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【発明の名称】 ベータセルリン遺伝子の発現不全動物
【発明者】 【氏名】佐々田 玲子

【氏名】五十嵐 貢一
【要約】 【課題】ＢＴＣ発現不全非ヒト動物およびＢＴＣ遺伝子転移非ヒト動物の提供。

【解決手段】不活性化ＢＴＣ遺伝子を有することを特徴とする非ヒト動物胚幹細胞、不活性化ＢＴＣ遺伝子を有することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物、外来性ＢＴＣ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト動物、ＢＴＣの欠損に起因する疾病に予防・治療薬のスクリーニング方法、ＢＴＣプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法および該スクリーニング方法で得られる化合物またはその塩、および遺伝治療用医薬に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】不活性化ベータセルリン遺伝子配列を有することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物または当該遺伝子配列を有するその子孫。
【請求項２】胚形成初期において導入された不活性化ベータセルリン遺伝子配列を、生殖細胞または体細胞に有する請求項１記載の動物。
【請求項３】レポーター遺伝子を導入することにより不活性化されたベータセルリン遺伝子配列を有し、該レポーター遺伝子がベータセルリンプロモーターの制御下で発現し得る請求項１記載の動物。
【請求項４】レポーター遺伝子が大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子である請求項３記載の動物。
【請求項５】不活性化ベータセルリン遺伝子配列を有することを特徴とする非ヒト動物胚幹細胞。
【請求項６】レポーター遺伝子を導入することにより不活性化されたベータセルリン遺伝子配列を有する請求項５記載の胚幹細胞。
【請求項７】外来性ベータセルリン遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有することを特徴とする非ヒト動物または該ＤＮＡを有するその子孫。
【請求項８】非ヒト動物が非ヒト哺乳動物である請求項１または請求項７記載の動物または請求項５記載の胚幹細胞。
【請求項９】非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である請求項９記載の動物または胚幹細胞。
【請求項１０】ゲッ歯動物がマウスである請求項９記載の動物または胚幹細胞。
【請求項１１】請求項１記載の動物を用いることを特徴とする、ベータセルリンの欠損に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１２】請求項３記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とするベータセルリンプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１３】請求項１１記載のスクリーニング方法を用いて得られるベータセルリンプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩。
【請求項１４】外来性ベータセルリン遺伝子またはその変異遺伝子を含有し、動物において発現しうるベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬。
【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、不活性化ベータセルリン遺伝子配列を有することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物ならびに当該遺伝子配列を有するその子孫、該遺伝子配列を有することを特徴とする非ヒト動物胚幹細胞、外来性ベータセルリン遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有することを特徴とする非ヒト動物ならびに該ＤＮＡを有するその子孫、外来性ベータセルリン遺伝子またはその変異遺伝子を含有し、動物において発現しうるベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬、ベータセルリンの欠損に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法、ベータセルリンプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、該スクリーニング方法を用いて得られるベータセルリンプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩などに関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学的技術の発展ならびに分子生物学の知識の急激な蓄積に伴い、遺伝子を人為的に操作し、さらに動物個体へ導入することが可能になり〔Gordon, J.W.ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)，第77巻，7380-7384頁（1980）〕、元来その生物に備わっていない外来性の遺伝形質を人為的に付加、あるいは生物が持っている内在性の遺伝形質の発現を抑制する方法も開発されるに至り、様々な形質転換動物が作り出され、形質転換動物として報告されている。このような形質転換動物は、遺伝子工学等の技術によって単離されたクローン化された様々な遺伝子の機能を明らかにする上で、これまで株化細胞や初代培養細胞など体外培養細胞を用いていたため、得られる知見が限られていた遺伝子の機能解析について、個体レベルでの研究が可能となる点で重要である。特に、クローン化された遺伝子の生物体内での生理学的機能の解析や遺伝子疾患のモデル系としてこの形質転換動物を利用した実験や研究が盛んになってきている。
