| 【発明の名称】 |
ハプテンの免疫学的測定法 |
| 【発明者】 |
【氏名】黒川 祐人
【氏名】天野 善之
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| 【要約】 |
【課題】ハプテンの免疫学的測定法おいて、低濃度のハプテンでも精度良く測定することができること。
【解決手段】検体中のハプテンと、ハプテンを認識する抗体（Ａ）との免疫反応をハプテン乖離剤（Ｂ）の存在下で行う方法であり、検体中のハプテンと、抗体（Ａ）と、抗体（Ａ）を認識する抗体の不溶化抗体（Ｃ）と、標識化ハプテン（Ｄ）とを同時または逐次に免疫反応させる。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】検体中のハプテンと、ハプテンを認識する抗体（Ａ）との免疫反応をハプテン乖離剤（Ｂ）の存在下で行う方法であり、検体中のハプテンと、抗体（Ａ）と、抗体（Ａ）を認識する不溶化抗体（Ｃ）と、標識化ハプテン（Ｄ）とを同時または逐次に免疫反応させることを特徴とするハプテンの免疫学的測定法。
【請求項２】ハプテン乖離剤（Ｂ）が、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸、サリチル酸またはこれらの塩類である請求項１記載の免疫学的測定法。
【請求項３】検体中のハプテンと、抗体（Ａ）と、不溶化抗体（Ｃ）とを同時または逐次に免疫反応させ、次いで、未反応物を除去した後に標識化ハプテン（Ｄ）を免疫反応させる請求項１または２記載の免疫学的測定法。
【請求項４】抗体（Ａ）がモノクローナル抗体であり、不溶化抗体（Ｃ）がポリクローナル抗体である請求項１〜３の何れか記載の免疫学的測定法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ハプテンの免疫学的測定法に関する。さらに詳しくは、検体中のハプテンの濃度を精度良く測定できるハプテンの免疫学的測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ハプテンの免疫学的測定法としては、検体中のハプテンと、ハプテンを認識する抗体との免疫反応をハプテン乖離剤の存在下で行う方法であって、検体中のハプテンと、ハプテンを認識する抗体の不溶化抗体と、標識化ハプテンとを同時または逐次に免疫反応させる方法（一抗体競合法）が知られていた。具体的には、「ホルモンと臨床，３１巻，ｐ．８９，１９８３年（文献■）」や「医学と薬学，２１巻，２号，ｐ．３１５，１９８９年（文献■）」に記載のハプテンの免疫学的測定法が挙げられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の一抗体競合法による免疫学的測定法では、検体中のハプテンが低濃度の場合、ハプテンの濃度を精度良く測定することができなかった。例えば、文献■記載のトリヨードサイロニン（以下、Ｔ3とする）の免疫学的測定法において、測定検体のＴ3濃度が１．１ｎｇ／ｍＬの場合の同時再現性（ＣＶ）は７％である。又、文献■記載のサイロキシン（以下、Ｔ4とする）の免疫学的測定法において、測定検体のＴ4濃度が３．１μｇ／ｄｌの場合の同時再現性（ＣＶ）は７％である。文献■、■の何れの方法も測定精度の面で不十分なハプテンの免疫学的測定法であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題を解決するため鋭意検討した結果、低濃度のハプテンでも精度良く測定することができるハプテンの二抗体競合法による免疫学的測定法を見出し、本発明に到達した。すなわち本発明は、検体中のハプテンと、ハプテンを認識する抗体（Ａ）との免疫反応をハプテン乖離剤（Ｂ）の存在下で行う方法であり、検体中のハプテンと、抗体（Ａ）と、抗体（Ａ）を認識する不溶化抗体（Ｃ）と、標識化ハプテン（Ｄ）とを同時または逐次に免疫反応させることを特徴とするハプテンの免疫学的測定法である。
【０００５】
【発明の実施の形態】従来の一抗体競合法は、免疫反応の中で最も重要な、検体中のハプテンと、ハプテンを認識する抗体との反応が、液相−固相のみの反応である。それに対し、本発明の二抗体競合法は、検体中のハプテンとハプテンを認識する抗体との反応が、液相−液相および液相−固相の反応である。よって、本発明の方法では従来の方法と比べ、免疫反応の効率が格段に向上し、低濃度のハプテンでも精度良く測定することが可能になると推測される。
