＤＮＡを発現する植物を、第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドを発現しない植物から容易に区別しかつ分離しうる第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドをコードするようにする。マーカーＤＮＡの例は、植物細胞に対し識別可能な色を付与しうる蛋白、たとえばジヒドロケルセチン-4- レダクターゼをコードするＡ1 遺伝子〔Meyer等（1987），ネイチャー（Nature），第 330巻，第 677〜678 頁〕およびβ−グルクロニダーゼ遺伝子〔Jefferson 等（1988），プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci) ・ＵＳＡ（「ＰＮＡＳ」）、第83巻，第8447頁〕、或いはたとえば矮小な成長または葉の異なる形状など、特定の形態学的特徴を植物に付与する蛋白をコードする。マーカーＤＮＡの他の例は植物に対し次の性質を付与する：ヨーロッパ特許出願第 88/402222.9号に記載されたようなスーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子により付与されるようなストレス耐性；ヨーロッパ特許出願第86／300291.1号に記載された昆虫耐性を付与するBacillus thuringiensisエンドトキシンをコードする遺伝子により付与されるような病気もしくは害虫耐性；またはヨーロッパ特許出願第88／401673.4号に記載された細菌耐性を付与する細菌ペプチドをコードする遺伝子。
【００３６】好適なマーカーＤＮＡは除草剤の作用を阻止し、或いは中和する第２蛋白もしくはポリペプチドをコードし、たとえば次の遺伝子である：ヨーロッパ特許出願第87/400,544.0号に記載されたビオラホスおよびホスフィノトリシンのようなグルタミンシンテターゼ阻該剤に対する耐性を付与する酵素をコードするｓｆｒ遺伝子およびｓｆｒｖ遺伝子；ヨーロッパ特許公開第 0,240,792号に記載されたホスフィノトリシンが標的とするたとえば改変グルタミンシンテターゼおよびヨーロッパ特許公開第 0,218,571号公報に記載されたグリホセート（glyphosate）が標的とする改変5-エノールピルビルシキメート-3ホスフェートシンターゼのような天然産生される内在性酵素よりも低い親和性を除草剤に対して有する或る種の除草剤用の改変標的酵素をコードする遺伝子。
【００３７】マーカーＤＮＡを制御する第２プロモータは、マーカーＤＮＡが 1個もしくはそれ以上の特定組織もしくは特定細胞中で選択的に或いは全植物内に構造的に発現されるよう、所望に応じマーカーＤＮＡによりコードされる第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドの性質に依存して周知方法で選択しかつ分離することができる。たとえばマーカーＤＮＡが除草剤耐性をコードする場合、マーカーＤＮＡは、たとえば35Ｓプロモータ〔Odell 等（1985），ネイチャー(Nature)，第 313巻，第 810〜812 頁〕，35Ｓ′ 3プロモータ〔Hullおよび Howel（1987），バイロロジー（Virology）、第86巻，第 482〜493 頁〕、Ｔｉ−プラスミドにおけるノパリンシンテターゼ遺伝子（「ＰＮＯＳ」）のプロモータ〔Herrera-Estrella（1983），ネイチャー(Nature)，第 303巻，第 209〜213 頁〕またはオクトピンシンターゼ遺伝子（「ＰＯＣＳ」）のプロモータ〔De Greve等（1982），ジャーナル・モレキュラ・アプライド・ジェネチックス（J. Mol. Appl. Genet.），第1(6)巻，第 499〜511 頁〕のような強力な構造第２プロモータを用いて植物の全細胞中で発現させるのが有利である。マーカーＤＮＡが病気抵抗性を付与する蛋白をコードする場合、たとえばＴｉ−プラスミドのＴＲ1'もしくはＴＲ2'プロモータのようなＴＲプロモータを用いてマーカーＤＮＡを傷組織で発現させるのが有利である〔Velten等（1984），ＥＭＢＯ Ｊ．，第 3巻，第2723〜2730頁〕。マーカーＤＮＡが除草剤耐性をコードする場合、マーカーＤＮＡをたとえばルビスコ(Rubisco) の小サブユニットをコードする遺伝子のプロモータにより緑色組織中で選択的に発現させるのが有利である〔ヨーロッパ特許出願第87/400,544.0号〕。マーカーＤＮＡが色素をコードする場合は、たとえば花弁細胞、葉細胞もしくは種子細胞のような特定細胞にて、好ましくは種子被覆の外側層でマーカーＤＮＡを発現させるのが有利である。
【００３８】植物を雄性不稔にしかつ非形質転換植物から容易に識別しうるように組織特異性の第２プロモータを周知方法で次の工程により同定しかつ分離することができる：1. 或る種の組織、たとえばその花弁、葉もしくは種子の発生の際にのみ植物中に存在するｍＲＮＡを探し；
2. この組織特異性ｍＲＮＡを分離し；
3. この組織特異性ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作成し；
4. このｃＤＮＡをプローブとして使用することにより、この組織特異性ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを持った植物ゲノムにおける領域を同定し；次いで 5. 組織特異性ｍＲＮＡをコードするＤＮＡの上流に位置しかつ前記ＤＮＡのプロモータを含有する植物ゲノムの部分を同定する。
【００３９】1個以上のマーカーＤＮＡが本発明の外来ＤＮＡ配列に存在する場合、全マーカーＤＮＡは単一の第２プロモータの制御下にあってもよいが、好ましくは各マーカーＤＮＡはそれ自身の別の第２プロモータの制御下にある。より好ましくは、各マーカーＤＮＡはそれ自身の第２プロモータの制御下にあって形質転換植物に異なる識別可能な特徴を与える異なる第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドをコードする。いずれにせよ、マーカーＤＮＡおよび第２プロモータは互いに隣接しかつ本発明の外来ＤＮＡ配列に含まれる 1個もしくはそれ以上の雄性不稔ＤＮＡに隣接すべきであり、さらに任意のベクター中で使用して外来ＤＮＡ配列により植物細胞を形質転換させる。
【００４０】雄性不稔ＤＮＡによりコードされる第１ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドは雄蕊細胞の細胞質もしくは核中で作用することにより雄蕊細胞の代謝、機能および／または発育を顕著に阻害するのが一般に好適である。しかしながら、第１蛋白もしくはポリペプチドおよび／または第２蛋白もしくはポリペプチドを形質転換植物の細胞の細胞質から葉緑体もしくはミトコンドリア中へ輸送することが望ましければ、外来ＤＮＡ配列はさらに運搬体（transit)ペプチドをコードする追加外来ＤＮＡを含むこともできる。追加ＤＮＡは、第１蛋白もしくはポリペプチドがこのように輸送される場合は雄性不稔ＤＮＡと第１プロモータとの間に位置し、かつ第２蛋白もしくはポリペプチドがこのように輸送される場合はマーカーＤＮＡと第２プロモータとの間に位置する。「運搬体ペプチド」という用語は、葉緑体もしくはミトコンドリア蛋白または蛋白のサブユニット一般に関連しかつ細胞の核ＤＮＡによりコードされる先駆体蛋白として細胞内に産生されるポリペプチド断片を意味する。運搬体ペプチドは、核コードされた葉緑体もしくはミトコンドリア蛋白またはサブユニットを葉緑体もしくはミトコンドリア中へ移動させる過程でその役割を果たし、かつこの過程の間に、運搬体ペプチドは葉緑体もしくはミトコンドリア蛋白もしくはサブユニットから分離され或いは蛋白分解により除去される。 1個もしくはそれ以上のこの種の追加ＤＮＡを本発明の外来ＤＮＡ配列に供給して、一般にヨーロッパ特許出願第85/402,596.2号および第 88/402,222.9号並びにvan den Broeck等（1985），ネイチャー(Nature)，第 313巻，第 358〜363 頁；Schatz（1987），ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J. of Bioch.），第165 巻，第 1〜6 頁；および Boutry 等（1987），ネイチャー(Nature)，第 328巻，第 340〜342 頁に記載されたように 1個もしくはそれ以上の第１もしくは第２蛋白もしくはポリペプチドを輸送することができる。葉緑体中への輸送(transport) に適する運搬体ペプチドの例は酵素ＲＵＢＰカルボキシラーゼの小サブユニットを有する運搬体ペプチド（ヨーロッパ特許出願第85/402,596.2号）であり、かつミトコンドリア中への輸送のための運搬体ペプチドの例は酵素Ｍｎ−スーパーオキシドジスムターゼの運搬体ペプチドである（実施例16参照）。
