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【発明の名称】 人工種子
【発明者】 【氏名】和気 仁志

【氏名】菱沼 清

【氏名】梅津 博紀

【氏名】松永 是
【要約】 【課題】

【解決手段】
【特許請求の範囲】
【請求項１】 植物体組織を人工胚乳及び人工膜によって包埋してなる人工種子において、前記人工胚乳に真核細胞の微細藻類の培養濾液及び／又は抽出物を含ませてなることを特徴とする人工種子。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は人工種子に関する。
【０００２】
【従来の技術】一般に、植物組織培養においては、植物の組織や器官あるいは培養細胞を、生長に必要な無機塩類、ビタミン、糖などのほかに植物ホルモン（オ−キシン類、サイトカイニン類、ジベレリン類、エチレン等）を加えた培地を用いて培養し、カルスをつくらせたり、そのカルスを植え継いで培養を続け有用物質を得たり、またはそのカルスから植物体を再生（復元）させたりしている。
【０００３】植物組織培養技術を用いて植物体を再生させる方法としては、出発材料により脱分化系と分化系の２種に大きく分けられる。脱分化系はカルスや液体培養細胞などの脱分化した状態を経由して植物体を再生させる方法で、具体的にはクラスタ−カルスから多くのシュ−トを発生させ、発生した各々のシュ−トから発根させ幼植物体を再生させる方法や細胞に直接不定胚（体細胞胚）を形成させ幼植物体にまで再生させる方法がある。不定胚を経由して植物体を再生させる場合においては、不定胚の生長は、その段階によって球状胚、心臓型胚、魚雷型胚、成熟胚の順に生長していくことが知られている。一方、分化系では成長点を含む茎頂、休眠芽、側芽、胚、種子などが出発材料になり、さらに成長点を含まない胚軸、子葉、茎なども用いられる。この系では上述した植物組織にマルチプルシュ−トを形成させ、ついでこれらを切除した単一シュ−トから連続的にマルチプルシュ−トを発生させる連続シュ−ト生産システムを確立し、最終的に切除したシュ−トから発根させ幼植物を再生させる方法がある。
【０００４】脱分化系からの植物体再生においては、培養細胞を長期間継代培養していると、一般に分化能が低下することが多く、培養細胞からの不定胚の形成率やカルスからのシュ−ト、根の形成率は低くなる。また、人為的に不定胚を誘導する場合、培地の無機塩類組成もさることながら、植物ホルモンであるオ−キシンやサイトカイニンの種類、濃度、組合せについて検討することが一般的な手順になっている。しかし、オ−キシンやサイトカイニンの処理だけでは不定胚形成やカルスからのシュ−トや根の形成を誘導できない植物種も多い。特に不定胚は、魚雷型胚まで生長すると理由は定かではないが、生長を停止して植物体にまで再分化する率が極めて低下するという現象が起こる。一方、分化系での植物体再生では、種々の植物や種々の組織を用いて脱分化系と同様にオ−キシンやサイトカイニンなどの植物ホルモンの種類、濃度、組合せや、培地の無機塩類、微量有機成分組成などについて検討されているが、未だに植物や組織によってはシュ−ト・根の形成をしないものもある。また、脱分化系、分化系のいずれにおいても、植物ホルモンを用いて植物組織培養する場合には、植物ホルモンの種類やその添加量によっては、増殖や分化を阻害する等の問題があった。従って、各種の植物組織や器官あるいは培養細胞からの不定胚形成率を高め、さらには不定胚の生長や植物体への再生を効果的に促進させる方法が望まれるところである。
