| 【発明の名称】 |
バイオセンサ及び該センサによる水中の金属又は農薬の定量分析方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】清水 宣明
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| 【要約】 |
【課題】水環境汚染の計測するための水質分析、特に微量成分の水質分析を短時間に行うことができるバイオセンサ及びそれによる定量分析方法を提供する。
【解決手段】参照電極、対電極及び作用電極を備えるバイオセンサにおいて、作用電極は、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼの混合溶液の供給管及び該混合溶液の排出管が装着され、先端部が封鎖されている半透膜製の筒体内に、電極部材の少なくとも先端部が配置されて形成されているバイオセンサを提供する。このバイオセンサを、アセチルコリンが混合されている、農薬又は金属を含む試料水溶液に浸漬し、該作用電極の半透膜を浸透するアセチルコリンを、該半透膜を浸透した金属又は農薬の存在下に、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼで分解して、ベタイン及び過酸化水素を生成させ、この生成した過酸化水素濃度を電気化学的に測定し、検量線により、試料溶液中の金属又は農薬の量を測定することができる。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 参照電極、対電極及び作用電極を備えるバイオセンサにおいて、作用電極は、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼの混合溶液の供給管及び該混合溶液の排出管が装着され、先端部が封鎖されている半透膜製の筒体内に、電極部材の少なくとも先端部が配置されて形成されていることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】 アセチルコリンエステラーゼがウマ血清由来のアセチルコリンエステラーゼであることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】 アセチルコリンが混合されている、農薬又は金属を含む試料水溶液に、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼの混合溶液が充填されている半透膜製の筒体内に、電極部材の少なくとも先端部が前記混合溶液内に挿入されて形成されている作用電極を浸漬すると共に、対極及び参照電極を浸漬し、該作用電極の半透膜を浸透するアセチルコリンを、該半透膜を浸透した金属又は農薬の存在下に、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼで分解して、ベタイン及び過酸化水素を生成させ、この生成した過酸化水素濃度を電気化学的に測定し、一方アセチルコリン標準溶液に、前記作用電極、対極及び参照電極を浸漬し、該作用電極の半透膜を浸透するアセチルコリンを、金属又は農薬の非存在下に、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼで分解して、ベタイン及び過酸化水素を生成させ、この生成した過酸化水素濃度を電気化学的に測定して、この測定された過酸化水素濃度を、前記金属又は農薬の存在下に生成した過酸化水素の濃度と比較して、試料溶液中の金属又は農薬の量を測定することを特徴とする水中の金属又は農薬の定量分析方法。
【請求項４】 アセチルコリンエステラーゼがウマ血清由来のアセチルコリンエステラーゼであることを特徴とする請求項１に記載の水中の金属又は農薬の定量分析方法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼが充填されている半透膜製の筒体内電極部材を装着して形成されている作用電極、対電極及び参照電極を備えるバイオセンサ及び該バイオセンサを使用する水中の金属又は農薬の定量分析方法に関し、特に廃液中の微量の金属又は農薬を検出するのに適するバイオセンサ及び廃液中の金属又は農薬の定量分析方法に関する。また、本発明は、医療分析、環境計測、食品分析、バイオプロセス計測などの広い分野に使用可能な金属又は農薬分析用のバイオセンサ及び該バイオセンサを使用する定量分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、産業活動の進展、都市周辺への人口集中等により産業排水や生活排水の流入に伴う水源の水質汚濁は著しく進行しており、水質分析が機器分析等により行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、従来の機器分析による水質分析では、迅速性あるいは機能性を欠き十分な対応ができないのが現状である。そこで、本発明は、水環境汚染を計測する水質分析における従来法の問題点を解決することを目的としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、水環境汚染の計測するための水質分析、特に微量成分の水質分析を短時間に行うことができるバイオセンサ及びそれによる定量分析方法を提供することを目的としている。