【００４１】本発明の外来ＤＮＡ配列において、3'転写制御シグナルは、植物細胞における正確な転写停止およびｍＲＮＡのポリアデニル化を可能にするものから選択することができる。転写制御シグナルは、天然の転写される遺伝子の 1種としうるが、外来もしくは異種であってもよい。異種転写制御シグナルの例は、オクトピンシンターゼ遺伝子〔Gielen等（1984），ＥＭＢＯ Ｊ．，第 3巻，第 835〜845頁〕およびＴ−ＤＮＡ遺伝子7 〔VeltenおよびSchell（1985），ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Research）（「ＮＡＲ」）第13巻，第6981〜6998頁〕である。
【００４２】さらに本発明によれば、第１プロモータが花粉発生の所定段階にて、（より好ましくは減数分裂後に）雄性不稔ＤＮＡの発現を行なう本発明の外来ＤＮＡ配列を持った、たとえば葯細胞培養物のような植物細胞培養物を用いて、ホモ接合性の優性雄性不稔植物を再生させることができる〔「Brassica napus からの小胞子の効率的分離および小胞子由来の胚芽の生成」，E. B. Swanson , M. P. Coumans , S. C. Wu, T. L. Barby およびW. D. Beversdorf，プラント・セル・リポート（Plant Cell Reports）（1987），第 6巻，第94〜97頁〕。
【００４３】さらに本発明によれば、ハイブリッド植物に成長させうるハイブリッド種子の生産方法も提供される。１つの方法は、少なくとも１つのマーカーＤＮＡを有する核雄性不稔植物を、マーカーＤＮＡを持たない雄稔性植物と交配させることを含む。雄性不稔植物と雄稔性植物の両者を互いに近接して別々の列に植える。他の方法は、少なくとも２つの異なるマーカーＤＮＡを有する核雄性不稔植物を、これら２つの異なるマーカーＤＮＡの一方のみを共通してホモ接合型で有する雄稔性植物と交配させることを含む。雄性不稔親植物と雄稔性親植物の両者を実質的にランダムな集団として成長させ、正確な植付けパターンの必要なしに他家受粉のチャンスを増大させる。雄稔性親植物を、次いで雄稔性親植物が持たない非共通のマーカーＤＮＡによりコードされる明確な形質を用いて集団から容易に除去することができる。好ましくは、この方法において雄性不稔植物における非共通のマーカーＤＮＡは構成プロモータの制御下にあって、雄性不稔植物を特定の除草剤に対し耐性にする蛋白もしくはポリペプチドをコードする。次いで、雄稔性植物を他家受粉の後に特定の除草剤を用いて死滅させることができる。
【００４４】雄性不稔ＤＮＡにより、好ましくは雄性不稔ＤＮＡと除草剤耐性をコードし、安定に組込まれかつ世代全体にわたり優性対立形質として遺伝させうるマーカーＤＮＡとの両者により、本発明にしたがって形質転換された植物は、ハイブリッド作物を育種しかつ生産するための現在使用されている細胞質雄性不稔システムの代案となり、これらシステムよりも幾つかの利点を与える。この種の利点は次のものを包含する：1. 作物を他家受粉させるため、育種手段がずっと簡単になる。何故なら、商業的に販売されるハイブリッド種子を産生する交雑種の雄稔性親系に回復遺伝子を導入する必要がないからである。事実、商業的な種子生産のための他の雄稔性親系と交配させたヘテロ接合型核雄性不稔親系は50％の雄性不稔ハイブリッド子孫と50％雄稔性ハイブリッド子孫とを生産し、その結果、市販作物は充分な結実、したがって正常な収量を保証するのに充分な花粉を産生する。この種の作物の例はトウモロコシおよびアブラナである。
2. 種子が経済的収穫を示さないような作物にとって、育種手段は同様にずっと簡単になる。何故なら、雄稔性親系で発現される回復遺伝子を必要としないからである。事実、これら作物用に市販されるハイブリッド種子の50％が雄性不稔であってもよい。これら作物の例は甜菜およびアルファルファである。
3. このシステムは現存する同型交配種から一操作で核雄性不稔系と維持系との生産を可能にし、戻し交配の必要性を排除する。これはハイブリッドの胚形成から市販化までの時間を少なくとも 6〜8 世代に亘って短縮させる。雄性不稔ＤＮＡを挿入しかつ発現する植物を親植物として使用するハイブリッド植物の典型的な生産法の例は、次の工程で構成することができる：(1) 近親交配系を交配させかつ組合せ能力および選択された特徴について試験することにより手作業で試験ハイブリッドを作成し（２年間）、(2) 選択されたハイブリッドのそれぞれにおける１つの親系を本発明の目的である方法により核雄性不稔となし（１年間）、(3) 前記工程から得られた核雄性不稔親植物（以下「Ａs 」と称する）およびその維持系（以下「Ａ」と称する）、並びに将来の市販作物の受粉用雄稔性親植物（以下「Ｂ」と称する）を増殖させ（３年間）、この期間中に選択されたハイブリッドを公的な収量試験にかけ（３年間）、(4) 承認されたハイブリッド種子を生産しかつ販売する（１年間）。
4. 除草剤耐性をコードするマーカーＤＮＡを組合せると、この種の核雄不稔系は、必要とされる任意の組合せにて 2−， 3−および 4−ウェイ(way) ハイブリッドの生産を可能にする。雄性不稔ＤＮＡとこれに隣接したマーカーＤＮＡとを2−もしくは 3−ウェイハイブリッドを得るための祖父母育種系の 1種として使用される１つの植物の核ゲノムに導入し或いは 4−ウェイハイブリッドを得るための 2種の祖父母育種系として使用される2 種の植物の核ゲノムに導入すれば充分であると思われる。各育種系を、例として下記する２つの交配（交雑）により維持することができ、ここで「ＳＨ」はそれぞれ雄性不稔（Ｓ）および除草剤耐性（Ｈ）の優性対立形質を示し、かつ「ｓｈ」はそれぞれ雄稔性（ｓ）および除草剤感受性（ｈ）の劣性対立形質を示す：a. ＳＨ／ｓｈ×ｓｈ／ｓｈは50％ＳＨおよび50％ｓｈの子孫を与え、かつＨが耐性を付与する除草剤を噴霧した後に 100％の不稔性植物が得られる。
b. ｓｈ／ｓｈ×ｓｈ／ｓｈは 100％稔性子孫を与える。
5. これは雄不稔系に組込まれたマーカーＤＮＡの保有体を保護する。何故なら、競争相手が自分の所有する育種系に前記マーカーＤＮＡを組込むことを一層困難にするからである。
【００４５】例示の目的で、本発明にしたがう２つの作物育種方式を示せば次の通りである：方式１：隣接した雄性不稔ＤＮＡと除草剤耐性をコードするマーカーＤＮＡとを有する植物の育種（1A）雄性不稔系Ａs の維持：ＡSH/sh 系×Ａsh/sh 系からは次の種子が得られる：50％ＡSH/sh （表現型：雄性不稔，除草剤耐性）、50％Ａsh/sh （表現型：雄稔性，除草剤感受性）。