【０００６】本発明の方法では、検体中のハプテンと、ハプテンを認識する抗体（Ａ）と、不溶化抗体（Ｃ）と、標識化ハプテン（Ｄ）とを同時または逐次に免疫反応させるが、好ましくは、検体中のハプテンと、抗体（Ａ）と、不溶化抗体（Ｃ）とを同時または逐次に免疫反応させ、次いで、未反応物を除去した後に標識化ハプテン（Ｄ）を免疫反応させる（二抗体競合法＆二段階反応）。
【０００７】本発明の方法において、ハプテンを認識する抗体（Ａ）としては、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体が使用できるが、抗体の特異性の面からモノクローナル抗体が好ましく使用される。
【０００８】本発明の方法において、抗体（Ａ）を認識する不溶化抗体（Ｃ）は、抗体（Ａ）を認識する抗体が不溶性担体に結合し、不溶化されたものである。抗体（Ａ）を認識する抗体としては、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体が使用できるが、ＨＡＭＡの影響を避けるために、抗体（Ａ）にモノクローナル抗体を使用した場合は、抗体（Ａ）を認識する抗体には、ポリクローナル抗体を使用することが好ましい。尚、ＨＡＭＡとは、ヒト検体中に存在する抗体で、二つのモノクローナル抗体を架橋するように結合するので、免疫学的測定法における干渉物として知られている「例えば、臨床化学，１８巻，４号，ｐ．２０２，１９８９年」。
【０００９】抗体（Ａ）を得るために用いる免疫動物や、抗体（Ａ）を認識する抗体を得るために用いる免疫動物としては、抗体を産生できる動物であれば特に限定されない。好ましい動物は、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、マウス及びモルモットである。
【００１０】本発明の方法において、検体中のハプテンは、血中に一部は遊離状態で存在し大部分はキャリアー蛋白に結合した状態で存在する。ハプテンとしては、例えば、甲状腺ホルモン（ジヨードサイロニン（Ｔ２）、Ｔ３、Ｔ４、リバースＴ３（ｒＴ３））、ステロイドホルモン（コーチゾール、エストラジオール、テストステロン、アルドステロン、プロゲステロンおよびそれらの誘導体など）、薬剤（ジゴキシン、ジギトキシン、ジフェニルヒダントイン、テオフィリン、モルフィン、ペニシリンなど）が挙げられる。これらのうち、測定対象として好ましいものは、甲状腺ホルモンであり、さらに好ましいものは、Ｔ３、Ｔ４である。また、標識化ハプテン（Ｄ）に用いられるハプテンとしても、検体中のハプテンと同様のものが使用でき、好ましいものも同様である。
【００１１】上記血中のキャリアー蛋白は、例えば、ＴＢＧ、ＴＢＰＡ、アルブミン、性ホルモン結合グロブリン、コーチゾール結合蛋白などである。
【００１２】本発明の方法において、ハプテン乖離剤（Ｂ）は、ハプテンとキャリアー蛋白の結合を切断するものであれば特に限定されない。また、ハプテン乖離剤（Ｂ）は、単独でも複数の混合でも使用できる。ハプテン乖離剤（Ｂ）として、好ましいものは、分子量５００以下のものであり、例えば、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸、サリチル酸、ジフェニルヒダントイン、トルブタミド、フロセミドなどや、それらの塩類である。ハプテン乖離剤（Ｂ）として、さらに好ましいものは、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸、サリチル酸、それらの塩類であり、最も好ましいものは、サリチル酸、サリチル酸塩である。
【００１３】不溶化抗体（Ｃ）に用いる不溶性担体の材質としては、ケイ酸質無機担体［ガラス（ポ−ラス、ツヤ消しガラスなど）、シリカゲル、ベンナイトなど］、磁性体、有機担体（プラスチック、デキストラン、ロ紙など）などいずれも公知のものが使用される。また、これらの不溶性担体は微粒子にされ懸濁の状態で使用される場合もある。
【００１４】上記不溶性担体の形状としては、Ｂ／Ｆ分離が可能である形状であれば特に限定されない。不溶性担体の好ましい形状は、Ｂ／Ｆ効率が高いことより、球体（ビーズ、パーティクル）、試験管、チューブ、ウエルであり、さらに好ましくは、Ｂ／Ｆ効率が最も高いことより、ビーズである。
【００１５】抗体（Ａ）を認識する抗体を不溶性担体に結合させ、不溶化抗体（Ｃ）とする方法としては、抗体をガラスに化学的に結合させる方法（例えば、米国特許第４２８０９９２号明細書及び同第３６５２７６１号明細書）や、抗体をプラスチックに物理吸着させる方法（例えば、イ−・エングバル等；バイオシム・バイオフィズ・アクタ、２５１巻、４２７貢、１９７１年）などがある。さらに、抗体にビオチンを結合させ担体にはストレプトアビジンを結合させることにより、抗体を不溶化させる方法など、間接的に抗体を不溶化抗体にさせる方法がある。
