| 【発明の名称】 |
８位ヒドロキシラーゼによるフェロモン及びその製造方法 |
| 【発明者】 |
【氏名】レアル バルター スアレス
|
| 【要約】 |
【課題】様々な情報伝達物質の生成等に利用できるフェロモンを生合成によって得る。
【解決手段】立体特異的８−ヒドロキシラーゼを介して、飽和脂肪酸を不飽和化して不飽和脂肪酸とした後に、短鎖又は閉環を行う。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 立体特異的８−ヒドロキシラーゼを介して、脂肪酸で形成することで得られた、立体特異的８−ヒドロキシラーゼによるフェロモン。
【請求項２】 フェロモンがコガネムシの性フェロモンであり、立体特異的８−ヒドロキシラーゼを介して、飽和脂肪酸を不飽和化して不飽和脂肪酸とした後に、短鎖又は閉環を行うことで得られるものである、請求項１に記載のフェロモン。
【請求項３】 立体特異的８−ヒドロキシラーゼを介して、脂肪酸で形成することで得られた、立体特異的８−ヒドロキシラーゼによるフェロモンの製造方法。
【請求項４】 フェロモンがコガネムシの性フェロモンであり、立体特異的８−ヒドロキシラーゼを介して、飽和脂肪酸を不飽和化して不飽和脂肪酸とした後に、短鎖又は閉環を行うことで得られるものである、請求項３に記載のフェロモンの製造方法。
|
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】
【０００２】本発明は、立体特異的８−ヒドロキシラーゼによるフェロモン及びその製造方法に関し、例えば、立体特異的８−ヒドロキシラーゼを介して脂肪酸で形成することで得られたコガネムシ性フェロモンは、様々な情報伝達物質の生成等に利用でき、並びに、香料の製造の際に利用できる。
【０００３】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
【０００４】例えば、いくつかのコガネムシ類の性フェロモンとして、（Ｒ,Ｚ)−５−(オクト−１−エニル)−オキサシクロペンタン−２−オン（ｂｕｉｂｕｉｌａｃｔｏｎｅ）と、（Ｒ,Ｚ)−５−(デセ−１−エニル)−オキサシクロペンタン−２−オン（Ｒ−ｊａｐｏｎｉｌｕｒｅ）および（Ｓ,Ｚ)−５−(デセ−１−エニル)−オキサシクロペンタン−２−オン（Ｓ−ｊａｐｏｎｉｌｕｒｅ）が知られている。
【０００５】一般に、昆虫のフェロモンの生合成および生合成制御に関しては、主として、鱗翅目（蛾類）を中心とする研究がなされている。
【０００６】他のグループの生合成等の経路については、あまり研究されておらず、イエバエや、ゴキブリや、グレーンビートルなどの経済的に極めて重要な種について研究されているにすぎず、コガネムシの生合成等の経路については、ほとんど研究されていない。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
【０００８】例えば、コガネムシの性フェロモンは、フェノールおよびアニソールからアミノ酸誘導体および薬効のあるアルカロイドまで様々であり、主として直鎖アルコール、アルデヒド、酢酸を使用する研究が進んでいる鱗翅目（蛾類）とは異なっている。
【０００９】コガネムシの性フェロモンの１つの典型的な構造は、（Ｒ,Ｚ)−５−(オクト−１−エニル)−オキサシクロペンタン−２−オン（ｂｕｉｂｕｉｌａｃｔｏｎｅ）や（Ｒ,Ｚ)−５−(デセ−１−エニル)−オキサシクロペンタン−２−オン（ｊａｐｏｎｉｌｕｒｅ）などの不飽和炭化水素長鎖を有するγ−ラクトンである。
【００１０】γ−ラクトンは、一般に植物芳香の成分として存在し、また、微生物および昆虫から分離されているが、通常、ラクトン環に隣接する二重結合の発生には関与しない。