【０００５】さらにまた、植物組織培養を利用したクロ−ン植物大量培養法の一つとして、人工種子の開発が着目され、野菜やイネなど多くの植物種で実用化に向けて試みがなされている。人工種子は、不定芽や不定胚などの植物体再生組織を、人工的な胚乳と人工膜によって包埋したものである。人工的な胚乳は、植物体再生組織の栄養を与えたり発芽を制御する物質を含む部分である。人工膜としてはアルギン酸カルシウムが最適とされているが、その他の高分子ゲル化剤についても種々検討がされている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】かような人工種子の発芽率を高めるために、人工的な胚乳に植物ホルモンの一種であるアブシジン酸を添加するという報告もある。しかしながら人工種子を播種したのち、アブシジン酸が水に溶解拡散するまでに時間を要するため、必ずしも発芽率が高まるとは限らない。また、高濃度の糖などを人工的胚乳部分に添加する方法も提案されているが、雑菌の繁殖を促し、生育に支障をきたす場合がある。従って、人工種子中に不定胚などの植物体再生組織の生長を促進し、その発芽率を高めることができれば人工種子の実用化が一層進展することになろう。そこで本発明は、高い発芽率を有する改良された人工種子を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するためには、人工胚乳に真核細胞の微細藻類の培養濾液及び／又は抽出物を含ませた人工種子とする。即ち、本発明は、植物体組織を人工胚乳及び人工膜によって包埋してなる人工種子において、前記人工胚乳に真核細胞の微細藻類の培養濾液及び／又は抽出物を含ませてなることを特徴とする人工種子を要旨とする。
【０００８】本発明で利用できる真核細胞の微細藻類としては、紅藻類、緑藻類、黄緑藻類、珪藻類、黄色鞭毛藻類、渦鞭毛藻類などがある。
【０００９】緑藻類としては、ブラキオモナス（Brachiomonas）属、クラミドモナス（Chlamydomonas）属、クロレラ（Chlorella)属、ロボモナス(Lobomonas)属、ネフェロクラミス(Nephrochlamys)属、ネフェロデエラ(Nephrodiella)属、プロトシフォン(Protosiphon)属、プロトテカ(Prototheca)属、セネデスムス(Scenedesmus)属、セレナストゥルム(Selenastrum)属などがあり、具体例としては、ブラキオモナス・スブマリナ（Brachiomonas submarina)ＡＴＣＣ ３０５９７、クラミドモナス・ドルソベントラリス（Chlamydomonas dorsoventralis)ＡＴＣＣ ３０５９４、クラミドモナス・オゥガメトス(Chlamydomonas eugametos)ＡＴＣＣ ３０４０１、クラミドモナス・モノイカ（Chlamydomonas monoica)ＡＴＣＣ３０６２９、クラミドモナス・プソウダグロエ(Chlamydomonas pseudagloe)ＡＴＣＣ １２２３５、クロレラ・エリップソイデア（Chlorella ellipsoidea)ＡＴＣＣ １１４６６、クロレラ・ルテオヴィリディス（Chlorella luteoviridis)ＡＴＣＣ ３０４０６、クロレラ・ミニアタ（Chlorella miniata)ＡＴＣＣ ３０５４６、クロレラ・サッカロフィラ（Chlorella saccharophila var.saccharophila)ＡＴＣＣ ３０４０８、クロレラ属(Chlorella sp.)ＡＴＣＣ １１４６９、クロレラ・バリエガタ（Chlorella variegata)ＡＴＣＣ ３０４０９、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris)ＡＴＣＣ １１４６８、クロレラ・キサンセラ（Chlorella xanthella)ＡＴＣＣ ３０４１１、ロボモナス・ピリフォ−ミス(Lobomonaspiriformis)ＡＴＣＣ ３０４０３、ネフェロクラミス・スブソリタリア（Nephrochlamys subsolitaria)ＡＴＣＣ ３０４３３、ネフェロデエラ・ブレビス（Nephrodiella brevis)ＡＴＣＣ ３０４４０、プロトシフォン・ボテリオイデス(Protosiphonbotryoides)ＡＴＣＣ ３０４３６、プロトテカ・スタッグノラ(Prototheca stagnora)ＡＴＣＣ １６５２８、セネデスムス・ビジュガトゥス(Scenedesmus bijugatus)ＡＴＣＣ １１４６２、セネデスムス・クゥアドリカウド(Scenedesmus quadricauda)ＡＴＣＣ ３０４２８などが挙げられる。