（1B）ハイブリッド種子作物の生産：(a) Ｂsh/sh （雄植物）の種子、並びにＡSH/sh およびＡsh/sh よりなる交配（1A）（「雌」植物）により得られた種子を別々の列に植え、(b) 雌の列に除草剤を噴霧して遺伝子型Ａsh/sh を除去し、(c) 次のように他家受粉を行ない：ＡSH/sh ×Ｂsh/sh およびＢsh/sh ×Ｂsh/sh からは雌列に次の種子が得られる：50％ＡＢSH/sh （表現型：ハイブリッド，雄性不稔、除草剤耐性）、50％ＡＢsh/sh （表現型：ハイブリッド，雄稔性、除草剤感受性）、さらに雄列に次の種子が得られる：100 ％Ｂsh/sh ，(d) 雄列に生じた遺伝子型Ｂsh/sh を除草剤の噴霧により或いは機械的手段により除去し、(e) 上記工程(c) の他家受粉が生じた雌列のハイブリッド種子を収穫する。これは市販される種子である。
方法２：雄性不稔ＤＮＡとそれぞれ異なる除草剤耐性をコードする 2種のマーカーＤＮＡ（Ｈ1 およびＨ2)とを有する植物の育種（2A）雄性不稔系Ａs の維持：ＡS ：ＡSH1H2/sh1h2 ×Ａsh1h2/sh1h2 からは次の種子が得られる：50％ＡSH1H2/sh1h2 （表現型：雄性不稔，両除草剤に対し耐性）、50％Ａsh1h2/sh1h2 （表現型：雄稔性，両除草剤に対し感受性）。
（2B）受粉系Ｂの維持：Ｂsh1H2/sh1H2 ×Ｂsh1H2/sh1H2 からは次の種子が得られる：100 ％Ｂsh1H2/sh1H2 （表現型：雄稔性，除草剤1 に対し感受性かつ除草剤2に対し耐性）。
（2C）ハイブリッド種子作物の生産：(a) 上記（2A）から得られた種子および（2B）から得られた種子をランダムに植える。
(b) 畑地に除草剤2 を噴霧して遺伝子型Ａsh1h2/sh1h2 を除去する。
(c) 他家受粉を行なう：ＡSH1H2/sh1h2 ×Ｂsh1H2/sh1H2 からは次の種子が得られる：50％ＡＢSH1H2/sh1H2 、および50％ＡＢsh1h2/sh1H2 。
さらに自家受粉を行なう：Ｂsh1H2/sh1H2 ×Ｂsh1H2/sh1H2 からは次の種子が得られる：100％Ｂsh1H2/sh1H2 。
(d) 自家受粉が生じた親系Ｂから得られた遺伝子型Ｂsh1H2/sh1H2 を有する植物を、畑地に除草剤1 を噴霧して除去する。
(e) 上記(c) の他家受粉により得られた残余の植物ＡSH1H2/sh1H2 のハイブリッド種子を収穫する。
【００４６】
【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。これら実施例において説明する図面は次の通りである：第１図は実施例１のｐＴＡ29Ｓ3 におけるＴＡ29ｃＤＮＡおよびそのＣlaＩ断片の制限マップを示し、第２図は実施例２のＴＡ29遺伝子におけるＰstＩ断片のｃＤＮＡ配列を示し、第３Ａ図はＴＡ29遺伝子のＣlaＩ部位からＨind ＩＩＩ部位に至るＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示し、これら配列の上に重要な制限部位を示すと共に、配列の下にはＯＲＦによりコードされたアミノ酸配列を示し、さらに−ヌクレオチド（「nt」）1446〜1452にはＴＡＴＡボックス（星印）、−nt1477にはＴＡ29ｍＲＮＡの転写開始部位（星印）、−nt1514〜1537には実施例２に説明する合成オリゴマーの3'〜5'配列、および−nt1940〜2296（矢印の間）にはＴＡ29ｃＤＮＡの配列をも示し、第３Ｂ図は実施例４で説明するＴＡ13ｃＤＮＡ（上側ライン）およびＴＡ29ｃＤＮＡ（下側ライン）の配列（alignment)を示し、さらに垂直線により相同ヌクレオチドを示し、第３Ｃ図は実施例４で説明するＴＡ26ｃＤＮＡの配列を示し、ここでＯＲＦに下線を施こし、第４Ａ図は実施例３のベクターｐＭＢ2 の構築（作成）を図示し、第４Ｂ図は実施例３のベクターｐＭＢ3 のマップを示し、第５図は実施例５のベクターｐＴＴＭ3 のマップを示し、第６図は実施例７のベクターｐＴＴＭ4 のマップを示し、第７Ａ図は実施例９のベクターｐＴＴＭ6 のマップを示し、第７Ｂ図は実施例11のベクターｐＴＴＭ6 Ａ- のマップを示し、第８図は実施例12のベクターｐＴＴＭ8 のマップを示し、第９Ａ図は実施例14のベクターｐＴＶＥＰ1 のマップを示し、第９Ｂ図は実施例14のベクターｐＴＶＥＰ2 のマップを示し、第10Ａ図は実施例16のベクターｐＴＶＥＰ63のマップを示し、第10Ｂ図は実施例16のベクターｐＴＶＥＰ62のマップを示し、第11図は実施例９の雄性不稔ＤＮＡで形質転換されたタバコ植物の花と比較した正常なタバコ植物の花の写真を示し、第12図は実施例９の雄性不稔ＤＮＡで形質転換されたタバコ植物の葯と比較した正常なタバコ植物の葯の横断面の写真（倍率 250倍）を示す。
【００４７】実施例において特記しない限り、組換えＤＮＡを作成しかつ操作する手順は全て Maniatis等、モレキュラ・クローニング，ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning-A Laboratory Manual ），コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（1982）に記載された標準法を用いて行なった。実施例で用いた次のプラスミドおよびベクターは西ドイツ連邦共和国、ブラウンシュバイクＤ−3300，マシェルオーダー・ウェーク 1Ｂ在、ドイッチェ・ザンムルンク・フュル・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルチューレン（「ＤＳＭ」）にブタペスト条約の規定に従って寄託されている：【００４８】
【表】
【００４９】実施例１：葯特異性遺伝子（「ＴＡ29遺伝子」）のサブクローン化カリホルニア大学，ロサンゼルス（ＵＣＬＡ）のロバート・ゴールドバーグ教授から次のものを入手した：ＧＣテーリングによりｐＢＲ329 〔Covarrubias および Bolivar（1982），ジィーン（Gene），第17巻，第79頁〕においてＰstＩ断片としてクローン化したNicotiana tabacum の葯特異性ｃＤＮＡ（「ＴＡ29ｃＤＮＡ」）；並びにＴＡ29ｃＤＮＡをプローブとして用いることによりN. tabacum“Samsun”ゲノムライブラリーから分離しかつλファージベクターｃＨ32〔LoenenおよびBlattner（1983），ジーン（Gene），第26巻，第 171頁〕のＥcoＲＩ部位に挿入された対応のゲノムクローン（「λＴＡ29」）。このＴＡ29ｃＤＮＡは長さ 365塩基対（±0.4kb)であって、N. tabacumの葯から得られたポリＡ+ ｍＲＮＡの0.24％を示す 1,100ヌクレオチドのタペータム特異性ｍＲＮＡにハイブリダイズ化させた。第１図に示したように、λＴＡ29は 2個のＥcoＲＩ断片を有し、全挿入物は13.2kbの測定値を有する。
【００５０】第１図に示した如くＴＡ29遺伝子を有する内部 7.5kbのＣlaＩ断片をλＴＡ29からｐＬＫ31〔Botterman およびZabeau（1987），ＤＮＡ，第 6巻，第 6頁〕にサブクローン化させ、これは「ｐＴＡ29Ｓ3 」と呼ばれるプラスミドを生産する。ＥcoＲＩ／ＣlaＩ／Ｈind ＩＩＩ／Ｈind ＩＩＩ−ＥcoＲＩの組合せおよびＣlaＩ−ＥcoＲＩの組合せで消化されかつＴＡ29ｃＤＮＡに対しハイブリダイズ化されたλＴＡ29のニトロセルロース結合断片は、ＴＡ29ｃＤＮＡに相同の配列の存在を示した。
【００５１】実施例２：ｐＴＡ29Ｓ3 由来のＴＡ29ｃＤＮＡおよびその相同配列のヌクレオチド配列決定：ＴＡ29遺伝子およびそのプロモータの地図化ｐＢＲ329 におけるＴＡ29ｃＤＮＡのＰstＩ挿入物を完全に配列決定した〔Maxam およびGilbert （1977），プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci.）・ＵＳＡ（「ＰＮＡＳ」），第74巻，第 560頁〕。このｃＤＮＡ配列を第２図に示す。これは全ｃＤＮＡ配列（示した通り）にわたり1 個のオープンリーディングフレームの存在を示す。