【００１１】また、コガネムシフェロモンラクトンの立体化学機能は、異性体が、対向する動作機能を有するので、化学交信において重要な役割を果たしている。
【００１２】多くの昆虫種では、性フェロモンの生合成時に、蛾のフェロモン腺にしか見られないΔ11不飽和酵素など１つまたは２つの酵素のみが一般代謝経路に加えられている。
【００１３】本願発明者らは、重水素標識前駆体を使用して、コガネムシの単不飽和γ−ラクトンフェロモンが固有の立体特異的８位ヒドロキシラーゼを介して脂肪酸で形成されることを見い出した。
【００１４】すなわち、本願発明者らは、重水素化前駆体を使用して、（９,１０−ｄ4)−パルミチン酸、（９,１０−ｄ4)−ステアリン酸、（９,１０−ｄ2)−パルミトレイン酸、（９,１０−ｄ2）オレイン酸、８−ヒドロキシパルミトレイン酸、８−ヒドロキシオレイン酸は、容易にフェロモン分子に取り込まれるが、（Ｚ)−(５,６−ｄ2)−５−ドデセン酸および（Ｚ)−(５,６−ｄ2)−５−テトラデセン酸は取り込まれないことを見い出した。
【００１５】そして、コガネムシの性フェロモンの生合成経路は、飽和脂肪酸から始まり、まず飽和脂肪酸が不飽和化され、それに続いて８−水酸化短鎖化および閉環が行われることを見い出した。
【００１６】また、過重水素化パルミチン酸を添加すると、特異的な水素化反応を示した。
【００１７】ここで、すべての重水素元素が保持されたことは、この反応が直接プロセスであり、先行する不飽和化およびエポキシド化を伴わないことを意味する。
【００１８】加えて、ラセミ（９,１０−ｄ2)−８−ヒドロキシパルミトレイン酸および（９,１０−ｄ2)−８−ヒドロキシオレイン酸から得られた生成物もラセミ体であることは、フェロモンの立体特異性が固有の８位ヒドロキシラーゼによって得られることを意味する。
【００１９】従って、本発明の課題を解決するための手段は、下記のとおりである。
【００２０】第１に、立体特異的８−ヒドロキシラーゼを介して、脂肪酸で形成することで得られた、立体特異的８−ヒドロキシラーゼによるフェロモン。第２に、フェロモンがコガネムシの性フェロモンであり、立体特異的８−ヒドロキシラーゼを介して、飽和脂肪酸を不飽和化して不飽和脂肪酸とした後に、短鎖又は閉環を行うことで得られるものである、上記第１に記載のフェロモン。第３に、立体特異的８−ヒドロキシラーゼを介して、脂肪酸で形成することで得られた、立体特異的８−ヒドロキシラーゼによるフェロモンの製造方法。第４に、フェロモンがコガネムシの性フェロモンであり、立体特異的８−ヒドロキシラーゼを介して、飽和脂肪酸を不飽和化して不飽和脂肪酸とした後に、短鎖又は閉環を行うことで得られるものである、上記第３に記載のフェロモンの製造方法。
【００２１】
【実施例】
【００２２】［材料および方法］
【００２３】まず、分析手順を次に示す。
【００２４】分析は、ＨＰ−５ＭＳ（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）のカラムを用いて、質量分析器直結ガスクロマトグラフ（ＧＣ−ＭＳ）、フーリエ変換赤外線直結ガスクロマトグラフ（ＧＣ−ＦＴＩＲ）を用いて行った。
【００２５】また、光学異性体の分析は、キラルカラムＣｈｉｒａｌｄｅｘＧＴＡ（１０ｍ×０．２ｍｍ；０．２５μｍ；Ａｓｔｅｃ,Ｗｈｉｐｐａｎｙ,ＮＪ）を用いてＧＣ分析を行った。
【００２６】さらに、得られた性フェロモンの活性は、触角電位変化直結ガスクロマトグラフ（ＧＣ−ＥＡＤ）を用いて分析を行った。
【００２７】次に、（９,１０−ｄ2)−パルミレレイン酸および（９,１０−ｄ2)−オレイン酸の合成手順を示す。
