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【発明の名称】 生物学的活性物質の高分子量化
【発明者】 【氏名】藤田 聡

【氏名】遠山 貴博

【氏名】パイディ・イェラ・レディ

【氏名】融 健
【要約】 【課題】生物学的活性物質を片末端に有する重合体を形成しうるラジカル重合誘発剤、ならびに、その免疫検定への使用【解決手段】生物学的活性物質（例えば、抗体）に共有結合した、有機カルボン酸残基またはエチレン型不飽和二重結合を有する化合物の残基を有するラジカル重合誘発剤、ならびに該誘発剤を用いる重合体の製造方法および該方法を用いる生物学的試料中の微量物質の検出方法。

【解決手段】生物学的活性物質（例えば、抗体）に共有結合した、有機カルボン酸残基またはエチレン型不飽和二重結合を有する化合物の残基を有するラジカル重合誘発剤、ならびに該誘発剤を用いる重合体の製造方法および該方法を用いる生物学的試料中の微量物質の検出方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 式Ｂｉｏ−Ｉｎｔ （Ｉ）
［式中、Ｉｎｔは、ラジカル開始剤の存在下でラジカルを発生しうる基を有する少なくとも１個の残基を示し、Ｂｉｏは、抗体と抗原、ポリ（もしくはオリゴ）ヌクレオチドと該ヌクレオチドにハイブリダイズしうるポリ（もしくはオリゴ）ヌクレオチド、レセプターとリガンド、酵素−その阻害剤もしくは基質、アビジンとビオチンおよびレクチンと糖類からなる群より選ばれる特異的結合性対のいずれか一方の構成員、あるいは両構成員により形成された複合体に由来する残基を示し、そしてＢｉｏとＩｎｔは、Ｉｎｔの数に応じた数の共有結合によって結合している、但し、こうして結合しているＢｉｏ−ＩｎｔのＩｎｔ部分に存在するラジカルを発生しうる基は、それら自体を介して重合したＢｉｏ−Ｉｎｔを形成することができないものである］で表される生物学的活性物質を担持するラジカル重合誘発剤を含んでなる重合用組成物。
【請求項２】 ラジカル開始剤がレドックス開始剤である請求項１記載の組成物。
【請求項３】 Ｂｉｏが抗体または抗原−抗体からなる免疫複合体に由来する残基である請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】 −Ｉｎｔが式−Ｌ−Ａ−Ｃ(Ｒ)＝ＣＨ２または −Ｌ−Ｂ−ＣＯ2Ｈ［式中、Ａは単結合または基Ｃ(Ｒ)＝ＣＨ2の存在に起因してラジカルを発生する上で悪影響を及ぼさない二価の炭化水素基を示し、そしてＲは水素原子またはメチル基を示し、Ｂは基−ＣＯ2Ｈの存在に起因してラジカルを発生する上で悪影響を及ぼさない二価の炭化水素基を示し、Ｌは−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−または−ＣＳＮＨ−を示す］で表される請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】 −Ｉｎｔが式【化１】

［式中、Ｍは【化２】

または−ＮＨＮＨ−を示し、ｂは２〜８のいずれかの整数である］で表される請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】 −Ｉｎｔが式−ＣＯ−Ａ−Ｃ(Ｒ)＝ＣＨ2で示され、Ａが単結合でありそしてＲが水素もしくはメチル基であるか、あるいは【化３】

である請求項４記載の組成物。
【請求項７】 −Ｉｎｔが式 −ＣＯ−Ｂ−ＣＯ2Ｈで示され、Ｂが−ＣＨ2Ｃ(ＣＨ3)2−、−ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)−、−(ＣＨ2)a−（ここで、ａは１〜８のいずれかの整数である）、【化４】