【００５２】次いで、ｐＴＡ29Ｓ3 におけるＣlaＩ挿入物の配列をＣlaＩ部位からＨind ＩＩＩ部位まで（3261塩基対の間隔）決定した。ＴＡ29ｃＤＮＡ配列とｐＴＡ29Ｓ3 配列との比較は、ＴＡ29ｃＤＮＡ配列と完全に相同であるｐＴＡ29Ｓ3 における配列の存在を示した。
【００５３】第３図はｐＴＡ29Ｓ3 におけるＴＡ29遺伝子の配列を示している。ＴＡ29 ｃＤＮＡ配列と同一であるｐＴＡ29Ｓ3 における配列は、第３図において矢印の間に存在する。オープンリーディングフレームは、第３図にて対応のアミノ酸配列により示される。これは、ＴＡ29遺伝子が 321個のアミノ酸残基の蛋白をコードしかつコード化領域にはイントロンが存在しないことを示している。 964（＋リーダー）ヌクレオチドのオープンリーディングフレームの長さは、若い（長さ12〜20mm）のタバコ蕾から分離した葯から作成されるタバコ葯ｍＲＮＡに存在しかつ葉および旧花（蕾が開きかつ花弁が発生したもの）から分離されたｍＲＮＡには存在しない転写物の寸法と一致する。このｍＲＮＡの寸法は約1100ヌクレオチドである。
【００５４】一方がヌクレオチド（「nt」）1527に位置しかつ他方がnt1560に位置する 2個のＡＴＧコドンが存在し、これらは33ヌクレオチドの間隔のオープンリーディングフレームに対する開始コドンとして作用しうる。第１ＡＴＧコドンの81ヌクレオチド5'上流に位置するnt1446には共通配列ＴＡＴＡが存在する（第３図に星印で示す）。この「ＴＡＴＡ」ボックスがＴＡ29遺伝子のプロモータの一部であることを確認するため、ＴＡ29ｍＲＮＡの5'末端を決定した。これは、プライマー伸長〔Mc Knight 等（1981），セル（Cell），第25巻，第 385頁〕により行なった。この目的で、配列5' ＧＧＡ ＧＣＴ ＡＣＣ ＡＴＴ ＴＴＡ ＧＣＴＡＡＴ ＴＴＣ 3'を有する24ヌクレオチドのオリゴマーを使用した。何故なら、これは第３図に示すようにnt1514からnt1537までＴＡ29遺伝子に対し相補的であるからである。
【００５５】このオリゴヌクレオチドを5'末端でのリン酸化（kination）により32Ｐ標識した。葯ｍＲＮＡとハイブリダイズ化させた後、オリゴヌクレオチドを逆転写酵素により伸長させた。得られた伸長オリゴヌクレオチドを配列決定ゲルに続き配列決定ラダーで分析してその正確な寸法を決定した。この断片は長さ61ヌクレオチドであることが示された。これは、ＴＡ29ｍＲＮＡの転写開始がnt1477で生じたことを示す（第３図にて星印で示す）。したがって、ＴＡ29遺伝子は転写開始部位の31ヌクレオチド上流に位置するＴＡＴＡボックスを有する。ｍＲＮＡはnt1477からnt1527に至る長さ51ヌクレオチドのリーダー配列とnt1527からnt2491に至る 964ヌクレオチドのコード化領域とnt2492からnt2590に至る約 100ヌク レオチドの3'非コード化領域とを有する。現在特性化されている植物遺伝子〔Joshin(1987)，ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Research)，（「ＮＡＲ」），第15巻，第16号，第6643頁〕の約92％における場合のように、ｍＲＮＡの最初のＡＵＧコドンは翻訳を開始させるために使用されると思われる。したがって、ＴＡ29プロモータはＣlaＩ制限部位とnt1477との間に位置すると思われる。
【００５６】実施例３：ＴＡ29遺伝子から誘導されるプロモータカセット（「ＰＴＡ29」）の構築第１の異型雄性不稔ＤＮＡと同じ転写単位に位置しかつこれを制御するＴＡ29遺伝子の5'制御配列（プロモータを含む）を含むキメラＤＮＡ配列を構築するため、ｐＴＡ29Ｓ3 からの2.5kb ＣlaＩ／ＡccＩ断片をｐＭＡＣ5-8 のポリリンカーＡccＩ部位にサブクローン化させることにより第４図に示したようにカセットを作成した（ヨーロッパ特許出願第87／402348.4号）。これは、第４図に示した「ｐＭＢ2 」と呼ばれるベクターをもたらし、このベクターを用いて部位特異的突然変異に使用するための一本鎖ＤＮＡを分離することができた。
【００５７】次いで、第１のＡＴＧコドンを包囲する配列ＡＡＡＡＴＧＧＴＡをシトシン残基の代りに 2個のアデニン残基を用いてＡＣＣＡＴＧＧＴＡに改変させた。この突然変異は配列ＣＣＡＴＧＧを形成し、この配列は制限酵素ＮcoＩの認識部位である。ｐＭＢ2 におけるこの部位特異的突然変異は、次の配列を有する24ヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドを用いて行なった：3' GTT TAA TCG ATG GTA CCA TCG AGG 5'新たに形成されたＮcoＩ部位を有する得られたプラスミドを「ｐＭＢ3 」と名付け、これを第４Ｂ図に示す。ＮcoＩ部位を有する正確なヌクレオチド配列を決定して、これがＴＡ29遺伝子の5'配列とはＡＡ -- ＣＣ置換だけ相違してＮcoＩ部位を形成することを確認した。長さ1507ヌクレオチドの断片ＣlaＩ--ＮcoＩを「ＰＴＡ29」と名付けた。
【００５８】実施例４：他の雄蕊特異性ｍＲＮＡから得られたｃＤＮＡクローンの同定他の葯特異性ｍＲＮＡを同定し、次いでこれを使用してＴＡ29遺伝子と同類の性質を有するｃＤＮＡクローンを分離しうることを示すため、他の 2種のN. tabacum葯特異性ｃＤＮＡ（「ＴＡ13ｃＤＮＡ」および「ＴＡ26ｃＤＮＡ」）をＵＣＬＡのゴールドバーグ教授から入手した。
【００５９】ＴＡ13ｃＤＮＡは1100bpのクローンであって、タペータム細胞に特異性でありかつ極めて早期の葯発育段階の際に多量に存在するそれぞれ約1100および1200ヌクレオチドの 2種のｍＲＮＡにハイブリダイズ化したものである。ＴＡ13ｃＤＮＡを実施例２の手順により配列決定し、次いで第３Ｂ図に示したようにＴＡ29ｃＤＮＡの配列と比較した。この配列の比較は、ＴＡ13ｃＤＮＡおよびＴＡ29ｃＤＮＡが92％の類似性を有しかつＯＲＦがグリシン含有量につき極めて多いことを示す。
【００６０】ＴＡ26ｃＤＮＡを、ポリ−Ｇ／ＣテーリングによりｐＢＲ329 中へＰstＩ挿入物としてクローン化させた。これは 580ヌクレオチドの 1種のタバコｍＲＮＡにハイブリッド化した 519bpのクローンであって、前記ｍＲＮＡはタペータム細胞に対し特異性であると共に所定の葯発育段階にて多量に存在する。全ＴＡ26ｃＤＮＡを実施例２の手順により配列決定し、これはＴＡ29ｃＤＮＡの配列と比較した際に相同性（homology）を全く示さなかった。ＴＡ26ｃＤＮＡの配列を第３Ｃ図に示す。
【００６１】実施例５：ＰＴＡ29およびβ−グルクロニダーゼ遺伝子のキメラＤＮＡ配列の構築第５図に示す「ｐＴＴＭ3 」と生するプラスミドを、次の周知のＤＮＡ断片を組合せて構築した：1. ｐＧＳＣ1600から誘導されたＴ−ＤＮＡ境界配列を有するベクター断片；
2. 実施例３からのプロモータカセットＰＴＡ29を含有し、β−グルクロニダーゼをコードするE.coli遺伝子（「ＧＵＳ」〔Jefferson 等（1986），ＰＮＡＳ，第83巻，第8447頁；Jefferson 等(1987)，ＥＭＢＯ Ｊ．，第 6巻，第3901頁〕）およびオクトピン−シンターゼ遺伝子の3'末端シグナル（「ＯＣＳ」〔Dhaese等（1983），ＥＭＢＯ Ｊ．，第 2巻，第 419頁〕）を有するｐＭＢ3 ＮcoＩ／ＥcoＲＩ断片とフレームに融合したキメラ配列；
