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【発明の名称】 |
細胞試験法、それに用いる樹脂製プレートおよび細胞試験装置 |
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【氏名】赤池 敏宏
【氏名】村田 充弘
【氏名】森川 明彦 |
【課題】
【解決手段】 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】特定細胞のレセプターが認識するリガンドを有する基質材を底面に固定化した微細な複数のウエルを有する樹脂製プレートの各ウエルに、同一の接着依存性細胞を培養し、同一あるいは異なる濃度または種類の被検物質を複数個のウェルに同時に添加し、その後に細胞の変化を検出する細胞試験法。
【請求項２】特定細胞のレセプターが認識するリガンドを有する基質材を底面に固定化した微細な複数のウエルを有する樹脂製プレートの各ウエルに、異なる接着依存性細胞を培養し、同一あるいは異なる濃度または種類の被検物質を複数個のウェルに同時に添加し、その後に細胞の変化を検出する細胞試験法。
【請求項３】特定細胞のレセプターが認識するリガンドを有する基質材を底面に固定化した微細な複数のウエルを有する樹脂製プレートの各ウエルに、同一の接着依存性細胞を培養し、同一あるいは異なる濃度または種類の被検物質を複数個のウェルに同時に添加し、その後に細胞の変化を検出する細胞試験法に用いる樹脂製プレート。
【請求項４】特定細胞のレセプターが認識するリガンドを有する基質材を底面に固定化した微細な複数のウエルを有する樹脂製プレートの各ウエルに、異なる接着依存性細胞を培養し、同一あるいは異なる濃度または種類の被検物質を複数個のウェルに同時に添加し、その後に細胞の変化を検出する細胞試験法樹脂製プレート。
【請求項５】請求項３または４に記載の樹脂製プレートを保持し移動する機能、該プレートのウェルへ接着依存背細胞を投入する機能、培地および被検物質を注入するに機能、該プレートへ投入された細胞を培養する機能、および被検物質を注入した後に培養された細胞の変化を光学的および／または電気的に検出する機能を有する細胞試験装置。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は細胞の試験方法、その試験方法に使用されるプレートおよび試験装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】医薬品、医用材料、化粧品、農薬、食品添加物、ゴム、プラスチックなどの化学工業製品の開発において、使用される化学物質が人体に与える影響を見極めるための安全性試験は最も重要なものの一つである。これら安全性試験の多くは、マウスを中心とした動物実験によって行われており、日本国内で実験に用いられるマウスの数は５００万匹を越えると言われている。動物実験には、動物による個体差のため、実験結果の定量化が困難であること、実験結果を得るのに時間がかかること、動物やその飼育場所の確保、維持に莫大な費用が必要であること、などの問題がある。さらに多くの動物の生命を犠牲にすることから、動物愛護の点でも問題が多い。以上の観点から、動物実験の一部あるいはすべてを他の方法で代替する検討がなされているが、データの再現性および均一性に問題があり、試験自体も長期間を必要とする。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、以上のような従来法の問題点を解決するために、ごく少量の動物、ヒト、昆虫などから得られた各組織の正常細胞あるいは株化細胞を用いて、再現性が高く定量的な試験結果を短時間で得ることが可能な、簡便な細胞毒性試験法、それに用いる樹脂製プレートおよび細胞毒性試験装置を提供することである。
【０００４】
