| 【発明の名称】 |
コレステロール硫酸含有外用剤 |
| 【発明者】 |
【氏名】佐藤 純子
【氏名】傅田 光洋
【氏名】小山 純一
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| 【要約】 |
【課題】皮膚におけるデスモソームの異常分解を調整するための外用剤の提供。
【解決手段】コレステロール硫酸を有効成分として含んでなる皮膚外用剤。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 有効成分としてコレステロール硫酸を含んでなる皮膚外用剤。
【請求項２】 有効成分としてコレステロール硫酸を含んでなる、デスモソームの分解を抑制するための皮膚外用剤。
【請求項３】 有効成分としてコレステロール硫酸を含んでなる、皮膚におけるデスモソームの分解と抑制との正常なバランスを保つための皮膚外用剤。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、皮膚科用製剤、特に皮膚外用剤に関する。
【０００２】
【発明の背景】従来より、ある一定の皮膚疾患の処置やみずみずしい肌を維持するために、各種の保湿剤や、コレステロールを始めとする脂質の使用が試みられてきた（例えば、コレステロールの使用については、G．Lykkesffldt ら、Lancet，１９８３，１３３７−１３３８参照）。
【０００３】ここで、コレステロールに関連した知見を概観してみると、ステロイドサルファターゼの欠損によって惹起される魚鱗癬では、コレステロール硫酸の蓄積に伴なって角質増殖症が保持されることが知られている。また、コレステロール硫酸の局所塗布は紅斑を伴うことなく、目視できる程度の落せつをもたらすことも報告されている（M．E．Maloney ら、J．Invest．Dermatol.，８３（１９８４），２５２−２５６）。
【０００４】しかしながら、強い接着性を有する蹄では、特にコレステロール硫酸が豊富に存在する（P．M．Elias ら、J．Clin．Invest．７４（１９８４）、１４１４−１４２１）のに対し、緊密に接着した角質層（手掌）と緩く接着した角質層（上腕）の間には、有意差がない（S．Serizawa ら、J．Invest．Dermatol.，９９（１９９２），２３２−２３６）と報告されている。いずれにしても、コレステロール硫酸と蓄積された角質層との関係は、必ずしも明確になっているものでない。
【０００５】他方、皮膚におけるデスモソームが角質細胞の接着に重要な役割を有しており、２種のセリンプロテアーゼ（トリプシン様酵素とキモトリプシン様酵素）によるデスモソームの分解が角質層の落屑をもたらすことが確認されている（例えば、Y．Suzuki ら、British J．Dermatol.，１３４（１９９６），４６０−４６４）。このような知見に基づき、本発明者の関係者は、上記２種のセリンプロテアーゼ活性を促進させることにより、角質層の形成とその生理的な剥離を調和させる手段を提案した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ところで、上記セリンプロテアーゼの活性が異常に高い場合には、逆にそれらの活性の抑制が皮膚の恒常性を保持する上で必要な場合も存在するであろう。
【０００７】
【課題を解決するための手段】このような抑制作用を有する物質について検討してきた結果、精子の受精能獲得の実験において、それらのセリンプロテアーゼを阻害することも報告されているコレステロール硫酸が、デスモソームの酵素活性を抑制することを見い出した。
【０００８】こうして、コレステロール硫酸は、例えば、デスモソームの過剰分解が生じている場合、その分解活性を抑制することに有意に使用できることを見い出した。したがってここに、上記課題を解決するために、有効成分としてコレステロール硫酸を含んでなる皮膚外用剤を提供し、そして有効成分としてコレステロール硫酸を含んでなるデスモソームの分解を抑制するための皮膚外用剤を提供する。また、別の態様の発明として、有効成分としてコレステロール硫酸を含んでなる、皮膚におけるデスモソームの分解と抑制との正常なバランスを保つための皮膚外用剤を提供する。
【０００９】さらなる別の態様の発明として、有効成分としてコレステロール硫酸を含んでなる、皮膚における積極的な落屑をもたらし、角質層の更新を促進するための皮膚外用剤を提供する。