3. Arabidopsis ＳＳＵプロモータ（「ＰＳＳＵ」もしくは「ＰＳＳＵＡＲＡ」）と除草剤耐性遺伝子ｓｆｒ（ヨーロッパ特許出願第87/400,544.0号）とＴ−ＤＮＡ遺伝子7 の3'末端シグナル〔VeltenおよびSchell（1985），ＮＡＲ，第13巻，第6981頁〕とを有するキメラ配列；および4. ノパリン−シンターゼプロモータ（「ＰＮＯＳ」）とカナマイシン耐性をコードするｎｅｏ遺伝子とオクトピンシンターゼ遺伝子（ヨーロッパ特許出願第87/400,544.0号）の3'末端シグナルとを有するｐＧＳＦＲ401 （ここでｐＧＳＦＲ401 を「ｐＧＳＲ4 」と呼ぶ）からのＥcoＲＩ／ＳacＩ断片を有するキメラ配列。ｐＴＴＭ3 は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列内に次の 2個のキメラ配列を有するＴ−ＤＮＡベクターである：すなわちｓｆｒが第２プロモータとしてのＰＳＳＵの制御下にあるマーカーＤＮＡ（ヨーロッパ特許出願第87/400,544.0号）となるＰＳＳＵ−ｓｆｒ；およびＧＵＳがリポータ遺伝子であってＴＡ29プロモータの制御下における植物および植物細胞でのその発現を容易に確認しかつ定量化しうるＰＴＡ29−ＧＵＳ。
【００６２】実施例６：タバコ中への実施例５のキメラＤＮＡ配列の導入E. coll からのｐＴＴＭ3 （実施例５から）をｐＧＶ2260を含有するAgrobacterium Ｃ58Ｃ1 ＲifR 〔De Blaere 等(1985)，ＮＡＲ，第13巻，第4777頁〕中へ移動させることにより、組換えAgrobacterium 菌株を作成した。移動は、ヨーロッパ特許公開第 0,116,718号に記載されたようにヘルパーとしてｐＲＫ2013〔Figurski等（1979），ＰＮＡＳ，第76巻，第1648頁〕を有するE.coliＨＢ101 を用いて行なった。得られたAgrobacterium 菌株は、ｐＧＶ2260とｐＴＴＭ3 とからなるハイブリッドＴｉ−プラスミドを含有していた。
【００６３】この菌株を用いて、たとえばヨーロッパ特許出願第87/400,544.0号に記載されたような標準法によりタバコ葉ディスク（N. tabacum Petite Havane SR1）を形質転換させた。形質転換されたカルスとシュートとを培地中の 5mg／〓の除草剤ホスフィノトリシンを用いて選択した〔De Block等(1987)，ＥＭＢＯ Ｊ．，第6巻，第2513頁〕。形質転換された除草剤耐性のカルスおよびシュートには、β−グルクロニダーゼ酵素活性が検出されなかった。
【００６４】次いで、形質転換されたシュート組織を発根させ、温室内の土壌に移し、開花するまで成長させた。花を検査し、雄蕊の葯におけるタペータム細胞のみがβ−グルクロニダーゼ活性を有することが判明した。これは、ＴＡ29プロモータがβ−グルクロニダーゼ遺伝子と同様に異種遺伝子の発現を植物のタペータム細胞中で選択的に誘起しうることを示している。
【００６５】実施例７：ＰＴＡ29および遺伝子4 のキメラＤＮＡ配列の構築第６図に示した「ｐＴＴＭ4 」と名付けるプラスミドを、次の周知のＤＮＡ断片を組合せて構築した：1. ｐＧＳＣ1700〔Cornellisen およびVandewiele(1989)，ＮＡＲ，第 17 (1)巻，第19〜29頁〕から誘導されたＴ−ＤＮＡ境界配列を有するベクター断片；
2. 除草剤耐性遺伝子ｓｆｒおよびＴ−ＤＮＡ遺伝子7 の3'末端の発現を制御するＰＳＳＵプロモータを持った実施例５のキメラ配列（No.3)；
3. ｎｅｏ遺伝子およびオクトピンシンターゼ遺伝子の3'末端の発現を制御するＰＮＯＳプロモータを持った実施例５のキメラ配列（No.4)；および4. 実施例３からのＰＴＡ29プロモータカセットを含み、それ自身の3'末端転写制御シグナルを有するイソペンテニルトランスフェラーゼをコードするAgrobacterium Ｔ−ＤＮＡ遺伝子〔Akiyoshi等（1984），ＰＮＡＳ，第76巻，第5994頁；Barry 等（1984），ＰＮＡＳ，第81巻，第4776頁〕とフレーム中で融合したキメラ配列。
【００６６】ｐＴＴＭ4 は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列内に次のキメラ配列を有する 2成分型のＴ−ＤＮＡベクターである：すなわちＰＳＳＵ−ｓｆｒおよびＰＮＯＳ−ｎｅｏ〔ここでｓｆｒおよびｎｅｏ遺伝子は植物に関する優性の選択可能なマーカーをコードすると共に第２プロモータとしてのそれぞれＰＳＳＵおよびＰＮＯＳの制御下にある標識ＤＮＡである〕；およびＰＴＡ29−遺伝子4 〔ここで遺伝子4 は第１プロモータとしてのＰＴＡ29の制御下にありかつサイトカイニンの生産向上を生ぜしめる酵素イソペンテニルトランスフェラーゼをコードする雄性不稔ＤＮＡである〕。ＴＡ29プロモータの制御下でのタペータム細胞におけるサイトカイニン生産の増大は、タペータム細胞の代謝および器官形成を阻害する。
【００６７】実施例８：タバコ中への実施例７のキメラＤＮＡ配列の導入実施例６に記載したように、ｐＴＭＭ4 （実施例７から）を、E.coliからの移動によりAgrobacterium Ｃ58Ｃ1 ＲifR 中に導入した。得られたAgrobacterium菌株は、ｐＧＶ2260とｐＴＴＭ4 とからなる 2成分型Ｔｉ−プラスミドを含有していた。
【００６８】また、実施例６に記載したように、この菌株を用いてタバコ葉ディスクを形質転換させ、形質転換されたカルスおよびシュート組織を 5mg／ｌのホスフィノトリシンを用いて選択した。形質転換された除草剤耐性のシュート組織を発根させたところ、遺伝子4 がまだ形質転換植物で発現されていないことを示した。
【００６９】次いで、これら植物を温室内の土壌に移し、開花するまで成長させた。花を検査し、機能性のタペータム細胞はその雄蕊の葯に存在しなかった。これは、ＴＡ29プロモータが異種遺伝子4 の発現を植物のタペータム細胞中で選択的に誘起しうることを示す。
【００７０】実施例９：ＰＴＡ29およびＲＮアーゼＴ1 遺伝子のキメラＤＮＡ配列の構築第７Ａ図に示した「ｐＴＴＭ6 」と生するプラスミドを、次の周知のＤＮＡ断片を組合せて構築した：1. ｐＧＳＣ1600からのＴ−ＤＮＡ境界配列を有するベクター断片；
2. ＰＳＳＵプロモータと除草剤耐性遺伝子ｓｆｒとＴ−ＤＮＡ遺伝子7 の3'末端とを有する実施例５のキメラ配列（No.3)；および3. 実施例３からのｐＴＡ29プロモータカセットを有し、A. orhyzaeからのＲＮアーゼＴ1 〔Quaas 等，「ビオホスフェートおよびその同族体の合成、構造、代謝および活性（Biophosphates and their Analogeus-Synthese, Structur, Metabolism and Activity ）」(1987)，エルセビール・サイエンス・パブリッシャＢ．Ｖ．（Elsevier Science Pulisher B. V. ），アムステルダム；Quaas 等(1988)，ヨーロピアン・ジャーナル・バイオケミストリー（Eur. J. Biochem.），第173巻，第 617〜622 頁〕およびノパリンシンターゼ（「ＮＯＳ」）遺伝子 〔An等（1985），ＥＭＢＯ Ｊ．，第4(2)巻，第 277頁〕の3'末端シグナルをコードする合成遺伝子とフレーム内で融合したキメラ配列。
【００７１】ｐＴＴＭ6 は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列内に次の２種のキメラ配列を有するＴ−ＤＮＡベクターである：すなわち第２プロモータとしてのＰＳＳＵの制御下にある標識ＤＮＡであるＰＳＳＵ−ｓｆｒ；および第１プロモータとしてのＰＴＡ29の制御下にある雄性不稔ＤＮＡであるＰＴＡ29−ＲＮアーゼＴ1 遺伝子。ＴＡ29プロモータの制御下における雄性不稔ＤＮＡのタペータム細胞での発現は、細胞に対し致死性であるＲＮアーゼＴ1 を生産するが、これはＲＮアーゼＴ1 がこれら細胞の代謝に不可欠なＲＮＡ分子を分解するからである。
【００７２】実施例10：タバコ中への実施例９のキメラＤＮＡ配列の導入実施例６に記載したように、E. coli からのｐＴＴＭ6 （実施例９から）をAgrobacterium Ｃ58Ｃ1 ＲifR 中へ移動させることにより、組換えAgrobacterium菌株を作成した。得られたｐＧＶ2260およびｐＴＴＭ6 からなるＴｉ−プラスミドが同時に組込まれたAgrobacterium 菌株を用いて、タバコ葉ディスクを形質転換させた。形質転換されたカルスおよびシュート組織を、 5mg／ｌのホスフィノトリシンを用いて選択した。ＲＮアーゼＴ1 遺伝子が形質転換された除草剤耐性カルスおよびシュート中で発現されないことが、その成長によって示された。