本発明者は、水質汚染の成分中、例えば、微量の金属又は農薬が、アセチルコリンのアセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼによる分解反応を、阻害し抑制するように作用する物質であることを発見して、本発明に至った【０００５】即ち、本発明は、参照電極、対電極及び作用電極を備えるバイオセンサにおいて、作用電極は、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼの混合溶液の供給管及び該混合溶液の排出管が装着され、先端部が封鎖されている半透膜製の筒体内に、電極部材の少なくとも先端部が配置されて形成されていることを特徴とするバイオセンサにあり、また、本発明は、アセチルコリンが混合されている、農薬又は金属を含む試料水溶液に、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼの混合溶液が充填されている半透膜製の筒体内に、電極部材の少なくとも先端部が前記混合溶液内に挿入されて形成されている作用電極を浸漬すると共に、対極及び参照電極を浸漬し、該作用電極の半透膜を浸透するアセチルコリンを、該半透膜を浸透した金属又は農薬の存在下に、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼで分解して、ベタイン及び過酸化水素を生成させ、この生成した過酸化水素濃度を電気化学的に測定し、一方アセチルコリン標準溶液に、前記作用電極、対極及び参照電極を浸漬し、該作用電極の半透膜を浸透するアセチルコリンを、金属又は農薬の非存在下に、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼで分解して、ベタイン及び過酸化水素を生成させ、この生成した過酸化水素濃度を電気化学的に測定して、この測定された過酸化水素濃度を、前記金属又は農薬の存在下に生成した過酸化水素の濃度と比較して、試料溶液中の金属又は農薬の量を測定することを特徴とする水中の金属又は農薬の定量分析方法にある。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明において、ダイアリシスバイオセンサである作用電極は、その少なくとも一部は半透膜製の筒部に形成されており、少なくとも該半透膜製の筒部内には、コリンオキシダーゼ及びアセチルコリンエステラーゼの、例えば、ｐＨ８．０のトリス・塩酸緩衝液の混合溶液が充填される。前記混合溶液において、コリンオキシダーゼは、アセチルコリンエステラーゼに対して、０．１乃至１０倍量、好ましくは、０．５乃至５倍量の割合で使用することができる。
【０００７】作用電極内に入れられる前記混合溶液に使用されるアセチルコリンエステラーゼは、例えば、シビレエイアセチルコリンエステラーゼ、電気ウナギ発電器官由来のアセチルコリンエステラーゼ、ウマ血清由来のアセチルコリンエステラーゼ等の従来から使用されているアセチルコリンエステラーゼを使用することができるが、ウマ血清由来のアセチルコリンエステラーゼを使用すると、０．１ｐｐｍまで測定可能となるので好ましい。
【０００８】本発明において、ダイアリシスバイオセンサである作用電極には、一本のプラチナ電極が、電極部材として、半透膜製の筒部内に封入される。このように一本の電極部材を半透膜製の筒部内に設けるようにすると、作用電極センサの半透膜製の筒部の径を細くすることが可能となる。このようにセンサの半透膜部位を細くすると、センサの応答が速くなり、より高性能なセンサとすることができる。
【０００９】本発明において、金属は、例えば、亜鉛イオン、コバルトイオン、銅イオン及び鉛イオン等であり、例えば、硫酸塩等の亜鉛、コバルト、銅及び鉛化合物である。本発明において、農薬は、例えば、次の表１に示すことができる。
【００１０】本発明は、作用電極は、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼの混合溶液の供給管及び該混合溶液の排出管が装着され、先端部が封鎖されている半透膜製の筒体内に、電極部材の少なくとも先端部が配置されて形成されるので、測定時、測定セル中に、参照電極及び対電極を取り付けられるが、作用電極の電極部材は、単独で半透膜製の筒部内に納められている。
【００１１】したがって、従来のこの種のバイオセンサでは、３電極方式であり、センサとなる半透膜製の部分に３本の電極をまとめて封入されているのに比して、本発明では、半透膜製の筒部内に封入される電極部材が、白金電極１本であるために、作用電極の半透膜製の筒部の径を細くすることが可能となり、このように作用電極の半透膜部位を細くすると、作用電極の応答が速くなり、より高性能な作用電極とすることができる。