【発明を解決するための手段】前記目的を達成するために、本発明は、（１） 特定細胞のレセプターが認識するリガンドを有する基質材を底面に固定化した微細な複数のウエルを有する樹脂製プレートの各ウエルに、同一の接着依存性細胞を培養し、同一あるいは異なる濃度または種類の被検物質を複数個のウェルに同時に添加し、その後に細胞の変化を検出する細胞試験法、（２）特定細胞のレセプターが認識するリガンドを有する基質材を底面に固定化した微細な複数のウエルを有する樹脂製プレートの各ウエルに、異なる接着依存性細胞を培養し、同一あるいは異なる濃度または種類の被検物質を複数個のウェルに同時に添加し、その後に細胞の変化を検出する細胞試験法、（３）特定細胞のレセプターが認識するリガンドを有する基質材を底面に固定化した微細な複数のウエルを有する樹脂製プレートの各ウエルに、同一の接着依存性細胞を培養し、同一あるいは異なる濃度または種類の被検物質を複数個のウェルに同時に添加し、その後に細胞の変化を検出する細胞試験法に用いる樹脂製プレート、（４） 特定細胞のレセプターが認識するリガンドを有する基質材を底面に固定化した微細な複数のウエルを有する樹脂製プレートの各ウエルに、異なる接着依存性細胞を培養し、同一あるいは異なる濃度または種類の被検物質を複数個のウェルに同時に添加し、その後に細胞の変化を検出する細胞試験法樹脂製プレート、（５）請求項３または４に記載の樹脂製プレートを保持し移動する機能、該プレートのウェルへ接着依存背細胞を投入する機能、培地および被検物質を注入するに機能、該プレートへ投入された細胞を培養する機能、および被検物質を注入した後に培養された細胞の変化を光学的および／または電気的に検出する機能を有する細胞試験装置を提供するものである。
【０００５】本発明において、使用される細胞は、用いられるプレートのウェル底面に有する基質材上で増殖しうる、ヒト、動物、昆虫あるいは植物の各組織由来の正常細胞あるいは株化細胞である。このような細胞の内、動物保護の観点からは株化細胞の利用が好ましいが、本発明においては一実験点に使用する細胞数が少量ですむため動物の正常細胞を用いる場合であっても、動物の屠殺数を少なくすることができる。株化細胞の例としては、肝細胞、腎臓細胞、神経細胞、乳腺細胞、腸管細胞、血管細胞、筋原細胞、骨芽細胞、神経細胞、内皮細胞、造血幹細胞、免疫細胞その他適宜の細胞をあげることができその種類は特に限定されるものではない。 例えば、代表的なものとしてＬＬＣ−ＰＫ１、ＪＴＣ−１２、ＭＤＣＫなどの腎細胞、Ｈｅｐ Ｇ２、Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ、などの肝細胞、Ｌ−６、Ｇ−８、Ｈ９ｃ２、Ａ７ｒ５などの筋原細胞、ＨＯＳ、ＭＣＴ３−Ｅ１、Ｕ−２ＯＳなどの骨芽細胞、ＩＭＲ−３２、ＮＢ１４Ａ３、ＰＣ−１２などの神経細胞、ＣＰＡ、ＣＰＡＥなどの内皮細胞、ヒト脾臓Ｔ細胞、ヒト脾臓Ｂ細胞、ＥＬ−４などの免疫細胞、ＨＬ−６０などの造血幹細胞、その他Ｌ−９２９、ＷＩ−３８、ＨｅＬａ、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３などの二倍体細胞、ＣＨＬ、ＣＨＯ−Ｋ１、Ｖ７９などの細胞が挙げられる。
【０００６】正常細胞の例としては、ヒト、ウシ、ラット等の肝臓、腎臓、筋肉、上皮、内皮、脾臓等の細胞が挙げられる。本発明において使用される樹脂製プレートは、複数のウェルを同一面上に有するものであり、プレートを形成する樹脂としては、細胞の増殖性を阻害することのない透明あるいは不透明樹脂が利用可能である。しかし、プレートのウェル中の細胞に対する被検物質の影響を光学的に検出する場合には透明樹脂の使用が好ましい。この透明樹脂としては、限定的ではないが、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ＰＭＭＡ、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ノルボルネン系樹脂等があげられる。
【０００７】ノルボルネン系樹脂としては、下記一般式（１）で表される化合物の開環重合体またはエチレンなどとの付加重合体を挙げることができる。
一般式（１）
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は同一でも異なってもよく、水素原子、アルキル基、アルコキシカルボニル基を示し、ｍおよびｎは０または１の数を示す）