【００１６】標識化ハプテン（Ｄ）は、ハプテンを標識物に結合させたものである。この標識物としては、アイソト−プ［Ｉ１２５など］、酵素［ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼなど］、蛍光物質［ユーロピウム誘導体など］、発光物質［アクリジウム誘導体など］等いずれも公知のものが使用される。
【００１７】ハプテンを標識物に結合させ、標識化ハプテン（Ｄ）とする方法としては、ハプテンを標識物に結合させる方法（例えば、生化学実験法１５、東京化学同人、ｐ．３０８〜３３０、１９９３年）がある。さらに、ハプテンにストレプトアビジンを結合させ標識物にビオチンを結合させることによりハプテンを標識物に結合させる方法など、間接的にハプテンを標識物に結合させる方法がある。
【００１８】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】免疫反応用緩衝液の調製；０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、牛血清アルブミンを３ｇ／Ｌおよび塩化ナトリウムを８．５ｇ／Ｌの濃度になるように添加し、免疫反応用緩衝液（ａ）を調製した。緩衝液（ａ）中に８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウムを０．１ｇ／Ｌ含有させたものを（ｂ）、緩衝液（ａ）中に８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸アンモニウムを０．２ｇ／Ｌ含有させたものを（ｃ）、緩衝液（ａ）中にサリチル酸ナトリウムを５ｇ／Ｌ含有させたものを（ｄ）、緩衝液（ａ）中にサリチル酸ナトリウムを１０ｇ／Ｌ含有させたものを（ｅ）とした。
【００２０】比較例１および２Ｔ3免疫学的測定法（一抗体競合法＆二段階反応）
全自動酵素免疫分析装置ＯＬＹＤＡＳ−１２０（オリンパス光学工業株式会社製）を用い、第一反応として、（ｂ）または（ｄ）の０．３ｍＬと、標準Ｔ3液または同時再現性用検体の０．０２ｍＬと、抗Ｔ3モノクローナル抗体（ヒツジ）結合ポリスチレンビーズ（以下Ｇ１とする）１個とを反応管中で３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｔ3＋Ｇ１複合体を形成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させ、Ｂ／Ｆ分離を行った。
【００２１】第二反応として、反応管中のＴ3＋Ｇ１複合体１個に、ペルオキシダーゼ標識Ｔ3（以下Ｐ１とする）を２００μｇ／Ｌ含有する（ａ）を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｔ3＋Ｇ１＋Ｐ１複合体を形成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させ、Ｂ／Ｆ分離を行った。
【００２２】第三反応として、反応管中のＴ3＋Ｇ１＋Ｐ１複合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよびテトラメチルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸緩衝液を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５．５分間発色反応させ、反応後、０．７ｍＬの脱イオン水を混合させ、３８０ｎｍで測光させた。
【００２３】最後に、各標準Ｔ3液の濃度値と測光値を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回帰させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対する濃度値を算出させた。
【００２４】実施例１および２Ｔ3免疫学的測定法（二抗体競合法＆二段階反応）
全自動酵素免疫分析装置ＯＬＹＤＡＳ−１２０（オリンパス光学工業株式会社製）を用い、第一反応として、抗Ｔ3モノクローナル抗体（ヒツジ）（以下Ｍ１とする）を２０μｇ／Ｌの濃度でそれぞれ含有する（ｂ）または（ｄ）の０．３ｍＬと、標準Ｔ3液または同時再現性用検体の０．０２ｍＬと、抗ヒツジＩｇポリクローナル抗体（ウサギ）結合ポリスチレンビーズ（以下Ｇ２とする）１個とを反応管中で３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｔ3＋Ｍ１＋Ｇ２複合体を形成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を行った。