【００１２】また、本発明は、アセチルコリンが混合されている、農薬又は金属を含む試料水溶液に、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼの混合溶液が充填されている半透膜製の筒体内に、電極部材の少なくとも先端部が前記混合溶液内に挿入されて形成されている作用電極を浸漬すると共に、対極及び参照電極を浸漬し、該作用電極の半透膜を浸透するアセチルコリンを、該半透膜を浸透した金属又は農薬の存在下に、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼで分解して、ベタインアルデヒド及び過酸化水素を生成させ、この生成した過酸化水素濃度を電気化学的に測定し、一方アセチルコリン標準溶液に、前記作用電極、対極及び参照電極を浸漬し、該作用電極の半透膜を浸透するアセチルコリンを、金属又は農薬の非存在下に、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼで分解して、ベタインアルデヒドと及び過酸化水素を生成させ、この生成した過酸化水素濃度を電気化学的に測定して、この測定された過酸化水素濃度を、前記金属又は農薬の存在下に生成した過酸化水素の濃度と比較して、試料溶液中の金属又は農薬の量を測定するので、比較的精度が高く、しかも、農薬等は、アセチルコリンの分解反応の抑制特性は、比較的類似しているので、抑制特性に応じて検量線を作成すれば足りるので、比較的短時間に分析結果を知ることができる。
【００１３】本発明のバイオセンサは、４０℃以下の室温において使用することができる。本発明のバイオセンサは、コリンエステラーゼ活性を指標としており、従来のようにモノクローナル抗体を作成する必要がなく、種々の農薬の検出が可能である。
【００１４】
【実施例】以下、本発明の実施の態様の例を説明するが、本発明は、以下の説明及び例示によって何等制限されるものではない。図１は、本発明のバイオセンサの一実施例における作用電極について、その概略の構造を示す概略の側断面図である。図２は、本発明の一実施例において、図１に示す作用電極を使用する事例を示す模式図である。図３は、電気ウナギ発電器官由来のアセチルコリンエステラーゼを使用したときの、農薬によるアセチルコリンの分解抑制率を測定した結果を示す図である。図４は、ウマ血清由来のアセチルコリンエステラーゼを使用したときと、電気ウナギ発電器官由来のアセチルコリンエステラーゼを使用したときの、農薬によるアセチルコリンの分解抑制率を測定した結果を対比して示す比較図である。図１及び図２において、同一の箇所及び物については同一の符号が使用されている。
【００１５】バイオセンサに使用する作用電極１の概略を図１に示す。図１において、作用電極１は、上部が生化学的に不活性なプラスチック製のプラスチック筒体２で形成され、該プラスチック筒体２の下端に、直径２２０μｍで先端がエポキシ接着剤で封鎖されている生化学的に不活性な半透膜製の筒体３が、同様の接着剤で密封固定されている。本例において、半透膜製の筒体３は、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼが流出しないで、アセチルコリン及び金属が透過可能なように、分子量５０００以下の分子のみが透過可能に形成されている。前記プラスチック筒体２及び半透膜製の筒体３内には、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼが、１対１の混合比で、ｐＨ８の５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８）に、１００Ｕ／ｍｌの濃度で溶解された混合溶液が入れられている。この混合溶液は、半透膜を透過して浸透するアセチルコリンを十分に分解できるように、供給排出される。該混合溶液の供給排出を行うために、本例においては、混合溶液の供給管４及び排出管５がプラスチック筒体２の頂部の融着部６に設けられている。本例において、作用電極１の電極部材である白金電極７は、プラスチック筒体２の上部から半透膜製の筒体３の底部にまで伸びて設けられている。
【００１６】図１に示す作用電極１は、測定時に白金電極の対極８及び参照電極（銀／塩化銀）９と共に、撹拌機１０及び加熱器１１を備える測定セル１２内の試料排水１３中に浸漬される。作用電極１、対極８及び参照電極９は、接続ライン１４、１５及び１６を介してポテンショスタット１７に接続している。本例において、ポテンショスタット１７から作用電極１へ加える電圧は、参照電極（Ａｇ／Ａｇｃｌ）８に対して５５０ｍｖである。測定時に作用電極１の白金電極７に流れる電流は、ポテンショスタット１７に送られて測定され、ポテンショスタット１７に接続するコンピュータ１８に送られて、電流値に対応する農薬濃度がディスプレイ１９に表示される。
【００１７】本例は以上のように構成されているので、白金電極部材６は、直径２２０μｍの半透膜製の筒体（ＭＷ Ｃｕｔ−ｏｆｆ５００）３の中に封入することにより、作用電極１に取付けられた。アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）およびコリンオキシダーゼ（ＣｈＯｘ）を５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）中に１００Ｕ（ユニット）／ｍｌの濃度で溶解し、これを透析膜チューブ内に充填した。分子量の大きい酵素は膜外へ流出しないが、アセチルコリン（ＡＣｈ）、金属及び農薬などの低分子量の酵素阻害物質は容易に膜を通過し、作用電極１の半透膜製の筒体３内に拡散する。該半透膜製の筒体３内に拡散したアセチルコリン（ＡＣｈ）は、該半透膜製の筒体３内のアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の作用により、コリン（Ｃｈ）と酢酸に分解され、ここで生成したコリン（Ｃｈ）は、さらにコリンオキシダーゼ（ＣｈＯｘ）の作用によりベタイン及び過酸化水素を生成する。ここで生成した過酸化水素濃度は、アセチルコリン（ＡＣｈ）濃度に依存するので、前記生成した過酸化水素濃度を電気化学検出法により酸化電流値として検出すれば、間接的にアセチルコリン（ＡＣｈ）濃度を測定することができる。一方、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）又はコリンオキシダーゼ（ＣｈＯｘ）の活性を抑制する化学物質は、アセチルコリン（ＡＣｈ）の反応を抑制する。