【００２８】１オクチンおよび１デシンのアルキニリチウムを、１−ブロモ−８−ヒドロキシピラニロキソクタンと結合させた。
【００２９】脱保護、半重水素化（Ｌｉｎｄｌａｒ,Ｄ2）、酸化（Ｊｏｎｅｓ試薬）によって、全体的な収量が６５％の所望の生成物が得られた。
【００３０】このような化合物を、接触還元(ＰｔＯ2)することによって(９,１０−ｄ4）パルミチン酸および（９,１０−ｄ4)−ステリン酸を生成した。
【００３１】さらに、脂肪酸をＢＦ3メタノール溶液を用いて８０℃で２０分間エステル化することによって、対応するメチルエステルに変換した。
【００３２】ヘックス−５−ｙｎ−１−オルテトラヒドロピラニルエーテルのアルキニルリチウムを、ｎ−ヘキシル臭化物またはｎ−オクチル臭化物と結合させ、脱保護、半重水素化、酸化を行うことによって、（Ｚ)−(５,６−ｄ2)−５−ドデセン酸および（Ｚ)−(５,６−ｄ2)−５−テトラデセン酸を得た。
【００３３】５−ドデシン−１−オールをＬｉＡｌＤ4エーテル溶液を用いて還元しＪｏｎｅｓ酸化を施すことによって（Ｅ)−(５,６−ｄ2)−５−ドデセン酸を得た。
【００３４】［（９,１０−ｄ2)−８−ヒドロキシパルミトレイン酸および（９,１０−ｄ2)−８−ヒドロキシオレイン酸の生成］
【００３５】１−オクチンおよび１−デシンを、エチルマグネシウム臭化物を用いて−７０℃で１時間処理し、次いで−７０℃で塩化メチルスベリルと結合させた。
【００３６】メチル８−オキソ−ヘキサデク−９−ｙｎｏａｔｅおよび９−オキソ−デカデク−９−ｙｎｏａｔｅを還元し（水酸化ホウ素ナトリウム）、それに続いて半重水素化を行うと、所望のメチル８−ヒドロキシパルミトリエートおよびメチル８−ヒドロキシオリエートが得られた（４７％）。
【００３７】最後に、添加手順および抽出手順を示す。
【００３８】ドウガネブイブイ（Ａｎｏｍａｌａ ｃｕｐｒｅａ）を１６Ｌ：８Ｄの光周期（光周期０６：００から２２：００まで）２５℃の環境で飼育した。
【００３９】フェロモン産生時期（１４：００時から２０：００時まで）に、１回の実験当たり少なくとも３匹のコガネムシの尾節板に標識化合物のアセトン溶液を添加した（１μｌ)(５回反復／実験）。
【００４０】２時間後にコガネムシをエーテルで麻酔し、尾節板および最後の２つ腹板を切開しヘキサンを用いて抽出した（５分）。
【００４１】粗抽出物を、シリカゲル（Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−２００；Ｗａｋｏ、日本）を充填したＰａｓｔｅｕｒピペット上で浄化し、ヘキサンエーテル溶液を用いて連続的に溶出し（０％、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％）し、小分画として収集し、ＧＣ−ＭＳによって分析した。
【００４２】［結果］
【００４３】図１中のＡに示すように、環に隣接した二重結合を有するγ−ラクトンの主要な分断パターンによって、ｍ／ｚ＝１１１にベースピークが形成された。
【００４４】これによって、同位体標識実験に関して非常に有用な診断フィーチャが与えられる。
【００４５】ビニル位置に重水素を取り込むと、ベースピークがｍ／ｚ＝１１３へシフトする。
【００４６】これは、天然非標識ラクトンにおいて非常に低い強度を有する。
【００４７】なお、我々の最初の実験では、（９,１０−ｄ4)−パルミチン酸および（９,１０−ｄ4)−ステリン酸をメスドウガネブイブイに添加したが、これらの飽和前駆体が最終生成物に取り込まれることを実証することはできなかった。
【００４８】この失敗は、室温では固体であるこれらの化合物によるクチクラの貫通が不十分であるためであると考えた。