【００７３】形質転換したシュート組織を発根させ、温室内の土壌に移し、開花するまで成長させた。形質転換したタバコ植物は、その葯以外は正常な花を発生した。これら葯は正常な形状を有するが、その後の時点で裂開し、形質転換されてないタバコ植物の葯と対照的である（第11図参照）。裂開すると、形質転換植物からは殆んどまたは全く花粉が放出されず、かつ形質転換植物により形成された花粉粒は正常な花粉粒よりも容積が約50〜100 倍小さく、さらに不規則な形状であった。さらに、形質転換植物からの花粉粒の大部分は発芽せず、形質転換植物からの花粉の発芽効率は正常な花粉粒の発芽効率の約 0〜20％であった。さらに、形質転換植物は自家受粉により（天然の自家受粉によっても或いは手作業による自家受粉によっても）種子を生産しなかった。
【００７４】形質転換植物の薄層断面による顕微鏡観察は、正常なタペータム層が形成されず、かつ花粉袋が空のままとなることを示した（第12図参照）。これは、ＴＡ29プロモータが異種ＲＮアーゼＴ1 遺伝子の発現を形質転換植物のタペータム細胞中で選択的に誘起しうることを示し、さらにＲＮアーゼＴ1 がタペータム細胞の機能を充分に阻害して植物を雄性不稔にすることを示す。
【００７５】実施例11：アブラナ中への実施例９のキメラ配列の誘導体の導入E.coliからのｐＴＴＭ6 Ａ- をｐＭＰ90を有するAgrobacterium Ｃ58ＲifR 〔Koncz およびSchell（1986），モレキュラ・ゼネラル・ジェネチックス（Mol. Gen. Gentics ），第 204巻，第 383〜396 頁〕中へ移動させることにより、組換えAgrobacterium 菌株を作成した。ｐＭＰ90はvir およびtrans 機能を与えるが、アンピシリン耐性をコードする遺伝子を持たない。第７Ｂ図に示したように、ｐＴＴＭ6 Ａ- はＰＴＴＭ6 （実施例９から）の誘導体であって、アンピシリン耐性をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子がこのβ−ラクタマーゼ遺伝子のＳcaＩ部位に対するＤＮＡ配列の挿入により失活されている。
【００７６】ｐＭＰ90とｐＴＴＭ6 Ａ- とを有する得られたAgrobacterium 菌株（「Ａ3144」と称する）を用いて、Lloyd 等（1968），サイエンス（Science ），第 234巻，第 464〜466 頁およびKlimaszewska等（1985），プラント・セル・ティシュー・オーガン・カルチャー（Plant Cell Tissue Organ Culture ），第 4巻，第 183〜197 頁の方法にしたがってBrassica napus を形質転換させた。カルベニシリンを用いて、同時培養した後にＡ3144を死滅させた。形質転換したカルスを 5mg／ｌのホスフィノトリシンと 100μｇ／ｍｌのカナマイシンとを用いて選択し、耐性カルスを植物中に再生させた。シュートおよび根を誘発させた後、形質転換体を温室に移し、開花するまで成長させた。これらの花を検査し、実施例10に記載した形質転換タバコ植物につき観察されたと実質的に同じ表現型を示した。これは、ＴＡ29プロモータが異種ＲＮアーゼＴ1 遺伝子の発現をタバコ以外の植物のタペータム細胞中で選択的に誘起して、この種の他の植物を雄性不稔にしうることを示す。
【００７７】実施例12：ＰＴＡ29およびバルナーゼ遺伝子のキメラＤＮＡ配列の構築第８図に示した「ｐＴＴＭ8 」と称するプラスミドを、次の周知の断片を組合せて構築した：1. ｐＧＳＣ1700〔Cornelissen およびVandewiele（1989），ＮＡＲ，第 17(1)巻，第19〜29頁〕から誘導されかつβ−ラクタマーゼ遺伝子（第８図の1'）がそのＳcaＩ部位中へのＤＮＡ配列の挿入により失活されているＴ−ＤＮＡ境界配列を有するベクター断片；
2. ＰＳＳＵプロモータと除草剤耐性遺伝子ｓｆｒとＴ−ＤＮＡ遺伝子7 の3'末端とを有する実施例５のキメラ配列（No.3)；
3. ＰＮＯＳプロモータとｎｅｏ遺伝子とオクトピンシンターゼ遺伝子の3'末端とを有する実施例５のキメラ配列（No.4)；および4. 実施例３からのＰＴＡ29プロモータカセットを有し、Bacillus amiloliquefaciens〔Hartley およびRogerson（1972），プレパラティブ・バイオケミストリー（Preparative Biochemistry），第2(3)巻，第 243〜250 頁〕からのバルナーゼ遺伝子および実施例９のノパリンシンターゼ遺伝子の3'末端とフレーム内で融合したキメラ配列。
【００７８】ｐＴＴＭ8 は 2成分型Ｔ−ＤＮＡベクターであって、Ｔ−ＤＮＡ境界配列内に次の 3種のキメラ配列を有する：すなわちＰＳＳＵ−ｓｆｒおよびＰＮＯＳ−ｎｅｏ〔これらはそれぞれ第２プロモータとしてＰＳＳＵおよびＰＮＯＳを有するマーカーＤＮＡである〕；並びにＰＴＡ29−バルナーゼ遺伝子〔これは第１プロモータとしてのＰＴＡ29の制御下にある雄性不稔ＤＮＡである〕。ＴＡ29プロモータの制御下における雄性不稔ＤＮＡのタペータム細胞中での発現はバルナーゼをタペータム細胞中で選択的に産生する結果、バルナーゼはこれら細胞の代謝を阻害する。
【００７９】実施例13：タバコおよびアブラナ中への実施例12のキメラＤＮＡ配列の導入実施例11に記載したように、E.coliからのｐＴＴＭ8 （実施例12から）をｐＭＰ90を有するAgrobacterium Ｃ58Ｃ1 ＲifR 〔Koncz およびSchell（1986），モレキュラ・ゼネラル・ジェネチックス（Mol. Gen. Genetics），第 204巻，第 383〜396 頁〕中に移動させることにより、組換えAgrobacterium 菌株を作成した。ｐＭＰ90とｐＴＴＭ8 とを有する得られた菌株（「Ａ3135」と称する）をタバコ葉ディスクの形質転換およびアブラナの形質転換に使用した。形質転換されたカルスおよびシュート組織を 5ｍｌ／ｌのホスフィノトリシンおよび 100μｇ／ｍｌのカナマイシンを用いて選択した。バルナーゼ遺伝子は形質転換された除草剤耐性カルスおよびシュートにて発現されないことが、その成長により示された。 形質転換されたシュート組織を発根させ、温室内の土壌に移し、開花するまで成長させた。タバコおよびアブラナの両者の花を検査し、形質転換植物につき表現系を観察したところ、実施例10に記載した形質転換タバコ植物の表現型と実質的に同じであった。これは、ＴＡ29プロモータが異種バルナーゼ遺伝子の発現を植物のタペータム細胞中で選択的に誘起することにより、これら植物を雄性不稔にしうることを示している。
【００８０】実施例14：ｐＴＡ29およびパパインをコードする遺伝子のキメラＤＮＡ配列の構築第９Ａ図に示した「ｐＴＶＥＰ1 」と称するプラスミドを、次の周知の断片を組合せて構築した：1. ｐＧＳＣ1700から誘導されたＴ−ＤＮＡ境界配列を有しかつβ−ラクタマーゼ遺伝子（第９Ａ図の1'）がＳcaＩ部位中へのＤＮＡ配列の挿入により失活されているベクター断片；
2. ＰＳＳＵプロモータと除草剤耐性遺伝子ｓｆｒとＴ−ＤＮＡ遺伝子7 の3'末端とを有する実施例５のキメラ配列（No.3)；
3. ＰＮＯＳプロモータとｎｅｏ遺伝子とオクトピンシンターゼ遺伝子の3'末端とを有する実施例５のキメラ配列（No.4)；および4. 実施例３からのＰＴＡ29プロモータカセットを有し、これらが次のものとフレーム内で融合したキメラ配列：(a) ペプチド結合並びにエステル結合を攻撃しうる植物エンドペプチダーゼ〔Cohen 等（1986），ジーン（Gene），第48巻，第219 〜227 頁〕であるパパインチモーゲンをコードし、Cohen 等（1986）のＤＮＡ配列にて実施例３に記載したような部位特異的突然変異を用いて次の改変がなされたCarica papaya果実からのパパイン遺伝子：ｉ．第１ＡＴＧコドンの上流の位置−1 におけるヌクレオチドＡがヌクレオチドＣに突然変異して適するＮcoＩクローン化部位を得る；かつii．それぞれ位置47， 118， 135にてグルタミン酸をコードするＧＡＡコドンを、グルタミンをコードするＣＡＡコドンに突然変異させる；さらに(b) 実施例９のノパリンシンターゼ遺伝子の3'末端。