また、プレートのウェル中の細胞に対する被検物質の影響を電気的に検出する場合には、透明樹脂あるいは不透明樹脂のいずれもが使用可能である。この場合の不透明樹脂としては、高密度ポリエチレン、ポリプロピレン等があげられる。細胞に対する被検物質の影響を電気的に検出するためにはプレート上の各ウエル内表面に微小電極を組み込むことが必要であり、この微小電極はプレートの表面または内面に設置されているリード線を介してプレート外部に接続される。このためにプレートの例えば側面または底面には外部と接続されるための電気接点が設けられる。プレートの１ウエルの開口部面積は、好ましくは０．００２〜０．４ｃｍ2の範囲であり、より好ましくは、０．００７〜０．４ｃｍ2の範囲である。０．００２ｃｍ2より小さくなると培地、試薬、被検物質等の注入・排出作業が困難となる。また、０．４ｃｍ2より大きくなると複数のウェルを有するプレートの面積が広くならざるを得ず、後記細胞毒性試験装置の容積をコンパクトにすることができなくなる。また、１ウェルの内容積は、好ましくは０．２―５００ｍｍ３、特に好ましくは０．７―５００ｍｍ３であり、これによって１実験点に使用する細胞や培地などの使用量を最小限にすることができる。また、ウエル開口部の形状は任意であるが円形、長方形または正方形が好ましい。ウエル底部の形状はＵ字型、Ｖ字型、平面型等任意の形状が可能であるが、細胞の培養、観察、光学的検出のためには平面型が好ましく、ウェルの底部には好ましくは０．００２―０．４ ｃｍ２の平面が設置される。
【０００８】なお、プレート１枚が有するウェルの数は、通常、９６―２０００個であるが、当該ウェルは格子状に並べられる。本発明において前記プレートが有するウェルの底面に固定化される、特定細胞のレセプターが認識するリガンドを有する基質材とは、細胞間結合、細胞の動態制御あるいは細胞外基質成分に関連する生体由来あるいは人工接着分子である。レセプターとは細胞膜表面に存在する、タンパク質、糖鎖、などに対する特異的な相互作用サイトであり、リガンドとはそのレセプターと相互作用（接着）する特定のペプチド配列、糖鎖などを言う。リガンドの例としては、肝実質細胞膜表面のＡＳＧＰレセプターと接着するβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基や、上皮細胞、繊維芽細胞、血小板表面のレセプターと接着するＲＧＤペプチド配列（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）などが挙げられる。前者のリガンドを有し、肝実質細胞と接着する基質材としては、例えば、ポリ［Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコンアミド］）（以後、ＰＶＬＡと呼ぶ）を挙げることができ、後者のリガンドを有し上皮細胞や繊維芽細胞と接着する基質材としては、前述のＲＧＤ連鎖を有する細胞接着性ポリペプチドなどをあげることが出来る。
【０００９】上記細胞接着性ポリペプチドは、化学合成法または遺伝子組み換え法により製造されたものが好ましい。基質材のプレートへの固定化は、物理吸着または化学結合による方法が利用可能である。基質材のプレートへの固定化の確認は、接触角測定、ＥＰＭＡ等通常の高分子表面分析手法で実施することができる。
【００１０】細胞培養法の例示１ウエルに播種する細胞数は、ウエルの大きさにもよるが、好ましくは１０〜５００００個、特に好ましくは５０〜２００００個である。用いられる培地は、細胞の種類に応じて、血清添加培地または無血清培地を用いることが可能である。培養期間は、毒性試験の内容によるが、好ましくは５分〜１週間である。
被検物質の例示医薬品、医用材料、化粧品、農薬、食品添加物、ゴム、プラスチックなどの化学工業製品の開発において使用される合成化学物質および天然化学物質をあげることができる。医薬品の場合、毒性試験の他、癌細胞に対する抗ガン剤の効果、ウイルス感染細胞に対する抗ウイルス剤の効果等、一部の薬理検査を行うことも可能である。
装置の説明（クレーム５に記載の機能別に説明）
プレートを保持・異動し、プレートへの培地、試薬、被検物質等を注入。排出する装置は、ベルトコンベアー、ターンテーブル、ロボットアーム等のプレートを保持・移動・操作する機構と、プレートのウエル数と同数の、またはプレートの縦方向または横方向のウェルと同一数のノズルを当該ウェルと同一の間隔で設置した櫛形ノズルによる培地、試薬、被検物質等の注入・排出機構を装備する。プレートの蓋を開けた状態での各操作は、本装置内にＨＥＰＡフィルターによる無菌化空気を流入させた無菌空間で行うか、装置全体をクリーンベンチ又はクリーンルーム内のような無菌環境に設置することにより無菌的に行う。