【０００３】遺伝子導入動物は、動物またはこの動物の先祖の胚芽ラインの中へ初期（通常、単細胞）発育段階において導入された遺伝子を有している。例えば、（１）ワグナー（Wagner）等〔プロシーデイングス オブ ナショナル・アカデミー オブ サイエンス（Proc. Nat. Acad. Sc. U.S.A.,）第78巻、第5016頁、1981〕およびスチュワート（Stewart）等〔1982、サイエンス（Science）、第217巻、第1046頁〕は、ヒトグロビン遺伝子を含有する遺伝子導入マウスを、（２）コンスタンチーニ（Constantini）等〔ネイチャー（Nature）第294巻、第92頁、1981〕およびレーシ（Lacy）等〔セル（Cell）第34巻、第343頁、1983〕は、ウサギグロビン遺伝子を含有する遺伝子導入マウスを、（３）マックナイト（McKnight）等〔セル（Cell）第34巻、第335頁、1983〕はトランスフェリン遺伝子を含有する遺伝子導入マウスを、（４）ブリンスター（Brinstar）等〔ネイチャー（Nature）第306巻、第332頁、1983〕は、機能的に導入された免疫グロブリン遺伝子を含有する遺伝子導入マウスを、（５）パルミター（Palmiter）等〔ネイチャー（Nature）第300巻、第6ll頁、1982〕は、重金属誘発性メタロチオネインプロモーター配列に結合されたラット成長ホルモン遺伝子を含有する遺伝子導入マウスを、（６）パルミター等〔セル（Cell）第29巻、第701頁、1982〕は、メタロチオネインプロモーター配列に結合されたチミジンキナーセ遺伝子を含有する遺伝子導入マウスを、（７）パルミター等〔サイエンス（Science）第222巻、第809頁、1983〕は、メタロチオネインプロモーター配列に融合されたヒト成長ホルモン遺伝子を含有する遺伝子導入マウスを記載している。
【０００４】胚幹細胞（Embryonic stem cell：以下、ＥＳ細胞と略記する）は、受精後の初期胚である胚盤胞の内部に存在する内部細胞塊から樹立され、未分化状態を保ったまま増殖、培養可能な細胞株である。この細胞は生体のあらゆる種類の細胞に分化することができる多分化能を有しており、正常初期胚に注入すると胚体の形成に参加してキメラ動物を形成することができる〔Evans M. J. 及び KaufmanM. H., ネイチャー(Nature)，第292巻 154頁 （1981）〕。この性質を利用して、様々な遺伝子変異動物の作出が試みられてきた。その歴史は１９８１年のEvans及びKaufmanによるＥＳ細胞の樹立に始まり、BradleyらによるＥＳキメラマウスの作製〔ネイチャー(Nature)， 第309巻, 255頁 (1984)〕により本格的な研究が開始された。Thomas及びCapecchiがＥＳ細胞の遺伝子相同組換え〔セル（Cell)，第51巻, 503頁 (1987)〕に続いて、Kollerらのグループなど３組の研究グループがＥＳ細胞形質のGermline Transmissionに次々に成功し〔プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)，第86巻，8927頁（1989）〕、遺伝子欠損マウスの作製とこれを用いた研究が急速に進展してきた。現在までに樹立が報告されているＥＳ細胞としては、Evans及びKaufmanのＥＫ細胞〔前記文献〕の他に、DoetschmanのＥＳ−Ｄ３細胞〔ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー（J. Embryol.Exp. Molph.), 第87巻, 27頁 (1981)〕、RobertsonのＣＣＥ細胞〔ネイチャー(Nature), 第323巻, 445頁 (1986)〕、Ledermann及びBurkiのＢＬ／６III細胞〔エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Exp. Cell Res.), 第197巻, 254頁〕等があるが、これらの大部分が１２９系のマウスより樹立されたものである。ＥＳ細胞は特定の遺伝子を修飾する遺伝子ターゲッティング等において利用価値が非常に高いにもかかわらず、その樹立や未分化状態を保ったままでの継代維持が困難であるため利用が制限されているというのが現状である。ＥＳ細胞を用いた動物疾患モデルの作製を一般化するためには、絶えず良好なＥＳ細胞を樹立、供給していく体制を確立することが望まれている。
【０００５】このようなＥＳ細胞を用いて作出された遺伝子発現不全動物としては、（１）Hooper等〔ネイチャー(Nature), 第326巻, 292頁 (1987年)〕及びKnehn等〔ネイチャー(Nature), 第326巻, 295頁 (1987年)〕の自然突然変異ＥＳ細胞を用いたＨＰＲＴ遺伝子欠損マウス、（２）Donehower等〔ネイチャー(Nature), 第356巻, 215頁 (1992年)〕の癌抑制遺伝子の一つであるｐ５３を欠失したｐ５３欠失マウス、（３）Zijlstra等〔ネイチャー(Nature), 第344巻, 742頁 (1990年)〕のβ２ミクログロブリン遺伝子変異マウス、（４）免疫疾患モデルマウスの一つであるSinkai等〔セル（Cell), 第68巻, 855頁 (1992年)〕のＲＡＧ−２（Ｖ(Ｄ)Ｊ recombination activation gene）変異マウス、（５）Glimcher等〔サイエンス（Science), 第253巻，1417頁（1991年）〕及びCosgrove等〔セル（Cell）,第66巻, 1051頁 (1991年)〕のＭＨＣ class II変異マウス、（６）発生・発育関連疾患モデルマウスの一つとしてMacMahon等〔セル（Cell），第62巻, 1073頁 (1990年)〕のｉｎｔ−１遺伝子欠損マウス及び（７）Soriano等〔セル（Cell),第64巻, 693頁 (1991年）〕の大理石病様症状を呈するｓｒｃ欠損マウスがそれぞれ報告されている。