【００２５】第二反応として、反応管中のＴ3＋Ｍ１＋Ｇ２複合体１個に、Ｐ１を４００μｇ／Ｌ含有する（ａ）を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｔ3＋Ｍ１＋Ｇ２＋Ｐ１複合体を形成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を行った。
【００２６】第三反応として、反応管中のＴ3＋Ｍ１＋Ｇ２＋Ｐ１複合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよびテトラメチルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸緩衝液を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５．５分間発色反応させ、反応後、０．７ｍＬの脱イオン水を混合させ、３８０ｎｍで測光させた。
【００２７】最後に、各標準Ｔ3液の濃度値と測光値を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回帰させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対する濃度値を算出させた。
【００２８】比較例３および４Ｔ3免疫学的測定法（一抗体競合法、一段階反応）
全自動酵素免疫分析装置ＯＬＹＤＡＳ−１２０（オリンパス光学工業株式会社製）を用い、第一反応として、Ｐ１を２００μｇ／Ｌの濃度でそれぞれ含有する（ｂ）または（ｄ）の０．３ｍＬと、標準Ｔ3液または同時再現性用検体の０．０２ｍＬと、Ｇ１の１個とを反応管中で３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｔ3＋Ｇ１＋Ｐ１複合体を形成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を行った。
【００２９】第二反応として、反応管中のＴ3＋Ｇ１＋Ｐ１複合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよびテトラメチルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸緩衝液を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５．５分間発色反応させ、反応後、０．７ｍＬの脱イオン水を混合させ、３８０ｎｍで測光させた。
【００３０】最後に、各標準Ｔ3液の濃度値と測光値を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回帰させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対する濃度値を算出させた。
【００３１】実施例３および４Ｔ3免疫学的測定法（二抗体競合法、一段階反応）
全自動酵素免疫分析装置ＯＬＹＤＡＳ−１２０（オリンパス光学工業株式会社製）を用い、第一反応として、Ｐ１を５００μｇ／Ｌの濃度でそれぞれ含有する（ｂ）または（ｄ）の０．１５ｍＬと、Ｍ１を４０μｇ／Ｌの濃度でそれぞれ含有する（ｂ）または（ｄ）の０．１５ｍＬと、標準Ｔ3液または同時再現性用検体の０．０２ｍＬと、Ｇ２の１個とを反応管中で３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｔ3＋Ｍ１＋Ｇ２＋Ｐ１複合体を形成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を行った。
【００３２】第二反応として、反応管中のＴ3＋Ｍ１＋Ｇ２＋Ｐ１複合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよびテトラメチルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸緩衝液を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５．５分間発色反応させ、反応後、０．７ｍＬの脱イオン水を混合させ、３８０ｎｍで測光させた。
【００３３】最後に、各標準Ｔ3液の濃度値と測光値を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回帰させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対する濃度値を算出させた。
【００３４】比較例５および６Ｔ4免疫学的測定法（一抗体競合法、二段階反応）