【００１０】黄緑藻類としては、ボティリデウム（Botrydium)属、ミショコッカス(Mischococcus)属、モノダス(Monodus)属、オフィオシティウム(Ophiocytium)属などがあり、具体例としては、ボティリデウム・ベケリアニウム(Botrydium becherianum)ＡＴＣＣ ３０６０２、ボティリデウム・シストスム(Botrydium cystosum)ＡＴＣＣ ３０５８９、ミショコッカス・スファエロセファラス(Mischococcus sphaerocephalus)ＡＴＣＣ ３０５９２、モノダス・セブテラネウス(Monodus subterraneus)ＡＴＣＣ ３０５９３、オフィオシティウム・マジュス(Ophiocytium majus)ＡＴＣＣ ３０６０１などが挙げられる。
【００１１】黄色鞭毛藻類としては、オクロモナス(Ochromonas）属などがあり、具体例としては、オクロモナス・ダニカ(Ochromonas danica)ＡＴＣＣ ３０００４、オクロモナス・マルハメンシス(Ochromonas malhamensis)ＡＴＣＣ１１５３２などが挙げられる。
【００１２】上記した微細藻類あるいはその変種や変異株に限ることなく、天然から分離した海洋性、淡水性の微細藻類も本発明において利用できる。更に、これらの菌体は１種または２種以上併用してもかまわない。
【００１３】微細藻類の培養は、通常、無機塩類等を含む培地を用い、タンク培養あるいは太陽光を利用した屋外開放培養で行い得るが、本発明においては、目的とする微細藻類が天然にある程度豊富に存在するならば、その菌体の生育存在する海水あるいは淡水を培養液とすることができる。
【００１４】微細藻類培養濾液は上述した培養法で得られる培養液を遠心分離あるいは濾過などを行って取得されるが、目的とする培養濾液の生物活性が弱い場合は、前記培養濾液を減圧濃縮などにより濃縮して用いてもかまわない。この際、濃縮倍率が大きくなり塩濃度が高くなると植物組織に悪影響を与えることがあるので、電気透析などで植物組織に悪影響がなくなるまで脱塩して使用するのが望ましい。
【００１５】また、微細藻類抽出物は、前記のようにして得られた菌体または適度に破砕した菌体を常温または加熱した適当な溶媒と接触させて行い得たものであり、溶媒としては、菌体によって種々の溶媒を単独または複数併用してもかまわないが、一般的には水性溶媒が好ましい。水性溶媒としては、水単独あるいは酸、塩基、塩類、または有機溶媒を溶解した水溶液などが使用できる。また、メタノ−ル、エタノ−ル、酢酸エチルエステル、エ−テル等の有機溶媒で抽出後、有機溶媒を除去し水に溶解させてもよい。
【００１６】上述した微細藻類の培養濾液あるいは抽出物からの高分子画分は、培養濾液あるいは抽出液から一般的な分子量に基づく分画法、例えば透析、ゲル濾過、限外濾過等で得ることができる。高分子画分は、分子量的にはおよそ８，０００以上の画分である。このようにして得られた高分子画分は適宜濃縮あるいは希釈して使用できる。更に、これらの分画液を減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等により乾燥し粉末としたものも使用できる。