【０００６】ベータセルリン（以下、ＢＴＣと略記する場合がある）は、トランスジェニックマウス由来膵臓ベータ腫瘍細胞が産生する蛋白性因子で、その全アミノ酸配列がｃＤＮＡの解析から明らかにされている〔Shingら；サイエンス（Science），259：1604（1993）, Sasadaら；バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun.），190：1173（1993）〕。ＢＴＣは、当初マウス３Ｔ３細胞に対する増殖促進活性をもつ因子として見いだされたが、その後、血管平滑筋細胞、網膜色素上皮細胞に対しても増殖促進活性を有することが見いだされた〔Shingら；サイエンス（Science），259：1604（1993）〕。さらにＢＴＣは、ラット未分化型膵臓癌由来細胞株ＡＲ４２Ｊを、インシュリンを産生するベータ細胞に分化させることが報告された〔Mashimaら；ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（J. Clin. Invest.），97：1647（1996）〕。天然に存在するヒトＢＴＣは極めて微量であり、また、これをヒトの組織から得る試みは種々の制約によって極めて困難であった。しかし、遺伝子工学的手法を駆使して、高純度のヒトＢＴＣが多量に、かつ比較的安価に生産されるようになった（特開平６−８７８９４）。そして、ＢＴＣが、創傷、潰瘍や血管奇形の治療、あるいは糖尿病において認められるアテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症のような平滑筋細胞増殖に起因する病気の治療に使用できる競合剤（例、抗体、偽ペプチド）の作成などに用いられることが報告されている（特開平４−３５２８００および特開平６−８７８９４）。しかしながら、外来性ＢＴＣ遺伝子を導入した非ヒト動物やＢＴＣ遺伝子の発現が不全な非ヒト動物に関する報告は未だ見当たらない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】したがって、ＢＴＣ遺伝子が不活性化された非ヒト動物胚幹細胞の作製に成功すれば、ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物を作出することができる。そして、得られるＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物は、ＢＴＣにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、ＢＴＣの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり、これらの疾病の原因究明および治療法の検討が可能となる。また、外来性ＢＴＣ遺伝子を組み込んだＤＮＡを有するＢＴＣ遺伝子導入動物の作製に成功すれば、正常ＢＴＣ遺伝子導入動物においては、ＢＴＣの機能の解明、ベータセルリン関連疾患の発症機序の解明、治療方法の検討、正常ＢＴＣ遺伝子高発現細胞の供給などが可能になり、一方、変異ＢＴＣ遺伝子導入動物においては、ＢＴＣ不全症の発症機序の解明、治療方法の検討、変異ＢＴＣ遺伝子高発現細胞の供給などが可能になる。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課題に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物ならびに外来性ＢＴＣ遺伝子を組み込んだＤＮＡを有するＢＴＣ遺伝子導入動物を作製することに成功し、さらに研究を行なった結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、（１）不活性化ベータセルリン遺伝子配列を有することを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物または当該遺伝子配列を有するその子孫、（２）胚形成初期において導入された不活性化ベータセルリン遺伝子配列を、生殖細胞または体細胞に有する上記（１）記載の動物、（３）レポーター遺伝子を導入することにより不活性化されたベータセルリン遺伝子配列を有し、該レポーター遺伝子がベータセルリンプロモーターの制御下で発現し得る上記（１）記載の動物、（４）レポーター遺伝子が大腸菌由来β−ガラクトシダーゼ遺伝子である上記（３）記載の動物、（５）不活性化ベータセルリン遺伝子配列を有することを特徴とする非ヒト動物胚幹細胞、（６）レポーター遺伝子を導入することにより不活性化されたベータセルリン遺伝子配列を有する上記（５）記載の胚幹細胞、（７）外来性ベータセルリン遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有することを特徴とする非ヒト動物または該ＤＮＡを有するその子孫、（８）非ヒト動物が非ヒト哺乳動物である上記（１）または上記（７）記載の動物または上記（５）記載の胚幹細胞、（９）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（８）記載の動物または胚幹細胞、（１０）ゲッ歯動物がマウスである上記（９）記載の動物または胚幹細胞、（１１）上記（１）記載の動物を用いることを特徴とする、ベータセルリンの欠損に起因する疾病の予防・治療薬のスクリーニング方法、（１２）上記（３）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とするベータセルリンプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（１３）上記（１２）記載のスクリーニング方法を用いて得られるベータセルリンプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩、および（１４）外来性ベータセルリン遺伝子またはその変異遺伝子を含有し、動物において発現しうるベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬などに関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】〔ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物〕不活性化ＢＴＣ遺伝子配列を有することを特徴とする非ヒト動物ＥＳ細胞とは、非ヒト動物ＥＳ細胞が有するＢＴＣ遺伝子に人為的に変異を加えることにより、遺伝子の発現能を抑制するか、もしくは該遺伝子がコードしているＢＴＣの活性を実質的に喪失させることにより、遺伝子が実質的にＢＴＣの発現能を有さない不活性化された（以下、本発明のノックアウト遺伝子と称することがある）非ヒト動物のＥＳ細胞をいう。