からなる群より選ばれる請求項４記載の組成物。
【請求項８】 −ＩｎｔがＢｉｏに対して１〜１００モル当量存在する請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】 さらに、ラジカル重合性のエチレン型不飽和二重結合を有する少なくとも１種の単量体およびレドックス開始剤を構成する還元剤を含んでなる請求項１記載の組成物。
【請求項１０】 単量体がスチレンおよびＮ−フェニルマレイミドである請求項９記載の組成物。
【請求項１１】 式Ｂｉｏ−Ｉｎｔ （Ｉ）
［式中、Ｉｎｔは、ラジカル開始剤の存在下でラジカルを発生しうる基を有する少なくとも１個の残基を示し、Ｂｉｏは、抗体と抗原、ポリ（もしくはオリゴ）ヌクレオチドと該ヌクレオチドにハイブリダイズしうるポリ（もしくはオリゴ）ヌクレオチド、レセプターとリガンド、酵素−その阻害剤もしくは基質、アビジンとビオチンおよびレクチンと糖類からなる群より選ばれる特異的結合性対のいずれか一方の構成員、あるいは両構成員により形成された複合体に由来する残基を示し、そしてＢｉｏとＩｎｔは、Ｉｎｔの数に応じた数の共有結合によって結合している、但し、こうして結合しているＢｉｏ−ＩｎｔのＩｎｔ部分に存在するラジカルを発生する基は、それら自体を介して重合したＢｉｏ−Ｉｎｔを形成することができないものである］で表される生物学的活性物質を担持するラジカル重合誘発剤を、ラジカル重合性のエチレン型不飽和二重結合を有する少なくとも１種の単量体およびラジカル開始剤を含有する水性媒体中で共重合させることを特徴とする生物学的活性物質を分子の片末端に有する重合体の製造方法。
【請求項１２】 ラジカル開始剤がレドックス開始剤である請求項１１記載の重合体の製造方法。
【請求項１３】 生物学的試料中に存在することが疑われる被検体の検出方法であって、（Ａ） 式Ｂｉｏ−Ｉｎｔ （Ｉ）
［式中、Ｉｎｔは、ラジカル開始剤の存在下でラジカルを発生しうる基を有する少なくとも１個の残基を示し、Ｂｉｏは、抗体と抗原、ポリ（もしくはオリゴ）ヌクレオチドと該ヌクレオチドにハイブリダイズしうるポリ（もしくはオリゴ）ヌクレオチド、レセプターとリガンド、酵素−その阻害剤もしくは基質、アビジンとビオチンおよびレクチンと糖類からなる群より選ばれる特異的結合性対のいずれか一方の構成員、あるいは両構成員により形成された複合体に由来する残基を示し、そしてＢｉｏとＩｎｔは、Ｉｎｔの数に応じた数の共有結合によって結合している、但し、こうして結合しているＢｉｏ−ＩｎｔのＩｎｔ部分に存在するラジカルを発生する基は、それら自体を介して重合したＢｉｏ−Ｉｎｔを形成することができないものである］で表される生物学的活性物質を担持するラジカル重合誘発剤を、前記生物学的試料に加え、（Ｂ） 工程（Ａ）の前もしくは後または同時に、ラジカル重合性のエチレン型不飽和二重結合を有する少なくとも１種の単量体およびレドックス開始剤の還元剤を含有する水性液を前記生物学的試料に加え、（Ｃ） レドックス開始剤の酸化剤を含有する水性液を加えて重合反応を行い、次で（Ｄ） 工程（Ｃ）で形成される重合体の存否を生物学的試料中の被検体の存否の指標として評価する、ことを特徴とする被検体の検出方法。
【請求項１４】 単量体がスチレンおよびＮ−フェニルマレイミドである請求項１３記載の検出方法。
【請求項１５】 レドックス開始剤の還元剤が銀（Ｉ）イオンであり、そして酸化剤が過硫酸イオンである請求項１３または１４記載の検出方法。
【請求項１６】 式【化５】

［式中、Ａｂは抗体の残基であって、抗体を構成するペプチド結合に関与しないアミノ基または水酸基を有するアミノ酸部分から水素原子が除去された残基を示し、Ｌは−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−または−ＣＳＮＨ−を示し、Ｂは−ＣＨ2Ｃ(ＣＨ3)2−、−ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)−、−(ＣＨ2)a−（ここで、ａは１〜８のいずれかの整数である）、【化６】