【００１７】また、上述した方法により得られた微細藻類の培養濾液あるいは抽出物からの塩基性画分は、有機溶媒抽出による塩基性物質を得る方法として「物質の単離と精製」（１９７６年発行、大竹、鈴木、高橋、室伏、米原、東京大学出版会）ｐ２５〜ｐ３１に記載があるような一般的理論と分画方法に基づいて得ることができる。一般的な分画操作では、試料水溶液に塩酸などの酸を加えてｐＨ３に調整後、適当な有機溶媒を加え酸性物質を抽出する。次に、水層のｐＨを水酸化ナトリウムなどのアルカリを加えてｐＨ１２に調整し適当な有機溶媒を加えて塩基性物質を抽出する。しかしながら目的に応じて適宜ｐＨなどの諸条件を変えて抽出を行っても差し支えない。分画に用いる有機溶媒としては、エチルエ−テル、クロロホルム、酢酸エチル、ブタノ−ルなどを用いることが多いが、適当な溶媒を適宜選択して用いることができる。また、上述した方法で得られた塩基性画分から有機溶媒を除去後、水に溶解させて用いてもよい。
【００１８】微細藻類の培養濾液及び／又は抽出物からの高分子画分や塩基性画分の基本培地への添加量は、用いる菌、培養条件、抽出液量等の条件で変動し、更に各種分画操作後の有効成分の回収率、液量の増減等不確実な要因が多く、一概に規定することは困難であるが、有効な添加量は実験により容易に決めることができる。例えば、クロレラ・ブルガリス ＡＴＣＣ １１４６８、セネデスムス・ビジュガトゥス ＡＴＣＣ １１４６２を用いる場合には、培養濾液については１００倍に濃縮したもの、抽出液については３ｇ乾燥菌体を１００ml抽出用液で抽出したものから上記記載の方法で高分子画分あるいは塩基性画分の凍結乾燥物を調製し、それぞれ植物組織培養用の基本培地に対して１〜１０００ppmの濃度範囲で添加するなどできるが、添加濃度が高すぎると効果が低下することがある。
【００１９】植物組織培養に使用する基本培地や培養方法などは通常の植物組織培養におけるものと同様である。即ち基本培地としては、ムラシゲ＆スク−グ（Murashige＆ Skoog）培地（１９６２）（以下「ＭＳ培地」と略記する）を代表的なものとして挙げられるが、その他の植物組織培養に適した種々の培地、あるいはそれらの改変培地を適宜選択して使用することもできる。更に、微細藻類の培養濾液あるいは抽出液の高分子画分や塩基性画分の他に、通常の培養に使用される植物ホルモン、ココナッツミルク、カゼイン分解物や酵母抽出物等を目的に応じて併せて添加してもよい。
【００２０】本発明において、人工胚乳にこのような微細藻類の培養濾液及び／又は抽出物、望ましくはその高分子画分や塩基性画分を含ませておくことにより、高い発芽率の人工種子となる。
【００２１】
【実施例】以下実施例によって本発明をさらに詳しく説明する。尚、以下の実施例において使用するニンジンの培養細胞と不定胚の培養、及び微細藻類の培養濾液と抽出物からの高分子画分、塩基性画分の調製は下記のように行った。
【００２２】(Ｉ)ニンジン培養細胞の作製及び不定胚の培養ニンジンの無菌種子の芽生えにおいて胚軸が10cm位に生長したものを約１cm位に切断し、下記培地中で２５℃、暗条件下で培養した。培地は基本培地としてＭＳ培地を使用し、これにショ糖３％、オ−キシン類の植物ホルモンである２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）１mg／ｌを添加しｐＨ５．５〜ｐＨ５．７に調整した。約１ヶ月の培養後、培地中の２，４−Ｄ濃度を０．１１mg／ｌに減少させた培地に移植し、振盪速度９０回／分のレシプロ式シェ−カ−を用いて振盪培養した。その後、１週間に１回の割合で、２，４−Ｄを０．１１mg／ｌ含む培地に植え継いでニンジン培養細胞を得た。また、ニンジン培養細胞は、形態的分化を行って不定胚を形成することが知られている。そこで、液体培養にて継代培養した上記培養細胞を２，４−Ｄを含まない基本培地に移植して培養することにより、不定胚を形成させた。