本明細書中、動物としては、いかなる動物でもよいが、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。非ヒト動物としては、ＢＴＣ遺伝子を有するヒト以外の動物ならば、いかなる動物でもよいが、非ヒト哺乳動物が好ましい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。非ヒト哺乳動物のなかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など（なかでも好ましくは、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統など、交雑系として、ＢＤＦ1系統またはＩＣＲ系統など））またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが特に好ましい。ＢＴＣ遺伝子としては、動物から単離、抽出されたゲノム由来のＢＴＣ遺伝子であってもよく、あるいは、遺伝子工学的手法を用いてクローニングされたＢＴＣｃＤＮＡであってもよい。具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するヒト由来ＢＴＣ蛋白質の遺伝子としては、例えば、配列番号：３で表わされる塩基配列を有する遺伝子〔特開平６−８７８９４〕などが用いられ、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有するマウス由来ＢＴＣ蛋白質の遺伝子としては、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列を有する遺伝子〔シング（Shing）等；サイエンス（Science）、第259巻、第1604頁、1993〕などが用いられる。これらの遺伝子は、自体公知の方法、例えば、特開平６−８７８９４、シング（Shing）等；サイエンス（Science）第259環、第1604頁、1993などに従って入手することができる。
【００１０】ＢＴＣ遺伝子に人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該遺伝子配列の一部又は全部の削除、他遺伝子を挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらすか、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウト遺伝子を作製することができる。不活性化ＢＴＣ遺伝子配列を有することを特徴とする非ヒト動物胚幹細胞（以下、ＢＴＣ遺伝子不活性化ＥＳ細胞またはノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子またはゼオシン耐性遺伝子など、好ましくは、ネオマイシン耐性遺伝子など）、あるいは、レポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ（大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ遺伝子）、ルシフェラーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、タウマリン遺伝子、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）遺伝子など、好ましくは、ｌａｃＺなど）等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、polyＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を作製する。レポーター遺伝子を挿入してエキソンの機能を破壊する場合、該レポーター遺伝子は、ＢＴＣプロモーターの制御下で発現するように挿入することが好ましい。上記「薬剤耐性遺伝子」とは、抗生物質などの薬剤耐性に関与する遺伝子を示し、導入される遺伝子が細胞において発現したか否かを選抜するマーカーとして利用される。また、上記「レポーター遺伝子」とは、遺伝子発現の指標になる遺伝子群のことを示し、通常、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が利用されることが多く、■遺伝的バックグラウンドがないもの、■遺伝子発現を定量的に行える高感度の方法があるもの、■形質転換細胞への影響が少ないもの、■発現部位の局在性が示されるものなどが好ましく用いられる（植物細胞工学、第2巻、第721頁、1990）。また、上記の「薬剤耐性遺伝子」なども同じ目的で使用されるが、「レポーター遺伝子」は、単に導入される遺伝子が細胞において発現したかどうかだけではなく、どの組織でいつ発現したかを調べることができ、しかも定量的に発現量を精確に調べることができる点において異なるものである。さらに、遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡを、例えば、相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞についてＢＴＣ遺伝子上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用したＢＴＣ遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。上記のターゲッティングベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３など）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＢ５，ｐＣ１９４など）、酵母由来のプラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５など）、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスベクター、バキュロウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス群からのウイルス、またはエプスタイン・バー・ウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。