【００４９】コガネムシのフェロモン生産細胞は、明確な腺を形成せず、腹部外皮の内面上の単一の層として広がる。
【００５０】したがって、前駆体をインビボで直接細胞に添加することは不可能または非常に困難である。
【００５１】この障害を回避するために、室温で液体である（９,１０−ｄ4)−パルミチン酸と（９,１０−ｄ4)−ステリン酸の両方のメチルエステルを準備した。
【００５２】従来、脂肪酸メチルエステルが、補酵素Ａ（ＣｏＡ）チオエステルへの直接変換と事前の加水分解のどちらかを介して代謝経路に迅速に取り込まれることが報告されている。
【００５３】このような手段に変更することで、ｍ／ｚ＝１１３のピークが明確に増加し、フェロモン分子（ｂｕｉｂｕｉｌａｃｔｏｎｅ、１３％；ｊａｐｏｎｉｌｕｒｅ、２４％）に標識飽和脂肪酸が取り込まれたことを示した。
【００５４】次の代謝産物（９,１０−ｄ2)−パルミトレイン酸および（９,１０−ｄ2）オレイン酸を、仮定された経路に添加すると、取り込みレベルが大幅に増加した（それぞれ、２７％および５８％）。
【００５５】図１中のＢに示すように、標識分子の含有量は常に、相同染色体（ｊａｐｏｎｉｌｕｒｅ）が長いほど多かった。
【００５６】残りのステップ（水酸化および短鎖化）に関する反応順序を試験するために、２組の代謝産物を準備した。
【００５７】短鎖化を行い、その後に水酸化を行った場合には、（Ｚ)−(５,６−ｄ2)−５−ドデセン酸および（Ｚ)−(５,６−ｄ2)−５−テトラデカン酸がフェロモンに取り込まれるが、この順序を逆にした場合には、（９,１０−ｄ2)−８−ヒドロキシパルミトレイン酸および（９,１０−ｄ2)−８−ヒドロキシオレイン酸が取り込まれる。
【００５８】図１中のＡに示すように、標識ドデセン酸およびテトラデカン酸を添加しても、天然フェロモンに（Ｚ）異性体は取り込まれなかった。
【００５９】予想とは異なり、（Ｅ)−５−(オクト−１−エニル)−オキサシクロペンタン−２−オンおよび（Ｅ)−５−(デセ−１−エニル)−オキサシクロペンタン−２−オンの量が顕著に増加し、これらの異性体には多量の重水素分子が含まれていた。
【００６０】インビボでは、Δ9不飽和酵素は極めて特異的であり、トランス脂肪酸をほとんど産生しない（＜０．５％）。
【００６１】接触還元（Ｌｉｎｄｌａｒ）によって得られた我々のサンプルは、５％のトランス異性体を含んでいた。
【００６２】したがって、我々は生合成機序に大量の非天然物質を与えた（１回の添加当たりｃａ．１μｇ）。
【００６３】また、自然条件の下で、フェロモンのトランス異性体が分離されたが、非常に少量であった。
【００６４】この予想されなかった現象をさらに調査するために、（Ｅ)−(５,６−ｄ2)−５−ドデセン酸を準備した。
【００６５】この物質を添加した後に得られた（Ｅ)−５−(オクト−１−エニル）オキサシクロペンタン−２−オンは、基本的に標識分子しか含んでいなかった。
【００６６】シス異性体とトランス異性体とのそのような強力な識別の機序は明らかではない。
【００６７】トランス異性体の水酸化で使用されるのと同じ酵素が天然フェロモンの生合成に関与するかどうかも明らかではない。
【００６８】しかし、非天然前駆体を与えることによって代替分岐経路が活性化されたようであり、この経路では自然生成物は形成されないようである。
【００６９】図１中のＣに示すように、（９,１０−ｄ2)−８−ヒドロキシパルミトレイン酸および（９,１０−ｄ2）ヒドロキシオレイン酸は、天然物（ｂｕｉｂｕｉｌａｃｔｏｎｅ、４３％；ｊａｐｏｎｉｌｕｒｅ、５２％）に高率には取り込まれなかった。
【００７０】このことは、自然経路では脂肪酸の水酸化が短鎖化反応の前に行われることを強く示している。