【００１１】プレートを保持・異動し、プレート中の細胞に対する被検物質の影響を光学的、電気的に検出する装置は、ベルトコンベアー、ターンテーブル、ロボットアーム等のプレートを保持・移動する機構と、マイクロプレートリーダー、マルチチャンネルアンプおよび記録計を装備する。
【００１２】毒性試験法の説明毒性試験は、プレートに細胞を播種した後、被検物質を添加し、一定時間後の細胞増殖、細胞生存率、細胞活性などを測定するか、被検物質と細胞を同時に、あるいは被検物質に続いて細胞をプレートに入れ、プレートへの細胞接着率を測定することにより、被検物質を加えない対照細胞と比較することにより検出することが可能である。プレートへ細胞播種は、一種類の細胞あるいは他種類の細胞を播種するどちらの場合においても、同一種の細胞の細胞数は、通常、各ウエル同数とする。被検物質は通常、段階的に異なる濃度で添加し毒性の現れる濃度範囲を決定するが、一プレート内で被検物質の濃度を変化させることも、あるいは一プレート内での被検物質の濃度は同一とし、プレート間で被検物質の濃度を変化させることも可能である。また、被検物質は一プレート一物質でも、一プレート複数物質でも評価可能である。また、一プレート内のウエル数が多いため、同一実験点を増やして、多数のデータの統計的処理を行うことも容易であり、このことは実験の精度向上に寄与する。 また、１回の実験で処理することのできる実験点が多いことより、従来法より短時間で実験が処理でき、コストパフォーマンスが高い。 また複数個のウェルに対し均一な状態で短時間に同時に単位操作を実施できるため、実験の人為的バラツキを抑制することができる。
【００１３】さらに、あらかじめ代謝用肝細胞と被検物質を共存させ、代謝用肝細胞により代謝された被検物質誘導体を、多種類の細胞に添加することにより、被検物質誘導体の影響を評価することも可能である。この場合、被検物質誘導体の毒性を評価する多種類の細胞は、代謝用肝細胞とは別のウエルに播種することも可能であるし、被検物質誘導体を透過させることのできるチャンバーに播種して代謝用肝細胞のウエルに挿入することも可能であるし、代謝用肝細胞と同一ウエルに播種して基質への接着特異性により各細胞をパターンニングすることも可能である。細胞増殖、細胞生存率、細胞活性、細胞接着率の測定法としては、光学的検出の場合は、細胞増殖または細胞生存率を、クリスタルバイオレット、フェノールレッド色素取り込み法、トリパンブルー、メチレンブルー、ニグロシンなどによる色素排除法、ＭＴＴ法、ＬＤＨ法などの酵素測定法、細胞内のタンパク量あるいは核酸量測定による方法、等が、また、電気的検出の場合は細胞の活動電位測定による方法が使用可能である。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００１５】実施例１開口部面積１２．２５ｍｍ２、底面積６．２５ｍｍ２、内容積１２４μｌのポリスチレン製３８４ウエルプレート（Ｎｕｎｃ社製）一枚に、滅菌したＰＶＬＡ（生化学工業（株）製）の100μｇ／ｍｌ水溶液を３０μｌずつ加え、冷蔵庫に一晩放置後、滅菌水にて３回洗浄し、ＰＶＬＡ固定化３８４ウエルプレートを得た。このプレートにヒト肝癌由来株細胞（ＨｅｐＧ２、大日本製薬（株）製）を１×１０5個／ｍｌの濃度で２５μｌ播種し、一晩培養した。培地はダルベッコ変法イーグル培地（ＧＩＢＣＯ社製）に１０％となるよう牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）を加えたものを使用した。一晩培養後の細胞をハンクス液（ＧＩＢＣＯ社製）で２回洗浄し、２５μｌのハンクス液を加えた。ここに、被検物質として５ｎｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度に調整したドデシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳ、和光純薬工業（株）製）またはポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（以下エマルゲン９００、花王（株）製）のＰＢＳ溶液（日水製薬（株）製）を２５μｌ添加し、室温で１５分間放置した。同一濃度のウエルは５個用意した。その後プレートを遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分）し、上清２０μｌを別の３８４ウエルプレートに移した。ここに、ＬＤＨ測定試薬（和光純薬工業（株）製）２０μｌを加え、３０分間室温にて反応後、停止液を４０μｌ加え、５７０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。細胞の播種、培養、洗浄、被検物質の添加、上清の移液、試薬の添加、測定は細胞試験装置を用いた。結果を表１に示す。