からなる群より選ばれる二価の基であり、そしてｍは１〜１００のいずれかの整数である］で表される生物学的活性物質を担持する化合物。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は生物学的活性物質の高分子量化のための組成物に関する。かような組成物は、例えば、生体内微量物質の検出に使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】生体内微量物質を検出するために、ＥＬＩＳＡを初めとし、酵素標識を用いるイムノアッセイが広く使用されている。これは、理論的には酵素反応時間を長くすればする程、該反応を介して得られるシグナルが増強でき、高感度アッセイが可能であること等による。
【０００３】しかしながら、高感度を達成するには、酵素反応時間を比較的長くする必要があり、また使用する酵素の安定性に応じて、操作条件が限定されることもよくある。
【０００４】こうような酵素標識を用いる短所を考慮し、改良された免疫比濁法（turbidimetric immunoassay）も提案されている。例えば、特開平９−５４０９２号公報には、免疫学的活性物質重合体を検体中の被検物質と接触させて生じる反応生成物の比濁分析が記載されている。また、特開平９−６８５３０号公報には、酵素重合体（複数の酵素をペンダントとして有する重合体）に免疫学的活性物質を化学修飾した重合体も記載されている。なお、この重合体は酵素標識を用いる免疫測定法に分類されるものである。
【０００５】特開平９−５４０９２号公報では、ラジカル重合可能な重合性基が共有結合した抗体分子それ自体をマクロモノマーとして用い、重合させて得られた複数のペンダントとして抗体分子を有する重合体が公表されており、さらにかかる重合体を用いる抗原の比濁分析も公表されている。具体的には、被検体として抗原を含有する試料に上記重合体を加え、生成する免疫複合体による吸光度の変化を指標に抗原濃度を評価しようとするものである。
【０００６】この従来技術によれば、測定感度が高まることが示唆されているが、複数の抗体をペンダントとして有する重合体を用いるため、必ずしも抗体が効率よく利用されているとはいえない。また、巨大分子である抗体等が結合したラジカル重合可能な重合性基を介する重合反応は、必ずしも容易に進行させることができず、そのため所望の重合体を調製することが困難な場合もある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、主として、免疫比濁法に都合よく用いることのできる試薬を提供することにある。さらに一般的には、本発明は生物体に微量に存在する物質（本明細書では生物学的活性物質とも称する）のある一定の物質との特異的結合能を利用できる生物学的活性物質の化学的修飾体を提供することも目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、特に、抗体などの高分子量物質の化学的修飾や該物質の特異的結合能を効率よく利用するための手段を探究してきた。その結果、特定の官能基で該物質を化学修飾した場合、それらの官能基を介してラジカル重合を効率よく誘発できることを見い出した。
【０００９】したがって、本発明によれば、式Ｂｉｏ−Ｉｎｔ （Ｉ）
［式中、Ｉｎｔは、ラジカル開始剤の存在下でラジカルを発生しうる基を有する少なくとも１個の残基を示し、Ｂｉｏは、抗体と抗原、ポリ（もしくはオリゴ）ヌクレオチドと該ヌクレオチドにハイブリダイズしうるポリ（もしくはオリゴ）ヌクレオチド、レセプターとリガンド、酵素−その阻害剤もしくは基質、アビジンとビオチンおよびレクチンと糖類からなる群より選ばれる特異的結合性対のいずれか一方の構成員、あるいは両構成員により形成された複合体に由来する残基を示し、そしてＢｉｏとＩｎｔは、Ｉｎｔの数に応じた数の共有結合によって結合している、但し、こうして結合しているＢｉｏ−ＩｎｔのＩｎｔ部分に存在するラジカルを発生しうる基は、それら自体を介して重合したＢｉｏ−Ｉｎｔを形成することができないものである］で表される生物学的活性物質を担持するラジカル重合誘発剤を含んでなる重合用組成物が提供される。
【００１０】かような重合用組成物は、適当な単量体の共存下でラジカル重合反応、殊にレドックス重合に供すると、生物学的活性物質に悪影響を及ぼすことなく、片末端に生物学的活性物質が共有結合した重合体を効率よく製造するのに使用できる。したがって、もう一つの態様の本発明として、上記生物学的活性物質を担持するラジカル重合誘発剤を、ラジカル重合性のエチレン型不飽和二重結合を有する少なくとも１種の単量体およびラジカル開始剤を含有する水性媒体中で共重合させることを特徴とする生物学的活性物質を分子の片末端に有する重合体の製造方法も提供される。かような重合反応は、極めて迅速に重合反応が進行する。