【００７１】これらの結果に基づく完全な反応順序のスキームを、図３に示す。
【００７２】標識水酸化脂肪酸から得たフェロモンを、キラルＧＣカラム上で分析した。
【００７３】合成代謝産物はラセミ体であり、したがって、生合成経路でのこのような代謝産物の変化によって、水酸化の後に続く反応の立体特異性に関する洞察が与えられるはずである。
【００７４】標識前駆体が（Ｒ）異性体と（Ｓ）異性体の両方に取り込まれ、予想どおり非天然立体異性体はほぼ完全に非天然物質から導かれた。
【００７５】したがって、脂肪酸の水酸化は経路における唯一の立体特異反応であるようであり、その次のステップによって光学異性体どうしが識別されることはない。
【００７６】水酸化反応の機序を示すために、市販の過重水素化パルミチン酸を使用したところ、ＧＣカラム上で過重水素化ラクトンと天然ラクトンが明確に分離されるという利益が得られた。
【００７７】過重水素化生成物と疑われるものを非標識ｂｕｉｂｕｉｌａｃｔｏｎｅよりも０．２５分早く溶出した。
【００７８】ｂｕｉｂｕｉｌａｃｔｏｎｅに関連する小さなクロマトグラフピークの質量スペクトルは、全体的なパターン中の天然生成物のスペクトルに密に類似していた。
【００７９】このスペクトルは、予想される診断フィーチャも示し、ベースピークがｍ／ｚ＝１１８であり、分子イオンピークがｍ／ｚ＝２１６であった。
【００８０】赤外線スペクトルには、最初のｂｕｉｂｕｉｌａｃｔｏｎｅのフィーチャ（ｖＣ＝０、１８０８ｃｍ-1；ｖＣ−Ｃ（＝Ｏ)−Ｏ、１２０６ｃｍ-1、ｖＯ−Ｃ−Ｃ、１０３１ｃｍ-1）と同様なフィーチャが含まれていたが、Ｃ−Ｈ伸縮領域（３１００ｃｍ-1ないし３０００ｃｍ-1）での吸収は見られなかった。
【００８１】顕著なピークは２２１６ｃｍ-1（Ｃ−Ｄｓｔ．）に現れ、この分子が実際に過重水素化ｂｕｉｂｕｉｌａｃｔｏｎｅであることを示した。
【００８２】この化合物を、ＧＣ−ＥＡＤ検出器に結合されたガスクロマトグラフ上で生理活動に関して試験すると、この化合物は、図２に示すように、天然フェロモンで誘導されるのと同様にオス触角の電気生理反応を誘発させた。
【００８３】過重水素化フェロモンの質量スペクトルは明らかに、生合成経路内で重水素原子がプロチウムと置換されなかったことを示した。
【００８４】したがって、ヒドロキシル基の取り込みは直接プロセスであり、先行する不飽和化ステップやエポキシド化ステップを必要としない。
【００８５】これらのどちらの代替経路でも、必然的に２つの重水素原子がプロチウムと置換され、ベースピークがｍ／ｚ＝１１６で分子イオンピークがｍ／ｚ＝２１４で生成される。
【００８６】［考察］
【００８７】Ｃ5位置およびＣ6位置での重水素標識によって、ベースピークがｍ／ｚ＝１１１からｍ／ｚ＝１１３にシフトする。
【００８８】また、代謝産物（Ａ）がほとんどあるいはまったく取り込まれないとき、ＭＳは天然ｊａｐｏｎｉｌｕｒｅのＭＳと区別することができなかった。
【００８９】ドウガネブイブイは、最も一般的なγ−ラクトン（（Ｒ)−ｂｕｉｂｕｉｌａｃｔｏｎｅおよび（Ｒ)−ｊａｐｏｎｉｌｕｒｅ）の両方を約２：１の比率で比較的に大量に放出する（メス１匹当たり＞１００ｎｇ）。
【００９０】ドウガネブイブイにおける性フェロモンの生合成の反応順序（不飽和脂肪酸の水酸化の後に短鎖化が行われる）と、過重水素化基質から得たすべての重水素原子が保持されるためにこの経路がなくなることは明らかである。
【００９１】植物では、飽和γ−ラクトンはずっと複雑な経路を介して形成される。
【００９２】脂肪酸はまずエポキシド化され、エポキシドがジオールに加水分解され、それに続いて二重結合の閉環、脱水、還元が行われる。