全自動酵素免疫分析装置ＯＬＹＤＡＳ−１２０（オリンパス光学工業株式会社製）を用い、第一反応として、（ｃ）または（ｅ）の０．３ｍＬと、標準Ｔ4液または同時再現性用検体の０．０２ｍＬと、抗Ｔ4モノクローナル抗体（マウス）結合ポリスチレンビーズ（以下Ｇ３とする）１個とを反応管中で３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｔ4＋Ｇ３複合体を形成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を行った。
【００３５】第二反応として、反応管中のＴ4＋Ｇ３複合体１個に、ペルオキシダーゼ標識Ｔ4（以下Ｐ２とする）を３００μｇ／Ｌ含有する（ａ）を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｔ4＋Ｇ３＋Ｐ２複合体を形成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を行った。
【００３６】第三反応として、反応管中のＴ4＋Ｇ３＋Ｐ２複合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよびテトラメチルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸緩衝液を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５．５分間発色反応させ、反応後、０．７ｍＬの脱イオン水を混合させ、３８０ｎｍで測光させた。
【００３７】最後に、各標準Ｔ4液の濃度値と測光値を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回帰させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対する濃度値を算出させた。
【００３８】実施例５および６Ｔ4免疫学的測定法（二抗体競合法、二段階反応）
全自動酵素免疫分析装置ＯＬＹＤＡＳ−１２０（オリンパス光学工業株式会社製）を用い、第一反応として、抗Ｔ4モノクローナル抗体（以下Ｍ２とする）を３００μｇ／Ｌの濃度でそれぞれ含有する（ｃ）または（ｅ）の０．３ｍＬと、標準Ｔ4液または同時再現性用検体の０．０２ｍＬと、抗マウスＩｇポリクローナル抗体（ヤギ）結合ポリスチレンビーズ（以下Ｇ４とする）１個とを反応管中で３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｔ4＋Ｍ２＋Ｇ４複合体を形成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を行った。
【００３９】第二反応として、反応管中のＴ4＋Ｍ２＋Ｇ４複合体１個に、Ｐ２を６００μｇ／Ｌ含有する（ａ）を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｔ4＋Ｍ２＋Ｇ４＋Ｐ２複合体を形成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を行った。
【００４０】第三反応として、反応管中のＴ4＋Ｍ２＋Ｇ４＋Ｐ２複合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよびテトラメチルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸緩衝液を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５．５分間発色反応させ、反応後、０．７ｍＬの脱イオン水を混合させ、３８０ｎｍで測光させた。
【００４１】最後に、各標準Ｔ4液の濃度値と測光値を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回帰させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対する濃度値を算出させた。
【００４２】比較例７および８Ｔ4免疫学的測定法（一抗体競合法、一段階反応）
全自動酵素免疫分析装置ＯＬＹＤＡＳ−１２０（オリンパス光学工業株式会社製）を用い、第一反応として、Ｐ２を３００μｇ／Ｌの濃度でそれぞれ含有する（ｃ）または（ｅ）の０．３ｍＬと、標準Ｔ4液または同時再現性用検体の０．０２ｍＬと、Ｇ３の１個とを反応管中で３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｔ4＋Ｇ３＋Ｐ２複合体を形成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を行った。