【００１１】したがって、ある一定の試料中に存在することが疑われる被検体に応じて、上記生物学的活性物質を選び、試料中で被検体と生物学的活性物質とを特異的に結合させた複合体を形成した後、上記重合反応を試料中で実施すれば、かような複合体上で重合体鎖を迅速に成長させることができる。すなわち、上記重合反応を利用すれば、試料中で被検体を短時間で目視可能な程度まで巨大分子化することができる。こうして得られる重合体の量は、被検体の存否または存在量に比例して変化するので、上記重合反応により生成する重合体の量は、被検体の指標として容易に評価することができる。かくして、本発明によれば、生物学的試料中に存在することが疑われる被検体の検出方法であって、（Ａ）上記ラジカル重合誘発剤を、前記試料に加える工程、（Ｂ）工程（Ａ）の前もしくは後または同時にラジカル重合性のエチレン型不飽和二重結合を有する少なくとも１種の単量体およびレドックス開始剤の還元剤を含有する水性液を前記生物学的試料に加える工程、（Ｃ）レドックス開始剤の酸化剤を含有する水性液を加えて重合反応を行う工程、ならびに（Ｄ）工程（Ｃ）で形成される重合体の存否を生物学的試料中の被検体の存否の指標として評価する工程、を含んでなる検出方法も提供される。上述したごとく、かような方法によれば、検出の容易な巨大分子を迅速に生成しうるので、被検体の迅速かつ高感度の検出方法が提供できる。
【００１２】
【発明の具体的な態様】本発明にいう「ラジカル重合誘発剤」とは、それ自体は重合せず、適当なラジカル開始剤（触媒）と協同してラジカル重合反応を開始させるように作用する化合物を意味する。したがって、該ラジカル重合誘発剤を使用して、適当な単量体をラジカル重合させると、生成する重合体分子の片末端（開始末端）を該重合誘発剤の残基が占める。
【００１３】このような残基中には、生物学的活性物質が含有されていることに、本発明の特徴がある。本発明では、生物学的活性物質とは、主として、生物体中の微量成分と特異的に結合（バインディング）しうる物質を意味し、具体的には、抗体と抗原、ポリ（もしくはオリゴ）ヌクレオチドと該ヌクレオチドにハイブリダイズしうるポリ（もしくはオリゴ）ヌクレオチド、レセプターとリガンド、酵素−その阻害剤もしくは基質、アビジンとビオチンおよびレクチンと糖類からなる群より選ばれる特異的結合性対のいずれか一方の構成員、あるいは両構成員により形成される複合体を意味する。
【００１４】したがって、式（Ｉ）におけるＢｉｏ−は、抗体および抗原を初めとする上記特異的結合性対のいずれか一方の構成員、ならびに両構成員の複合体からなる群より選ばれる物質由来の残基である。これらの残基は、一般に、上記物質を構成する分子中のアミノ基および／水酸基から水素原子が除去された形態にある。かような残基は、上記ラジカル重合誘発剤の使用目的に応じて適当に選ぶことができ、生物学的試料中の被検体を検出する免疫比濁法においては、抗原または抗体のいずれか、殊に抗体に由来する残基であることが好ましい。こうして抗体がＢｉｏ−中に含有される場合、Ｂｉｏ−Ｉｎｔと単量体との重合反応によって形成される重合体は、上述の比濁法における検出用指標となるだけでなく、抗体の機能を利用して、適当な薬剤の送達用担体としても使用できるであろう。このような目的では、予め適当な薬剤を共有結合した単量体を、上記重合反応で使用するか、または単量体から成長した重合体鎖中に疎水結合等の物理的結合（バインディング）能を介して担持させてもよい。
【００１５】式（Ｉ）における−Ｉｎｔ部分、すなわちラジカル開始剤（好ましくは、レドックス開始剤）の存在下でラジカルを発生しうる基を有する残基は、限定されるものでないが、典型的には、式−Ｌ−Ａ−Ｃ(Ｒ)＝ＣＨ2（Ｉｎｔ−ａ）または−Ｌ−Ｂ−ＣＯ2Ｈ（Ｉｎｔ−ｂ）
で表され、ここでＡは単結合または基Ｃ(Ｒ)＝ＣＨ2の存在に起因してラジカルを発生する上で悪影響を及ぼさない二価の炭化水素基を示し、そしてＲは水素原子またはメチル基を示し、Ｂは基−ＣＯ2Ｈの存在に起因してラジカルを発生する上で悪影響を及ぼさない二価の炭化水素基を示し、Ｌは−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−または−ＣＳＮＨ−を示す。また、上記式中の連結基−Ｌ−は、−Ｏ−で置き換っていてもよく、この場合、Ｂｉｏ−における結合基は、生物学的活性物質中のカルボキシル基に由来する−ＣＯＯ−であることができる。
【００１６】こうして、式（Ｉ）のラジカル重合誘発剤のＢｉｏ部分とＩｎｔ部分は、限定されるものでないが、好ましくは−ＮＨＣＯ−、−ＯＣＯ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＳＮＨ−または−ＣＯＯ−によって共有結合されている。
【００１７】上記式（Ｉｎｔ−ａ）で表される残基の特に好ましいものとしては、−ＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ2、−ＣＯ−Ｃ(ＣＨ3)＝ＣＨ2、【００１８】
【化７】