【００１６】
【表１】
【００１７】実施例２実施例１と同型の３８４ウエルプレートに滅菌したＰＶＬＡまたはポリ３−Ｏ−４’−ビニルベンジル−Ｄ−グルコース（以下ＰＶＧ、生化学工業（株）製）の100μｇ／ｍｌ水溶液を３０μｌずつ加え、冷蔵庫に一晩放置後、滅菌水にて３回洗浄し、ＰＶＧ固定化３８４ウエルプレートを得た。このプレートのＰＶＬＡ固定化ウエルにＨｅｐＧ２を１×１０5個／ｍｌの濃度で２５μｌ播種し、一晩培養した。培地はダルベッコ変法イーグル培地に１０％となるよう牛胎児血清を加えたものを使用した。一晩培養後の細胞をハンクス液で２回洗浄し、２５μｌのハンクス液を加えた。さらに、このプレートのＰＶＧ固定化ウエルに家兎新鮮赤血球（以下ＲＢＣ）をハンクス液に４×１０5個／ｍｌの濃度で浮遊させた浮遊液２５μｌを播種した。１時間室温で静置後、被検物質として５ｎｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度に調整したＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ社製）のＰＢＳ溶液を２５μｌ添加し、室温で１５分間放置した。同一濃度のウエルは５個用意した。その後プレートを遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分）し、上清２０μｌを別の３８４ウエルプレートに移した。ここに、ＬＤＨ測定試薬（和光純薬工業（株）製）２０μｌを加え、３０分間室温にて反応後、停止液を４０μｌ加え、５７０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。細胞の播種、培養、洗浄、被検物質の添加、上清の移液、試薬の添加、測定は細胞試験装置を用いた。結果を表２に示す。
【００１８】
【表２】
【００１９】
【発明の効果】本発明により、一枚のプレートの各ウエルに一種類の細胞が特異的に接着し、機能発現した均質な多数のウエルを確保することができ、一度に多数の薬品の細胞毒性試験が可能となる。また、一枚のプレートの各ウエルに他種類の組織由来の細胞が特異的に接着し、機能発現した多数のウエルを確保することも可能であり、一度に一〜数種類の薬品の他種類の組織由来の細胞に対する細胞毒性試験が可能となる。同種類の細胞が培養された各ウエルは非常に均質であり、動物実験とは異なる個体差に影響されない実験を行うことができる。また、種々の定量法を用いることにより、動物実験とは異なる定量的な実験が可能である。また、動物の犠牲を最小限に抑えることが可能であり、動物の購入・飼育に関するコストも大幅に低減することが可能である。また、培地・試薬・被検物質の自動注入、排出装置および細胞に対する被検物質の影響を検出する細胞試験装置により、多数の実験を簡便に実施することができる。
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| 【出願人】 |
【識別番号】０００００４１７８
【氏名又は名称】ジェイエスアール株式会社
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| 【出願日】 |
平成１０年（１９９８）５月８日 |
| 【代理人】 |
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| 【公開番号】 |
特開平１１−３２６３１１ |
| 【公開日】 |
平成１１年（１９９９）１１月２６日 |
| 【出願番号】 |
特願平１０−１２６４６７ |
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