【００２３】(ＩＩ)微細藻類培養濾液と抽出物からの高分子画分と塩基性画分の調製微細藻類として、オクロモナス・ダニカ(Ochromonas danica)ＡＴＣＣ ３０００４、クラミドモナス・ドルソベントラリス（Chlamydomonas dorsoventralis)ＡＴＣＣ ３０５９４、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)ＡＴＣＣ １１４６８、セネデスムス・ビジュガトゥス（Scenedesmus bijugatus)ＡＴＣＣ１１４６２、ボティリデウム・ベケリアニウム(Botrydium becherianum)ＡＴＣＣ ３０６０２を用いて調製した。
【００２４】前記微細藻類を各々ＡＴＣＣ指定の培養条件にて培養後、培養液を遠心濾過し濾液を得、エバポレイターで１００倍に濃縮した。この濃縮液をモザイク荷電膜脱塩器（デザルトンＤＳ−１０３：東ソー株式会社）で脱塩し、０．４５μｍのメンブランフィルターを用いて濾過し、得られた濾液を微細藻類培養濾液とした。各々の微細藻類抽出物は菌体を集菌後凍結乾燥し、水に対して３％になるように菌体を懸濁させ、１００℃で６０分間熱水抽出し、遠心分離して上澄液を０．４５μｍメンブランフィルターを用いて濾過して得た。
【００２５】上述のようにして得られた微細藻類培養濾液及び抽出物５０mlをビスカゼ（VISKASE)社の透析用セルロースチューブ（商品名：セルロースチューブ30／32）を用いて蒸留水１ｌに対して透析した。得られた透析内液を凍結乾燥を行い、高分子画分としてそれぞれ以下の実験に供した。
【００２６】また、微細藻類培養濾液あるいは微細藻類抽出物からの塩基性画分は以下のように調整した。上述した微細藻類培養濾液及び微細藻類抽出物それぞれに１Ｎの塩酸を加えてｐＨ３に調整後、クロロホルムを加え酸性物質を抽出した。次に、それぞれの水層のｐＨを１Ｎの水酸化ナトリウムを加えてｐＨ１２に調整し、クロロホルムを加えて塩基性物質を抽出した。得られた塩基性物質は、クロロホルムを減圧蒸留して除去しｐＨ４の蒸留水に溶解し、その後、凍結乾燥を行い、供試物質とした。
【００２７】実施例１ニンジン不定胚を用いた人工種子の発芽促進ニンジン不定胚は(Ｉ)で得た不定胚から２００μｍ及び４２５μｍのナイロンメッシュを用いて２００〜４２５μｍの大きさに生長した不定胚のみを選別使用した。選別された不定胚のほとんどは、球状から初期の心臓型不定胚であった。このようにして得られた不定胚をＭＳ培地２５ｍｌ中に懸濁し、包埋剤として３％(W/V)アルギン酸ナトリウムを含む７５ｍｌのＭＳ培地と上記の懸濁液とを混ぜ合わせ、混液１００ｍｌを得た。このとき、上記混液１００ｍｌに対して微細藻類培養液及び抽出物を１％濃度で、更に高分子画分と塩基性画分をそれぞれ１５０ｐｐｍの濃度で添加した。得られた最終混液を、５０ｍＭの塩化カルシウム溶液中に滴下することによって、アルギン酸カルシウムからなる人工膜を有する球状の人工種子を得た。
【００２８】ついで、この人工種子を、無菌的に２５℃、明条件（２０００ルックス、１６時間照明）で２５日間培養し、発根、発芽状態を調べた。結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】

【００３０】
【発明の効果】人工胚乳に真核細胞の微細藻類の培養濾液及び／又は抽出物を含ませてなる発明の人工種子は発芽率の高いものたり得る。
【出願人】 【識別番号】０００００５５１１
【氏名又は名称】ぺんてる株式会社
【識別番号】５９１０３３７４４
【氏名又は名称】松永 是
【出願日】 平成１年１１月２９日（１９８９．１１．２９）
【代理人】
【公開番号】 特開２０００−６０２２４（Ｐ２０００−６０２２４Ａ）
【公開日】 平成１２年２月２９日（２０００．２．２９）
【出願番号】 特願平１１−２５１８５２