【００１９】が挙げられる。一方、上記式（Ｉｎｔ−ｂ）で表される残基は、より具体的には、式中のＢが−ＣＨ2Ｃ(ＣＨ3)2−、−ＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)−、−(ＣＨ2)a−（ここで、ａは１〜８のいずれかの整数である）、【００２０】
【化８】

【００２１】からなる群より選ばれるいずれの連結基であるものを挙げることができる。これらのうち、特に好ましい残基は、−ＣＯＣＨ2Ｃ(ＣＨ3)2−ＣＯＯＨ、−ＣＯＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)−ＣＯＯＨ、−ＣＯＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＣＯＣＨ2ＣＯＯＨ、【００２２】
【化９】

【００２３】−ＣＯＮＨＣＨ2Ｃ(ＣＨ3)2−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)−ＣＯＯＨ、−ＣＳＮＨＣＨ2Ｃ(ＣＨ3)2−ＣＯＯＨおよび−ＣＳＮＨＣＨ2ＣＨ(ＣＨ3)−ＣＯＯＨである。
【００２４】さらに、−Ｉｎｔは、式【００２５】
【化１０】

【００２６】［式中、Ｍは【００２７】
【化１１】

【００２８】または−ＮＨＮＨ−を示し、ｂは２〜８のいずれかの整数である］で表される基であることができる。
【００２９】上記のようなＢｉｏ部分を構成する生物学的活性物質は、官能基として、一、二もしくは三級アミノ基、水酸基、カルボキシル基またはメルカプト基を有している。したがって、Ｂｉｏ部分とＩｎｔ部分との間の共有結合を形成するには、Ｉｎｔ部分の出発原料として、例えば、上記式（Ｉｎｔ−ａおよびＩｎｔ−ｂ）の−Ｃ(Ｒ)＝ＣＨ2または−ＣＯ2Ｈ以外に、上記Ｂｉｏの官能基との縮合反応によって共有結合を形成しうる、カルボキシル基、水酸基またはメルカプト基を有する化合物を選べばよい。上記のＢｉｏ部分およびＩｎｔ部分のそれぞれの出発原料を、それ自体既知の、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド等の縮合剤を用いて、縮合させるか、またはＩｎｔ部分が式（Ｉｎｔ−ｂ）で表される場合には、対応するジカルボン酸の酸無水物を用い、またはイソシアナートもしくはチオイソシアナート基を有するカルボン酸を用い直接、Ｂｉｏのアミノ基または水酸基に反応させて、ペプチド結合、エステル結合またはウレイドもしくはチオウレイド結合を形成することにより、式（Ｉ）のＢｉｏ−Ｉｎｔを提供できる。また、Ｂｉｏ部分とＩｎｔ部分は、上記のように、それぞれ対応する出発原料どうしを直接結合することができるが、上記に挙げた官能基を分子の両末端に有する化合物をスペーサーとして用いて、Ｂｉｏ部分とＩｎｔ部分を連結することもできる。このような結合様式をもつＢｉｏ−Ｉｎｔも本発明の範囲内に入る。このようなスペーサーを形成することのできる化合物としては、アルキレン鎖が酸素または窒素原子で中断されていてもよいアルキレンジアミン、アルキレンジオールを挙げることができる。このようなスペーサー基の導入方法も、上記のような縮合反応を介して実施することができる。
【００３０】上記のようなＢｉｏ部分とＩｎｔ部分の結合方法によると、Ｂｉｏ部分に対して１個ないし複数個のＩｎｔ部分が結合しうる。例えば、Ｂｉｏ部分が抗体分子に由来する場合、抗体の有する生物学的活性（抗原に対する特異的結合能）は、１分子のＢｉｏに対して１００分子のＩｎｔが結合しても、残存しうる。したがって、式（Ｉ）のＢｉｏ−Ｉｎｔは、１分子のＢｉｏに対して、１ないし１００分子のＩｎｔが結合したものが包含される。
【００３１】式（Ｉ）のＢｉｏ−Ｉｎｔは、水性媒体中、ラジカル開始剤の存在下でラジカルを発生し、ラジカル重合性のエチレン型不飽和二重結合を有する単量体が共存すると、それらの単量体に基づく重合鎖を、Ｉｎｔ部分上に成長させることができる。なお、Ｂｉｏ−Ｉｎｔにおけるラジカルを発生しうる基が−Ｃ(Ｒ)＝ＣＨ2の場合、Ｂｉｏ−Ｉｎｔは、それ自体がマクロモノマーとして重合しうることもある。このように、Ｂｉｏ−Ｉｎｔがマクロモノマーとして重合しうる時には、Ｂｉｏ−Ｉｎｔは、Ｂｉｏを介して固体支持体上に固定されていることが必要であるかも知れない。すなわち、本発明の「但し」書きにいう、「Ｂｉｏ−ＩｎｔのＩｎｔ部分に存在するラジカルを発生しうる基は、それら自体を介して重合したＢｉｏ−Ｉｎｔを形成することができないものである」とは、上記のように、Ｂｉｏ−Ｉｎｔが固体支持体上に固定される場合を包含する。固体支持体としては、各種材料から作製された試験管またはビーカー等の壁、やその他水不溶性重合体ビーズもしくは膜等が挙げられる。
【００３２】Ｂｉｏ−Ｉｎｔにラジカルを発生させるには、それ自体既知のラジカル開始剤が使用できるが、生物学的活性物質に悪影響を及ぼさないものを選ぶことが望まれる。かような観点から、好ましいものとしてはレドックス開始剤を挙げることができる。本発明に従う、Ｂｉｏ−Ｉｎｔは、レドックス開始剤を用いて、効率よくラジカルを発生させうることに特徴がある。使用できるレドックス開始剤は、上記目的に沿うものであれば、いかなる酸化性物質（または酸化剤ともいう）と還元性物質（または還元剤ともいう）との組み合わさった系であることができる。限定されるものでないが、好ましくは水系の過硫酸アンモニウムもしくは過硫酸カリウムと硝酸銀の系、過硫化水素とＦｅ2+（フェントン試薬）、過硫酸カリウムもしくは過硫酸アンモニウムと亜硫酸ナトリウムもしくは亜硫酸水素ナトリウムの系等をレドックス開始剤として挙げることができる。
【００３３】このようなレドックス開始剤を使用する場合、酸化性物質と還元性物質のいずれか一方、好ましくは、還元性物質を、式（Ｉ）のラジカル重合誘発剤およぴ単量体と組み合わせて含有する水性組成物は、例えば、式（Ｉ）のラジカル重合誘発剤を、その中の生物学的活性物質の特異的結合能を利用して、他の特異的結合性構成員と結合させた後、残りの酸化性物質を加えると、イン・サイチュー（insitu）で重合反応が起こり、水性組成物中で不溶性の重合体が現れてくる。この重合体は目視さえ可能である。したがって、式（Ｉ）のラジカル重合誘発剤、単量体および還元性物質を含有する水性組成物は、式（Ｉ）のラジカル重合誘発剤中に存在する生物学的活性物質（例えば、抗体）と特異的結合性対を構成する他の構成員（例えば、抗原）の検出用試薬として有用である。当然なことに、該試薬で検出できる被検体は、抗原に限らず、式（Ｉ）のＢｉｏ部分に存在する特異的結合性対の他方の構成員であることもできる。
【００３４】単量体は、ラジカル重合性のエチレン型不飽和二重結合を有するものであれば、いずれも使用できる。このような単量体の具体的なものとしては、各種スチレン類、（メタ）アクリル酸アルキル、（メタ）アクリル酸アミド、ピロリドン、Ｎ−置換マレイミド（置換基としては、さらに置換されていてもよいアリール基、アルキル基、等）、またはそれらの２種以上の組み合わせが挙げられる。上記反応系を検出用試薬として用いる場合は、（メタ）アクリル酸アルキルのアルキル基に代え、発色もしくは蛍光色素となりうる基を導入したものや、またＮ−置換マレイミドのＮ−置換基として、該色素となりうる基を導入したものが、好ましいこともある。あるいは、上記のような色素分子等に代え、医薬化合物を、上記の単量体に担持させると、上述の反応系で製造される重合体は、ドラッグデリバリー用の薬物として使用しうる可能性もある。
【００３５】特に、式（Ｉ）の重合誘発剤を用いて、被検体が存在することの疑われる生物学的試料中でイン・サイチューの重合反応を行い、被検体を検出する場合、式（Ｉ）の重合誘発剤が有する生物学的活性物質は、抗体であることが好ましい。この際、被検体は、反応容器、例えば、試験管、マイクロタイターウェル、等の壁に固定化されたさらなる抗体によって捕捉された状態であることが望ましい。また、式（Ｉ）のラジカル重合誘発剤としては、好ましくは、下式【００３６】
【化１２】