【００４３】第二反応として、反応管中のＴ4＋Ｇ３＋Ｐ２複合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよびテトラメチルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸緩衝液を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５．５分間発色反応させ、反応後、０．７ｍＬの脱イオン水を混合させ、３８０ｎｍで測光させた。
【００４４】最後に、各標準Ｔ4液の濃度値と測光値を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回帰させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対する濃度値を算出させた。
【００４５】実施例７および８Ｔ4免疫学的測定法（二抗体競合法、一段階反応）
全自動酵素免疫分析装置ＯＬＹＤＡＳ−１２０（オリンパス光学工業株式会社製）を用い、第一反応として、Ｐ２を８００μｇ／Ｌの濃度でそれぞれ含有する（ｃ）または（ｅ）の０．１５ｍＬと、Ｍ２を６００μｇ／Ｌの濃度でそれぞれ含有する（ｃ）または（ｅ）の０．１５ｍＬと、標準Ｔ4液または同時再現性用検体の０．０２ｍＬと、Ｇ４の１個とを反応管中で３７℃，１５分間免疫反応させ、Ｔ4＋Ｍ２＋Ｇ４＋Ｐ２複合体を形成させた。反応後、装置専用のＢ／Ｆ分離液にて洗浄させＢ／Ｆ分離を行った。
【００４６】第二反応として、反応管中のＴ4＋Ｍ２＋Ｇ４＋Ｐ２複合体１個に、過酸化水素を０．１ｇ／Ｌおよびテトラメチルベンジジンを０．１７ｇ／Ｌ含有する酢酸緩衝液を０．３ｍＬ分注させ、反応管中で３７℃，１５．５分間発色反応させ、反応後、０．７ｍＬの脱イオン水を混合させ、３８０ｎｍで測光させた。
【００４７】最後に、各標準Ｔ4液の濃度値と測光値を２次式の逆数（１／（Ａｘ2＋Ｂｘ＋Ｃ））で自動回帰させ、その検量線から、同時再現性用検体の測光値に対する濃度値を算出させた。
【００４８】■比較例１〜４および実施例１〜４のＴ3免疫学的測定法の同時再現性：低濃度のハプテンでも精度良く測定することができるハプテンの免疫学的測定法であることを確かめるため、比較例１〜４および実施例１〜４のＴ3免疫学的測定法で、低濃度（１ｎｇ／ｍＬ）および高濃度（４ｎｇ／ｍＬ）の同時再現性用検体をそれぞれｎ＝４０で測定し、同時再現性［測定値の標準偏差値／平均値×１００（％）］を求めた。１ｎｇ／ｍＬの検体の同時再現性の結果を表１に示し、４ｎｇ／ｍＬの検体の同時再現性の結果を表２に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
【表２】
【００５１】■比較例５〜８および実施例５〜８のＴ4免疫学的測定法の同時再現性：さらに、比較例５〜８および実施例５〜８のＴ4免疫学的測定法で、低濃度（３μｇ／ｄＬ）および高濃度（１２μｇ／ｄＬ）の同時再現性用検体をそれぞれｎ＝４０で測定し同時再現性［測定値の標準偏差値／平均値×１００（％）］を求めた。３μｇ／ｄＬの検体の同時再現性の結果を表３に示し、１２μｇ／ｄＬの検体の同時再現性の結果を表４に示す。
【００５２】
【表３】
【００５３】
【表４】
【００５４】
【発明の効果】従来は、低濃度のハプテンを精度良く測定することができなかったが、本発明によって、低濃度のハプテンおよび高濃度のハプテンが極めて精度良く測定することができるようになる。さらに、本発明によって液体中のハプテン濃度が正確に得られ、血中のハプテン濃度が臨床診断に利用される場合には、従来よりも極めて正確な診断が可能となり、さらには極めて正確な治療も可能となる。
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| 【出願人】 |
【識別番号】０００００２２８８
【氏名又は名称】三洋化成工業株式会社
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| 【出願日】 |
平成１０年（１９９８）３月４日 |
| 【代理人】 |
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| 【公開番号】 |
特開平１１−２４８７０２ |
| 【公開日】 |
平成１１年（１９９９）９月１７日 |
| 【出願番号】 |
特願平１０−７１２９１ |
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