【００１０】本発明で使用するコレステロール硫酸（すなわち、コレステロール３−硫酸エステル）は、生体由来のものでも、また半合成および全合成によって得られたものであってもよい。これらは市販されており、当業者に容易に入手できるものを使用すればよい。
【００１１】コレステロール硫酸は化粧料または医療用外用剤として常用されている希釈剤または助剤と共に使用することができるが、これらの希釈剤等は、コレステロール硫酸の作用に悪影響を及ぼすものであってはならない。希釈剤または助剤の代表的なものとしては、アルコール、水、緩衝剤、キレート剤、尿素、界面活性剤等を挙げることができる。
【００１２】コレステロール硫酸は、剤形、具体的な使用目的に応じて、外用剤中への含有量を変動させることができるが、ローション、クリーム剤、等の場合には、総組成物重量当り、約０.００５〜２０重量％、好ましくは０.５〜５重量％含めることができる。また、それらの調製は、各種皮膚外用剤の調製法として周知の方法に従って実施することができる。
【００１３】こうして得られる本発明の外用剤は、例えば、有効成分としてのコレステロール硫酸がデスモソーム中のトリプシン様酵素およびキモトリプシン様酵素による両活性を拮抗阻害的に抑制するので、デスモソームの形成と分解を皮膚状態に応じてバランスさせることが可能である。
【００１４】
【実施例】以下、実施例により、本発明およびその作用効果をさらに具体的に説明する。
（局所塗布の影響）
実験コレステロール硫酸は Sigma 社から入手したものを使用し、ヘアレスマウス（ＨＲ−１）は、８週齢雄を一群３匹使用した。
【００１５】ヘアレスマウスの背部に、１日１回、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中１０ｍＭのコレステロール硫酸（以下、ＣＳ）溶液８０μＬを塗布した。３日後、角質層をテープストリッピングにより採集した。また生検もあわせて行った。
【００１６】＜組織学的観察＞生検試料を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。切片をヘマトキシリン−エオシン染色した。画像解析システムを備えた光学顕微鏡（オリンパス ＸＬ−１０）で表皮の厚さを測定した。
【００１７】生検試料は、カルノフスキーの固定液で固定し、還元１.０％四酸化オスミウムで処理し、樹脂に包埋した。超薄切片をクエン酸鉛と酢酸ウランで電子染色した後、電子顕微鏡（Ｈ７１００、日立製作所）で観察した。ブライド法により角質層を数えた。
【００１８】結果マウスへのＣＳの局所塗布による表皮および角質層の変化（１） ＣＳの塗布後３日目にマウスの背部全体に目に見えるスケールが発生した。
【００１９】（２） 表皮の厚さは、基剤であるＤＭＳＯ処理と、ＣＳ処理の間には差が認められなかった。
【００２０】（３） 電子顕微鏡下での角質層の層数は、ＤＭＳＯ処理に比べ、ＣＳ処理により約１.５倍に増えていた。
【００２１】（角質層のデスモソームの検出）
実験デスモソームのタンパク質を、テープストリッピングして採取した角質層から、０.１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ （ｐＨ９）、９Ｍ尿素、２％ＳＤＳおよび１％メルカプトエタノールを含有する緩衡液（角質層２ｍｇ当り緩衡液２００μＬ）で、１５時間３７℃で抽出した。抽出物を Laemmli のサンプル緩衡液（Laemmli ら、Nature ２２７（１９７０）６８０−６８５）と混合し、１０分間湯浴上で加熱した。遠心後、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分析した。電気泳動ゲルをＰＶＤＦ膜（Applied Biosystems）に移し、デスモグレインＩに対する抗体を用いたウェスタンブロット法によってデスモソームタンパク質を検出した。
結果ＣＳ処理マウスの角質層中のデスモグレインＩの含有量は、基剤ＤＭＳＯ処理より高くなっていた。この結果は、デスモソームの分解がＣＳの局所塗布により抑制されることを示す。具体的には、図１を参照されたい。
【００２２】（角質層シートからの細胞の分散）