【００３７】［式中、Ａｂは抗体の残基であって、抗体を構成するペプチド結合に関与しないアミノ基または水酸基を有するアミノ酸部分から水素原子が除去された残基を示し、Ｂは−ＣＨ2−Ｃ(ＣＨ3)2−、−ＣＨ2−ＣＨ(ＣＨ3)−、−(ＣＨ2)a−（ここで、ａは１〜８のいずれかの整数である）、【００３８】
【化１３】

【００３９】からなる群より選ばれる二価の基を示し、Ｌは−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−または−ＣＳＮＨ−を示し、そしてｍは１〜１００のいずれかの整数である］で表される生物学的活性物質を担持する化合物、特に好ましくは、上記Ｂが−ＣＨ2Ｃ(ＣＨ3)2−である化合物が使用できる。
【００４０】前記抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体のいずれをも包含し、限定されるものでないが、アレルゲン、例えばハウスダスト、花粉、ダニ、アルブミンに対する抗体であることができる。これらの抗体は市販のものを使用することもできる。
【００４１】以上のとおり、本発明に従い提供される式（Ｉ）のラジカル重合誘発剤を含有する組成物は、片末端に生物学的活性物由来の残基を有する重合体を提供するのに有用である上に、生物学的試料、例えば、動植物の細胞調製物、ならびに動物の血液、尿、その他の体液、中の微量成物、例えば、タンパク質、ペプチド、糖、核酸の検出に有用である。
【００４２】
【実施例】以下、具体例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【００４３】製造例１：スチレン標識ヒトアルブミン抗体の製造本例は、式（Ｉ）のＢｉｏ部分がヒトアルブミン抗体残基を有し、そしてＩｎｔ部分がスチレン型の部分を有するラジカル重合誘発剤（以下、スチレン標識ヒトアルブミン抗体という）の製造例を記述する。
【００４４】（１） ４−ビニル安息香酸スクシンイミジルエステルの合成ナスフラスコに４−ビニル安息香酸（１００ｍｇ ０.６７ｍｍｏｌ）を入れ、アルゴンで置換した後、２ｍｌの脱水アセトニトリルを加え溶解させた。次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（７７ｍｇ ０.６７ｍｍｏｌ）／０.５ｍｌアセトニトリルとＮ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１３９ｍｇ ０.６７ｍｍｏｌ）／０.５ｍｌアセトニトリルを加え、室温で１２時間撹拌した。ウレアをろ過で取り除き、結晶をアセトニトリルで洗浄した後アセトニトリルを減圧留去すると目的物の４−ビニル安息香酸スクシンイミジルエステルを１５５ｍｇ（収率１００％）で得た。
【００４５】（２） スチレン標識ヒトアルブミン抗体の合成１０ｍｇの４−ビニル安息香酸スクシンイミジルエステルを１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた。次いで、ヒトアルブミン抗体を０.１Ｍほう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８.８）に１ｍｇ／ｍｌになるように溶解させた。次いで、その抗体０.１ｍｇ／０.１ｍｌに対して４−ビニル安息香酸スクシンイミジルエステルのＤＭＳＯ溶液を０.００３ｍｌ（０.０３ｍｇ）加え室温で４時間反応させ、１Ｍ塩化アンモニウム溶液を０.００２４ｍｌ加え、室温で１０分間反応させることによって、ヒトアルブミン抗体にスチレン標識をカップリングした。
【００４６】機能試験例１：本例は、製造例１で得られたスチレン標識ヒトアルブミン抗体の機能について試験するものである。
【００４７】（１） スチレン標識ヒトアルブミン抗体とヒトアルブミンのカップリングアルブミン抗原をホスフェート緩衝液（ＰＢＳ）に０.１および０.０１ｍｇ／ｍｌの２条件で溶解した。次いで、その抗原をマイクロプレートに０.１ｍｌ／ウエルずつ分注し４℃オーバーナイトインキュベートした。次いで、洗浄液によって洗浄し、４倍希釈ブロッキング液によってブロッキングし、室温で３０分間インキュベートした。次いで、洗浄し、スチレン標識アルブミン抗体をＰＢＳブロッキング液に０.１および０.０１ｍｇ／ｍｌの２条件で希釈し、抗原が固定された各ウエルに０.１ｍｌずつ注入し、室温で１時間反応させた。（スチレン標識抗体が固定化抗原と結合している状態の確認として、ＰＢＳブロッキング液で１０００倍希釈したアルカリホスフェターゼ標識マウスＩｇＧ抗体を２次抗体として１時間カップリングさせ、次いで、リン酸化された４−ニトロフェノールの水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０.１ｍｌを加え、室温で１時間反応させると黄色い発色が確認された。こうして、ヒトアルブミンとスチレン標識ヒトアルブミン抗体の結合が確認された。）
（２） スチレン標識ヒトアルブミン抗体上での重合体化反応（２−１） 重合体化試薬の調製反応溶液Ａの調製：試験管にＮ−フェニルマレイミド（５０ｍｇ、０.２８８ｍｍｏｌ）を入れ、そこにピバリン酸（０.２９ｍｇ、０.０１ｍｏｌｅｑ）のジメチルアミド（０.０１４４Ｍ）溶液を０.２ｍｌ加え、完全に溶解させた。次いで、スチレン（０.０３３ｍｌ、０.２８８ｍｍｏｌ）を加え、次いで、硝酸銀水溶液（０.２Ｍ）を０.０１ｍｌ（０.０１ｍｏｌｅｑ）を加え、さらに蒸留水を０.２６ｍｌ加えた。この反応溶液をＡとする。
【００４８】反応溶液Ｂの調製：２Ｍの過硫酸アンモニウム水溶液を調製した。
【００４９】（２−２） 重合体化反応上記機能の試験例で、ヒトアルブミン抗原とスチレン標識ヒトアルブミン抗体を結合操作後、洗浄を行い、洗浄緩衝液を留去後、反応液Ａを５０μｌ加え、次いで反応液Ｂを１０μｌ加えると直後に結晶が析出した（重合体化反応が起きた）。次いで、非特異的な重合体を除去するため、緩衝液で洗浄すると抗体に結合した重合体の結晶が目視によって観察できた。
【００５０】製造例２：２,２−ジメチルプロピオン酸標識ヒトアルブミン抗体の製造本例は、式（Ｉ）のＢｉｏ部分がヒトアルブミン抗体残基を有し、そしてＩｎｔ部分が−ＣＯＣＨ2Ｃ(ＣＨ3)2ＣＯＯＨを有するラジカル重合誘発剤（以下、２,２−ジメチルプロピオン酸標識ヒトアルブミン抗体という）の製造例を記述する。
【００５１】（１） ２,２−ジメチルコハク酸無水物の合成３０ｍｌナス型フラスコに２,２−ジメチルコハク酸（２ｇ、０.０１３７ｍｏｌ）を入れ、アルゴン置換後、蒸留した無水酢酸（８ｍｌ）加え溶解した。次いで、加熱還流を４時間行い、ＴＬＣにより、原料の消失を確認した。次いで、蒸留により溶媒留去すると、ガム状の沈殿物が得られた。この沈殿を、脱水蒸留したテトラヒドロフラン／脱水蒸留したヘキサン（１：３）で再結晶を行った。次いで、吸引濾過で結晶を取り出し、乾燥させると目的物の２,２−ジメチルコハク酸無水物が９８％収率で得られた。
【００５２】1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１.４５（６Ｈ，ｓ），２.８２（２Ｈ，ｓ）
（２） ２,２−ジメチルプロピオン酸標識ヒトアルブミン抗体の合成１０ｍｇの２,２−ジメチルコハク酸無水物を１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた。一方、ヒトアルブミン抗体を０.１Ｍほう酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８.８）に１ｍｇ／ｍｌになるように溶解させた。次いで、その抗体０.１ｍｇ／ｍｌに対して２,２−ジメチルコハク酸無水物のＤＭＳＯ溶液を０.００３ｍｌ（０.０３ｍｇ）加え室温で１時間反応させ、さらに１Ｍ塩化アンモニウム溶液を０.００２４ｍｌ加え室温で１０分間反応させることによって、ヒトアルブミン抗体にスチレン標識をカップリングした。
【００５３】機能試験例２：本例は、製造例２で得られた、２,２−ジメチルプロピオン酸標識ヒトアルブミン抗体の機能について試験するものである。
【００５４】（１） 表面プラズモン共鳴解析装置による２,２−ジメチルプロピオン酸標識の確認上記製造例２の操作（２）において、カップリング反応を１時間および３時間、それぞれ行い、表面プラズモン共鳴解析装置による２,２−ジメチルプロピオン酸標識効率を検討した。方法として、まず、比較として、４℃に未標識のヒトアルブミン抗体を１時間および３時間、それぞれ放置した抗体と、室温に未標識のヒトアルブミン抗体を１時間および３時間、それぞれ放置した抗体それぞれ用意した。次いで、表面プラズモン共鳴解析装置のチップにヒトアルブミン抗原０.０１μｇ／ｍｌを固定化し、次いで、上記６種類の抗体をリン酸バッファー（ｐＨ７.２）で１００倍希釈した溶液を泳動させた。泳動溶媒はリン酸バッファー（ｐＨ７.２）で行った。それぞれの抗体の抗原との結合効率（＝標識化合物のカップリング効率）を表１に示す。
【００５５】表１：表面プラズモン共鳴解析装置による２,２−ジメチルプロピオン酸の抗体への標識効率【００５６】
【表１】