【００９３】過重水素化前駆体から得たすべての重水素原子が保持されることは、脱水やエポキシド化が行われないことを示す。
【００９４】動物の脂肪酸が体内で水酸化されることは極めて希である。
【００９５】哺乳類では、水酸化は末端位置、あるいは不飽和脂肪酸のアリル炭素およびビスアリル炭素で行われることが最も多い。
【００９６】肝臓代謝物において８−ヒドロキシ−９,１２−オクタデカジアン酸が検出された。
【００９７】そのような反応は、通常、チトクロームＰ−４５０によるものである。
【００９８】昆虫では、例えばミツバチの階級選択的フェロモンの生合成においても末端水酸化が実証されている。
【００９９】末端水酸化脂肪酸からマクロシクリックラクトンが形成されることはまず、グレーンビートルで説明された。
【０１００】水酸化脂肪酸の最も進んだ研究の例であるトウゴマから得たリシノール酸、すなわちＲｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓは、不飽和化酵素との相同を示すオレイン酸１２−ヒドロキシラーゼによってオレイン酸から生合成される。
【０１０１】一方、初めて菌類のＬａｅｔｉｓａｒｉａ ａｒｖａｌｉｓから抽出された８−ヒドロキシリノレン酸は、ヒドロペルオキシド代謝産物を介して８−ジオキシゲナーゼによって形成される。
【０１０２】コガネムシでは、水酸化にアリル位置は必要とされないように思われる。
【０１０３】（Ｒ,Ｚ)−７,１５−ヘキサデカジエン−４−オリドの例である、ナガチャコガネの性フェロモンは、場合によってはこの位置をＣ−８からＣ−６にシフトできることを示す。
【０１０４】コガネムシフェロモンラクトンの閉環は、最終的なβ酸化ステップの後に活性化チオエステル形態で自発的に行われ、この場合、ヒドロキシ基が末端信号として働く可能性が最も高い。
【０１０５】そのような経路のために、このステップでは、水酸化脂肪酸の両方の異性体が取り込まれることによって示されたように立体特異性が欠落する。
【０１０６】様々なコガネムシ類が、水酸化ステップの立体特異性または限局特異性を変化させることによって、固有のフェロモン分子を産生するための経路を生成していることに留意されたい。
【０１０７】ドウガネブイブイ、マメコガネ、その他のいくつかの種は、（Ｒ)−ｊａｐｏｎｉｌｕｒｅと（Ｒ)−ｂｕｉｂｕｉｌａｃｔｏｎｅを合成し、それに対してオオサカスジコガネは（Ｓ)−ｊａｐｏｎｉｌｕｒｅを生産しナガチャコガネは（Ｒ,Ｚ)−７,１５−ヘキサデカジエン−４−オリドを生産する。
【０１０８】ヒメコガネでは、脂肪酸は水酸化されず、短鎖化後にエステル化され、そのためメチル５−テトラデセノエートが形成される。
【０１０９】これらの経路はすべて、他の昆虫群に関して従来発表されている一般的なパターンに当てはまり、単一の特定の反応を一般的な代謝経路に導入することによって、様々な情報伝達物質を生成することができる。
【０１１０】
【発明の効果】
【０１１１】本発明によると、様々な情報伝達物質の生成等に利用できるフェロモンを生合成によって得ることができる。
|
| 【出願人】 |
【識別番号】３９１０３０２８４
【氏名又は名称】農林水産省蚕糸・昆虫農業技術研究所長
【識別番号】０００１９５５６８
【氏名又は名称】生物系特定産業技術研究推進機構
|
| 【出願日】 |
平成１０年（１９９８）５月２８日 |
| 【代理人】 |
【弁理士】
【氏名又は名称】太田 恵一
|
| 【公開番号】 |
特開平１１−３４３２０４ |
| 【公開日】 |
平成１１年（１９９９）１２月１４日 |
| 【出願番号】 |
特願平１０−１６２８１１ |
|