【００１８】ここで、一定濃度（５０μＭ）のアセチルコリン（ＡＣｈ）の反応に対する各種農薬、金属などの抑制効果から各種農薬及び金属の濃度を測定することができることがわかった。なお抑制率は次式で定義する。
この式中で、Ｉ０は、対照（水環境汚染物質が存在しない場合）の酸化電流値を示し、Ｉは、水環境汚染物質による酵素活性抑制時の酸化電流値を示す。Ｉ０の値は実験を実施する日の条件により多少異なるので１日１回実験の初めに測定した値を採用する。重金属、農薬はマイクロシリンジ（注射器）で計量し緩衝液に注入する。
【００１９】実験方法酵素溶液を充填した作用電極１、対極８及び参照電極９を測定セル１２の試料排水中に浸漬し、出力電流が安定したことを確認して、アセチルコリン濃度が５０μＭとなるように、アセチルコリンを試料排水中に添加して、アセチルコリンに対する酸化電流値を測定した。
【００２０】結果と考察本例におけるバイオセンサのアセチルコリン応答性を検討した結果、アセチルコリン濃度が１０−６Ｍから１０−３Ｍの間で出力電流値との間に有意な直線関係を認め、安定性を含めて十分実用に耐えるものであった。農薬の酵素活性に対する抑制効果を次の表２及び図３に示す。ここでは電気ウナギ発電器官由来のアセチルコリンエステラーゼを用いた。抑制率５０％時の濃度をＩＣ５０と定義し比較すると、本例における４種類の農薬の中では、殺菌剤のイプコナゾール（Ｉｐｃｏｎａｚｏｌｅ）（図３の符号２０）の毒性が一番強く、次にカルバメート系殺虫剤ＰＨＣ（図３の符号２１）の毒性が強かった。除草剤のアシュラム（Ａｓｕｌａｍ）（図３の符号２２）及び有機リン系殺虫剤のＤＤＶＰ（図３の符号２３）についてもＩｐｐｍから１００ｐｐｍの濃度範囲において濃度依存的にアセチルコリンの反応を抑制した。
【００２１】
【００２２】次の表３及び図４において、ウマ血清由来アセチルコリンエステラーゼを用いた場合（図４の符号２４）と電気ウナギ発電器官由来のアセチルコリンエステラーゼを用いた場合（図４の符号２５）、ＤＤＶＰによる活性抑制の比較を示す。図４における１０ｐｐｍにおける抑制率は、ウマ血清由来アセチルコリンエステラーゼが約９５％で、電気ウナギ発電器官由来アセチルコリンエステラーゼが約８％であり、ウマ血清由来アセチルコリンエステラーゼの方が阻害剤による抑制を強く受けているといえる。これによりウマ血清由来アセチルコリンエステラーゼを用いた場合、より低濃度で感度の良い測定を行うことができると考えられる。
【００２３】表３ ウマ血清由来ＣｈＥと電気ウナギ発電器官由来ＣｈＥを用いたＤＤＶＰによる活性抑制
【００２４】図３より、ＤＤＶＰとアシュラム、イプコナゾールとＰＨＣが、それぞれ似た様な傾向を示している。農薬の安全性評価にはいくつかの方法があるが、上記の様に魚毒性で言うと例えばＤＤＶＰとアシュラムが、鯉を使用して、４８時間後でも５０％が耐える薬剤濃度（ＴＬｍ）４８＞１０ｐｐｍ（Ａ類）に属し、イプコナゾールとＰＨＣが１０ｐｐｍ＞ＴＬｍ４８＞０．５ｐｐｍ（Ｂ類）に属していると解される。このように、実際に使用される農薬について実験をして、似た傾向の農薬毎に検量線等を作成しておけば、似た傾向の農薬について、予め作成した検量線を使用して定量分析を行うことができ、検量線を、農薬毎に作成しなくて定量分析を行うことができる。
【００２５】
【発明の効果】本発明においては、参照電極、対電極及び作用電極を備えるバイオセンサにおいて、作用電極は、アセチルコリンエステラーゼ及びコリンオキシダーゼの混合溶液の供給管及び該混合溶液の排出管が装着され、先端部が封鎖されている半透膜製の筒体内に、電極部材の少なくとも先端部が配置されて形成されているので、バイオセンサにより農薬等の水環境汚染物質の検出が可能であり、従来の分析方法に比して、短時間で、微量の金属及び／又は農薬の正確な定量分析が可能である。
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| 【出願人】 |
【識別番号】５９２１４１０５３
【氏名又は名称】明和工業株式会社
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| 【出願日】 |
平成１０年（１９９８）２月２７日 |
| 【代理人】 |
【弁理士】
【氏名又は名称】武田 正彦 （外２名）
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| 【公開番号】 |
特開平１１−２４８６６８ |
| 【公開日】 |
平成１１年（１９９９）９月１７日 |
| 【出願番号】 |
特願平１０−８９１７７ |
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