【００５７】表１より、２,２−ジメチルプロピオン酸標識ヒトアルブミン抗体は、抗体１分子当たり約８０分子の標識が共有結合していることが予測できる。
【００５８】（２） ２,２−ジメチルプロピオン酸標識ヒトアルブミン抗体とヒトアルブミンのカップリングアルブミン抗原をホスフェート緩衝液（ＰＢＳ）に０.１および０.０１ｍｇ／ｍｌの２条件で溶解した。次いで、その抗原をマイクロプレートに０.１ｍｌウエルずつ分注し４℃オーバーナイトインキュベートした。次いで、洗浄液によって洗浄し、４倍希釈ブロッキング液によってブロッキングし、室温で３０分間インキュベートした。次いで、洗浄し、２,２−ジメチルプロピオン酸標識アルブミン抗体をＰＢＳブロッキング液に０.１及び０.０１ｍｇ／ｍｌの２条件で希釈し、抗原が固定された各ウエルに０.１ｍｌずつ注入し、室温で１時間反応させた。（２,２−ジメチルプロピオン酸標識抗体が固定化抗原と結合している状態の確認として、ＰＢＳブロッキング液で１０００倍希釈したアルカリホスフェターゼ標識マウスＩｇＧ抗体を、２次抗体として１時間カップリングさせ、次いで、リン酸化された４−ニトロフェノールの水溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０.１ｍｌを加え、室温で１時間反応させると黄色い発色が確認された。このことより、ヒトアルブミンと２,２−ジメチルプロピオン酸標識ヒトアルブミン抗体の結合が確認された。）
（３） ２,２−ジメチルプロピオン酸標識ヒトアルブミン抗体上でのポリマー化反応（３−１）：重合体化試薬の調製反応溶液Ａの調製：試験管にＮ−フェニルマレイミド（５０ｍｇ、０.２８８ｍｍｏｌ）を入れ、そこにＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液を０.５ｍｌ加え、完全に溶解させた。次いで、スチレン（３.３μｌ、０.０２８８ｍｍｏｌ）を加え、次いで、硝酸銀水溶液（０.２Ｍ）を０.０１ｍｌ（０.０１ｍｏｌｅｑ）を加え、さらに蒸留水を０.２４ｍｌ加えた。この反応溶液（０.７５ｍｌ）をＡとする。
【００５９】反応溶液Ｂの調製：２Ｍの過硫酸アンモニウム水溶液を調製した。
【００６０】（３−２）：重合体化反応上記（２）のヒトアルブミン抗原と２,２−ジメチルプロピオン酸標識ヒトアルブミン抗体を結合操作後洗浄を行った。洗浄緩衝液を留去後、反応液Ａを７５μｌ加え、次いで反応液Ｂを２５μｌ加えると３分後に結晶が析出した（重合体化反応が起きた）。次いで、非特異的なポリマーを除去するため、緩衝液で洗浄すると抗体に結合した重合体の白い結晶が目視によって観察できた。
【００６１】製造例３〜９本例は、各種カルボン酸（抗体に結合していない）をラジカル重合誘発剤として用い、レドックス開始剤の存在下で重合反応を行った場合の重合の進行状況を確認するためのものである。
【００６２】レドックス開始剤を用いた懸濁重合法による重合体化試験管にＮ−フェニルマレイミド（５０ｍｇ、０.２８９ｍｍｏｌ）を加え、次いで、トルエン０.３ｍｌ、スチレン（３３μｌ、０.２８９ｍｍｏｌ）を加え、溶解させた。そこに０.０２８９Ｍの下記表２に示す各種有機カルボン酸（０.１ｍｌ、０.０１ｍｏｌｅｑ）水溶液、０.０２８９Ｍの硝酸銀（０.１ｍｌ、０.０１ｍｏｌｅｑ）水溶液、０.０２８９Ｍの過硫酸アンモニウム（０.１ｍｌ、０.０１ｍｏｌｅｑ）水溶液を順に加え、室温で３０分撹拌すると、それぞれ沈殿物が析出した。ここに、塩化メチレンをいれ、抽出し、脱水後、溶媒留去した。得られた結晶を塩化メチレンに溶解させ、その溶液をメタノールにゆっくり滴下し再沈を行った。吸引濾過で、結晶を取り出し、ＧＰＣ（ゲル透過クロマトグラフィー）により分子量分布を測定し、分子量を計算した。結果をまとめて表２に示す。
【００６３】
【表２】