【００８１】ｐＴＶＥＰ1 は 2成分型のＴ−ＤＮＡベクターであって、Ｔ−ＤＮＡ境界配列内に次の 3種のキメラ配列を有する：すなわちＰＳＳＵ−ｓｆｒおよびＰＮＯＳ−ｎｅｏ〔これらは植物形質転換体に関する選択可能な優性標識を第２プロモータとしてのそれぞれＰＳＳＵおよびＰＮＯＳの制御下でコードするマーカーＤＮＡである〕；並びにＰＴＡ29−パパイン遺伝子〔これは第１プロモータとしてのＰＴＡ29の制御下にある雄性不稔ＤＮＡである〕。ＴＡ29プロモータの制御下における雄性不稔ＤＮＡのタペータム細胞中での発現は、これらタペータム細胞中で蛋白を開裂することによりこれら細胞の死滅をもたらすエンドペプチダーゼ（パパインチモーゲン）を生産する。
【００８２】第９Ｂ図に示した「ｐＴＶＥＰ2 」と称するプラスミドをも、次の周知の断片を組合せて構築した：1. ｐＧＳＣ1700から誘導されたＴ−ＤＮＡ境界配列を有しかつβ−ラクタマーゼ遺伝子（第９Ｂ図の1'）がＳcaＩ部位中へのＤＮＡ配列の挿入により失活されているベクター断片；
2. ＰＳＳＵプロモータと除草剤耐性遺伝子ｓｆｒとＴ−ＤＮＡ遺伝子7 の3'末端とを有する実施例５のキメラ配列（No.3)；
3. ＰＮＯＳプロモータとｎｅｏ遺伝子とオクトピンシンターゼ遺伝子の3'末端とを有する実施例５のキメラ配列（No.4)；および4. 実施例３のｐＴＡ29プロモータカセットを有し、次のものとフレーム内で融合したキメラ配列：(a) パパインチモーゲンの活性蛋白をコードし、実施例３に記載した部位特異的突然変異を用いてcohen 等（1986）のＤＮＡ配列において次の改変を行なったCarica papaya 果実からのパパイン遺伝子：i. 活性蛋白の第１Ｉle残基の上流にてＡsnをコードするＡＡＴコドンがＧＡＴコドンに突然変異して、適するＥcoＲＶクローン化部位（ＧＡＴ ＡＴＣ）を与える。ＥcoＲＶ処理された部位がｐＴＡ29カセットに直接融合して、パパインチモーゲンの活性蛋白をコードする配列とプロモータとの直接的なフレーム内融合を得る；かつii. それぞれ位置47， 118， 135におけるグルタミン酸をコードするＧＡＡコドンが、グルタミンをコードするＣＡＡコドンに突然変異される；さらに(b) 実施例９のノパリンシンターゼ遺伝子の3'末端。
【００８３】ｐＴＶＥＰ2 はｐＴＶＥＰ1 と同様に 2成分型のＴ−ＤＮＡベクターであって、Ｔ−ＤＮＡ境界配列内に次の 3種のキメラ遺伝子を有する：すなわち植物形質転換のための選択可能な優性マーカーをコードするＰＳＳＵ−ｓｆｒおよびＰＮＯＳ−ｎｅｏ；並びにタペータム細胞中で蛋白を開裂してこれらの細胞の死滅をもたらすエンドペプチダーゼをコードするｐＴＡ29−パパイン遺伝子。
【００８４】実施例15：タバコおよびアブラナ中への実施例14のキメラＤＮＡ配列の導入実施例11に記載したように、ｐＴＶＥＰ1 およびｐＴＶＥＰ2 をそれぞれE.coliからｐＭＰ90を有する別のArgobacterium Ｃ58Ｃ1 ＲifR 中に移動させた。ｐＭＰ90とｐＴＶＥＰ1 とを有しかつｐＭＰ90とｐＴＶＥＰ2 とを有する得られた菌株を用いて、タバコおよびアブラナを実施例11および13の手順にしたがって形質転換させた。パパイン遺伝子は形質転換された除草剤耐性およびカナマイシン耐性のカルス、シュートおよび根に発現されないことが、その成長により示された。
【００８５】形質転換された植物を温室内に移し、開花するまで土壌にて成長させた。タバコおよびアブラナの両者の花を検査し、表現型を形質転換植物につき観察したところ、実施例10に記載した形質転換タバコ植物の表現型と実質的に同じであった。これは、ＴＡ29プロモータがｐＴＶＥＰ1 およびｐＴＶＥＰ2 中の異種パパイン遺伝子の発現を植物のタペータム細胞中で選択的に誘起することにより、これら植物を雄性不稔にしうることを示す。
【００８６】実施例16：ｐＴＡ29およびＥcoＲＩをコードする遺伝子のキメラＤＮＡ配列の構築第10Ａ図に示した「ｐＴＶＥ63」と称するプラスミドを、次の周知の断片を組合せて構築した：1. ｐＧＳＣ1701Ａ2 （ヨーロッパ特許出願第 87/115985.1号）から誘導されたＴ−ＤＮＡ境界配列を有するベクター断片；
2. ＰＳＳＵプロモータと除草剤耐性遺伝子ｓｆｒとＴ−ＤＮＡ遺伝子7 の3'末端とを有する実施例５のキメラ配列（No.3)；
3. ＰＮＯＳプロモータとｎｅｏ遺伝子とオクトピンシンターゼ遺伝子の3'末端とを有する実施例５のキメラ配列（No.4)；
4. 実施例３のｐＴＡ29プロモータカセットを有し、次のものとフレーム内で融合したキメラ配列：(a) E.coliからのＥcoＲＩ制限エンドヌクレアーゼをコードし〔Green 等（1981），ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.），第 256巻，第2143〜2153頁；Botterman およびZabeau（1985），ジーン（Gene），第37巻，第 229〜239 頁〕かつ二本鎖ＤＮＡ上の標的配列ＧＡＡＴＴＣを認識して開裂することができ、実施例３に記載したように部位特異的突然変異を用いてGreen 等（1981）のＤＮＡ配列において次の改変を行なった遺伝子：ｉ. ＡＴＧ開始コドンのヌクレオチドをＡＴＧＣＡにより交換して、開始コドンにＮsiＩ部位を形成すると共に次のヌクレオチド配列：ＡＴＧＣＡ，ＴＣＴ，ＡＡＴ…を生ぜしめ；かつii. ｐＥcoＲ12〔Botterman およびZabeau（1985）〕にてクローン化されたＥcoＲＩ遺伝子のＨind ＩＩ−Ｈind ＩＩＩ断片をｐＭＡＣ5-8 部位特異的突然変異ベクターにクローン化させ；さらに(b) 実施例９のノパリンシンターゼ遺伝子の3'末端；並びに5. E.coliまたはAgrobacterium にてＥcoＲＩ遺伝子の活性を阻害することにより、微生物におけるＥcoＲＩの潜在的なリーク発現(potential leakly expression）を解消しうる、天然プロモータ〔Botterman およびZabeau（1985），ジーン（Gene），第37巻，第 229〜239 頁〕の制御下にあるＥcoＲＩメチラーゼをコードする遺伝子。
【００８７】ｐＴＶＥ63は 2成分型のＴ−ＤＮＡベクターであって、Ｔ−ＤＮＡ境界配列内に次の 3種のキメラ配列を有する：ＰＳＳＵ−ｓｆｒおよびＰＮＯＳ−ｎｅｏ〔これらは第２プロモータとしてのそれぞれＰＳＳＵおよびＰＮＯＳの制御下にあるマーカーＤＮＡである〕；並びにｐＴＡ29−ＥcoＲＩ遺伝子〔これは第１プロモータとしてのｐＴＡ29の制御下にある雄性不稔ＤＮＡである〕。タペータム細胞中でのＴＡ29プロモータの制御下における雄性不稔ＤＮＡの発現はＥcoＲＩ制限エンドヌクレアーゼを産生し、これはタペータム細胞のＧＡＡＴＴＣ部位にて二本鎖ＤＮＡを切断し〔タイプＩＩ型制限改変系に関する文献：Wilson（1988），ＴＩＧ，第 4(11)巻，第 314〜318 頁参照〕、これら細胞の死滅をもたらす。
【００８８】第10Ｂ図に示したｐＴＶＥ62と称するプラスミドをも、次の周知の断片を組合せて構築した：1. ｐＧＳＣ1701Ａ2 から誘導されたＴ−ＤＮＡ境界配列を有するベクター断片； 2. ＳＳＵプロモータと除草剤耐性遺伝子ｓｆｒとＴ−ＤＮＡ遺伝子7 の3'末端とを有する実施例５のキメラ配列（No.3)；
3. ＰＮＯＳプロモータとｎｅｏ遺伝子とオクトピンシンターゼ遺伝子のｎｅｏ3'末端とを有する実施例５のキメラ配列（No.4)；