実験角層シート１ｍｇを、カナマイシン６０μｇ含有洗浄剤混合液［８ｍＭのジメチルドデシルアミンオキサイド（ＤＭＤＡＯ）および２ｍＭドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）］１ｍｌ中で、３７℃、２４時間インキュベートした。それぞれ、ＣＳ（１ｍＭ、５ｍＭ）、ＤＭＳＯおよびプロテアーゼ阻害剤（０.２５ｍＭキモスタチンおよび０.２５ｍＭロイペプチン）を含めて行ったインキュベーション後、角層シートをボルテックスミキサーで２秒間撹拌した。洗浄剤混合液中に遊離してきた細胞の数を血球計で計測した。
【００２３】結果細胞の分散は、ＤＭＳＯを添加したときに比べ、ＣＳを１ｍＭで添加すると５１.９％に、５ｍＭで添加すると１９.６％に抑制され、濃度依存的に細胞の分散が抑制されることが判明した。なお、タンパク質阻害剤の添加では、細胞の分散は１.３％に抑えられた。
【００２４】（ＣＳのトリプシンおよびキモトリプシンに対する作用）
実験結晶ブタ膵臓トリプシン（和光）および結晶ウシ膵臓キモトリプシン（Sigma）を使用して、ＣＳの阻害挙動を調べた。なお、これらのプロテアーゼは、それぞれデスモソームのトリプシン様酵素およびキモトリプシン様酵素とアミノ酸配列の相同様が極めて高いことから選んだ［上述の Suzuki らの文献および Skyttら、Biochem. Biophys. Res. Comm., 211(1995)、586-589参照］。
【００２５】トリプシン活性およびキモトリプシン活性は、基質として、それぞれＢｏｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（３１０７−Ｖ）およびＳｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ（３１２０−Ｖ）（ペプチド研究所）を使用して測定した。アッセイは、すべて０.１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８.０）中、３７℃で行った。
【００２６】結果ＣＳは、トリプシン、キモトリプキンのどちらに対しても拮抗阻害を示し、阻害定数はトリプシンに対して５.５μＭ、キモトリプシンに対して２.１μＭであった。
【００２７】以上をまとめると、ＣＳは角質層中のプロテアーゼに対して阻害作用を示すことが予想され、in vivo ではデスモソームの分解を抑制し、角質層を厚くするとともにスケールを生じさせることが確認される。
【００２８】
（処方例）
組成 （重量％）
ステアリルアルコール ６.０ ステアリン酸 ２.０ 水添ラノリン ４.０ スクワラン ９.０ オクチルドデカノール １０.０ コレステロール硫酸 １.０ １,３−ブチレングリコール ６.０ ポリオキシエチレングリコール１５００ ４.０ ポリオキシエチレン(２５)セチルアルコール ３.０ モノステアリン酸グリセリン ２.０ 防腐剤 適量 酸化防止剤 適量 香料 適量 精製水 ５４.０調製精製水に保湿剤を加え７０℃に加熱調整する。油分を加熱溶解後、コレステロール硫酸、界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、香料を加え７０℃に調整する。これを先の水相に加えて、ホモミキサーにて乳化粒子を均一にして、脱気、濾過、冷却してクリームを得た。
【００２９】
【発明の効果】以上のＣＳの作用から理解されるように、ＣＳを有効成分として含めた皮膚外用剤は、過剰なデスモソームの分解がみられるとき使用すれば、それを正常な状態に復帰させることが予想され、デスモソームの分解と抑制との正常なバランスを保つのに利用できるであろう。
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| 【出願人】 |
【識別番号】０００００１９５９
【氏名又は名称】株式会社資生堂
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| 【出願日】 |
平成９年（１９９７）７月３０日 |
| 【代理人】 |
【弁理士】
【氏名又は名称】小田島 平吉 （外１名）
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| 【公開番号】 |
特開平１１−５７４２ |
| 【公開日】 |
平成１１年（１９９９）１月１２日 |
| 【出願番号】 |
特願平９−２１８２８８ |
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