【００６４】比較製造例：ラジカル重合誘発剤である有機カルボン酸を加えないときの重合体化本例は、上記製造例３〜９における反応系に有機カルボン酸を加えないで重合を行った場合の、単量体（Ｎ−フェニルマレイミドおよびスチレン）の反応性を検討するものである。
【００６５】試験管にＮ−フェニルマレイミド（５０ｍｇ、０.２８９ｍｍｏｌ）を加え、次いで、トルエン０.３ｍｌ、スチレン（３３μｌ、０.２８９ｍｍｏｌ）を加え、溶解させた。そこに水（０.１ｍｌ）、０.０２８９Ｍの硝酸銀（０.１ｍｌ、０.０１ｍｏｌｅｑ）水溶液、０.０２８９Ｍの過硫酸アンモニウム（０.１ｍｌ、０.０１ｍｏｌｅｑ）水溶液を順に加え、室温で３０分から１時間撹拌しても沈殿物は析出しなかった。ここに、塩化メチレンをいれ、抽出し、脱水後、溶媒留去した。得られた結晶を塩化メチレンに溶解させ、その溶液をメタノールにゆっくり滴下し再沈を行った。吸引濾過で、結晶を取り出し、ＧＰＣ（ゲル透過クロマトグラフィー）により分子量分布を測定し、分子量を計算した。分子量は５１０であった。
【００６６】このことより、本発明に従う、生物学的活性物質を標識する予定のラジカルを発生しうる基、すなわち有機カルボン酸残基が存在しないと重合体化が進行しないことが予期できる。換言すれば、式（Ｉ）のラジカル重合誘発剤において、有機カルボン酸残基が重合体鎖を成長させる上で、重要な役割を担っていることがわかる。
【出願人】 【識別番号】０００００００１１
【氏名又は名称】アイシン精機株式会社
【出願日】 平成１０年（１９９８）３月２４日
【代理人】 【弁理士】
【氏名又は名称】小田島 平吉 （外２名）
【公開番号】 特開平１１−２７１３０６
【公開日】 平成１１年（１９９９）１０月８日
【出願番号】 特願平１０−９３９１３