4. 実施例３のｐＴＡ29プロモータカセットを有し、ｐＳＯＤＩ〔Bowler等（1989），ＥＭＢＯ Ｊ．，第 8巻，第31〜38頁〕からのＨpaＩ−Ｈind ＩＩＩ断片のＮcoＩ−ＰstＩ断片であるＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（「Ｍｎ−ＳＯＤ」）の運搬体ペプチドをコードする遺伝子断片とフレーム内融合し、実施例３に記載した部位特異的突然変異を用いてBowler等のＤＮＡ配列において次の改変を行なったキメラ配列：i. ＡＴＧ開始コドンの位置−2 および−1 にて上流に位置するＡＡヌクレオチドがＣＣヌクレオチドに変化して、開始コドンにＮcoＩ部位を形成しかつ次のヌクレオチド配列：
を生成し；
ii. 運搬体ペプチドのプロセシング部位の直ぐ下流に位置するＴ，ＴＣＧ，ＣＴＣ，ヌクレオチドがＣ，ＴＧＣ，ＡＧＣ，に変化して、プロセシング部位の背後にＰstＩ部位を形成しかつ次のヌクレオチド配列： L Q T F S L CTC ，CGC ，GGC ， TTG ，CAG ，ACC ，TTT ，TCG ，CTC ， CTC ，CGC ，GGC ， TTG ，CAG ，ACC ，TTC ，TGC ，AGC … Pst Ｉ〔ここで、矢印は運搬体ペプチド配列のプロセシング部位を示しかつ上側ラインはＭｎ−ＳＯＤコード配列に対応するアミノ酸配列を示す〕を生成し：ＮcoＩ−ＰstＩ断片はさらにE.coliからのＥcoＲＩ制限エンドヌクレアーゼ〔Greene等（1981），ジャーナル・バイオロジカル，ケミストリー（J. Biol. Chem.），第256巻，第2143〜2153頁；Botterman およびZabeau（1985），ジーン（Gene），第37巻，第 229〜239 頁〕をコードしかつｐＴＶＥ63に存在する二本鎖ＤＮＡにおける標的配列ＧＡＡＴＴＣを認識して切断しうる遺伝子とフレーム内で融合する；および(b) 実施例９のノパリンシンターゼ遺伝子の3'末端；並びに 5. E.coliもしくはArgobacterium にてＥcoＲＩの活性を阻止して、微生物におけるＥcoＲＩ遺伝子の潜在的なリーク発現を解消する天然プロモータ〔Botterman およびZabeau(1985)〕の制御下におけるＥcoＲＩメチラーゼをコードする遺伝子（この遺伝子は境界配列の外側でベクター断片中に挿入される）。ｐＴＶＥ62は 2成分型のＴ−ＤＮＡベクターであって、境界配列内に次の 3種のキメラ配列を有する：すなわちＰＳＳＵ−ｓｆｒおよびＰＮＯＳ−ＮＰＴＩＩ〔これらは第２プロモータとしてのそれぞれＰＳＳＵおよびＰＮＯＳの制御下にあるマーカーＤＮＡである〕；並びにｐＴＡ29−運搬体ペプチドＥcoＲＩエンドヌクレアーゼ遺伝子〔これは第１プロモータとしてｐＴＡ29を有しかつそれらの間に運搬体ペプチドコード配列を有する雄性不稔ＤＮＡである〕。タペータム細胞でのＴＡ29プロモータの制御下における雄性不稔ＤＮＡの発現はタペータム細胞のミトコンドリアを標的としかつこれら細胞におけるＧＡＡＴＴＣ部位にて二本鎖ＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼを産生する。これは、これら細胞の死滅をもたらす。
【００８９】実施例17：タバコおよびアブラナ中への実施例16のキメラＤＮＡ配列の導入実施例11および15に記載したように、ｐＴＶＥ62およびｐＴＶＥ63をE.coliからｐＭＰ90を有するAgrobacterium Ｃ58Ｃ1 ＲifR に移動させた。ｐＴＶＥ62をｐＭＰ90と共に、およびｐＴＶＥ63をｐＭＰ90と共に有する得られた菌株を用いてタバコを形質転換させ、さらにこれらを用いて実施例11および13に記載した手順にしたがいアブラナを形質転換させた。ＥcoＲＩエンドヌクレアーゼ遺伝子は形質転換された除草剤耐性およびカナマイシン耐性のカルス、シュートおよび根に発現されなかったことが、その成長により示される。
【００９０】形質転換した植物を室温中に移し、開花するまで土壌にて成長させた。タバコと油菜との両者の花を検査し、形質転換植物につき表現型を観察したところ、実施例10に記載した形質転換タバコ植物と実質的に同じであった。これは、ＴＡ29プロモータが異型ＥcoＲＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現をｐＴＶＥ62およびｐＴＶＥ63で形質転換された植物のタペータム細胞中で選択的に誘起して、これら植物を雄性不稔にしうることを示している。
【００９１】説明する必要はないが、本発明は特定植物の形質転換のみに限定されない。本発明は、雄性不稔ＤＮＡの発現を植物の雄蕊細胞中で選択的に誘起することにより植物を自家受粉および他家受粉しうる第１プロモータの制御下にて、雄性不稔ＤＮＡで形質転換しうる核ゲノムを持った任意の植物に関するものである。たとえば本発明は、馬鈴薯、トマト、油菜、アルファルファ、ヒマワリ、綿、セロリ、玉ネギ、トウモロコシ、大豆、タバコ、アブラナ属野菜および甜菜のような植物に関するものである。
【００９２】さらに本発明は上記実施例に記載した特定のプラスミドおよびベクターに限定されず、寧ろ第１プロモータの制御下にある雄性不稔ＤＮＡを持ったあらゆるプラスミドおよびベクターを包含する。
【００９３】さらに本発明は上記実施例に記載されたたとえばＴＡ29プロモータのような特定プロモータに限定されず、寧ろ雄性不稔ＤＮＡの発現を雄蕊細胞中で選択的に誘起しうるプロモータをコードするあらゆるＤＮＡ配列を包含する。この点に関し、本発明は第３Ａ図のＴＡ29プロモータのＤＮＡ配列、並びにその等価なＤＮＡ配列、たとえば第３Ｂ図のＴＡ13プロモータの配列および第３Ｃ図のＴＡ26のプロモータの配列を包含し、これらを用いて雄性不稔ＤＮＡの発現を植物のタペータム細胞中で選択的に制御することができる。事実、ＴＡ29，ＴＡ26およびＴＡ13プロモータのＤＮＡ配列は、 (1)或る種のコドンを同じアミノ酸または他のアミノ酸をコードする他のコドンで置換することにより、かつ／または (2)或る種のコドンを除去し或いは付加することにより改変することができ、ただしこの種の改変は雄性不稔のタペータム特異性発現を制御するためのコード化されたプロモータの性質を実質的に変化させないものとする。
【００９４】さらに本発明は上記実施例に記載した特定の雄性不稔ＤＮＡに限定されず、寧ろ第１プロモータの制御下で産生されて雄蕊細胞の代謝、機能および／または発育を顕著に阻害する第１ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドをコードするあらゆるＤＮＡ配列を包含する。
【００９５】さらに本発明は上記実施例に記載された特定のマーカーＤＮＡに限定されず、寧ろこの種のＤＮＡ配列が発現される少なくとも特定植物組織もしくは特定植物細胞に、この種のＤＮＡ配列が発現されない特定植物組織もしくは特定植物細胞と対比して異なる形質を付与する第２ＲＮＡ、蛋白もしくはポリペプチドをコードするあらゆるＤＮＡ配列を包含する。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５９９１０１９５５
【氏名又は名称】プラント・ジエネテイツク・システムズ・エヌ・ヴエー
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| 【出願日】 |
平成１年４月２７日（１９８９．４．２７） |
| 【代理人】 |
【識別番号】１０００６２００７
【弁理士】
【氏名又は名称】川口 義雄
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| 【公開番号】 |
特開２０００−３７１４６（Ｐ２０００−３７１４６Ａ） |
| 【公開日】 |
平成１２年２月８日（２０００．２．８） |
| 【出願番号】 |
特願平１１−２０６９１２ |
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