【００１１】また、相同組換え法等によりＢＴＣ遺伝子を不活性化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚(受精後２．５日目頃の８細胞期胚が好ましい)を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例として挙げることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０〜１００個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【００１２】また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１−０.５％トリプシン／０.１−５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合は、その培養細胞は放棄することが望まれる。ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られるＢＴＣ遺伝子発現不全細胞は、インビトロにおけるＢＴＣの細胞生物学的検討において有用である。また、ＥＳ細胞を保存する場合には、適当な凍結用培地（例えば、10％ＤＭＳＯ、10％牛胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）などを用いて、約−８０℃以下で凍結保存する。
【００１３】本発明の不活性化ＢＴＣ遺伝子配列を有することを特徴とする非ヒト動物（以下、遺伝子発現不全非ヒト動物と称す場合がある）とは、例えば、前記の不活性化ＢＴＣ遺伝子配列を有することを特徴とする非ヒト動物胚幹細胞由来の細胞を用いて遺伝子工学的に作出されたものであり、例えば、生殖細胞および体細胞に胚形成初期に該不活性化ＢＴＣ遺伝子配列を導入された非ヒト動物である。該非ヒト動物としては、前記と同様のものが用いられる。ＢＴＣ遺伝子をノックアウトさせるには、前記のターゲッティングベクターを非ヒト動物（例、マウスなど）ＥＳ細胞または非ヒト動物（例、マウスなど）卵細胞に自体公知の方法（例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、凝集法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法など）によって導入し（好ましい導入法としては、ＥＳ細胞に導入する場合にはエレクトロポレーション法、卵細胞に導入する場合にはマイクロインジェクション法などがあげられる）、ターゲッティングベクターの不活性化されたＢＴＣ遺伝子配列を遺伝子相同組換えにより、非ヒト動物（例、マウスなど）ＥＳ細胞または非ヒト動物（例、マウスなど）卵細胞の染色体上のＢＴＣ遺伝子と入れ換えることにより行うことができる。ＢＴＣ遺伝子がノックアウトされた細胞は、ＢＴＣ遺伝子上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来のＢＴＣ遺伝子以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト動物ＥＳ細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、ＢＴＣ遺伝子が不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を胚形成の初期の適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト動物胚または胚盤胞に注入し（注入法）、またはＢＴＣ遺伝子が不活性化されたＥＳ細胞塊を２個の８細胞期胚ではさみ込む（集合キメラ法）ことにより作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト動物の子宮に移植する。作出された動物は正常なＢＴＣ遺伝子座をもつ細胞と人為的に変異したＢＴＣ遺伝子座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異したＢＴＣ遺伝子座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えたＢＴＣ遺伝子座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、ＢＴＣヘテロ発現不全個体であり、ＢＴＣヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔からＢＴＣホモ発現不全個体を得ることができる。卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法で遺伝子溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト動物を比較することにより、遺伝子相同組換えによりＢＴＣ遺伝子座に変異のあるものを選択することにより得られる。ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
【００１４】このようにしてＢＴＣ遺伝子がノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該遺伝子がノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従って行うことができる。すなわち、該不活化遺伝子配列の保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化遺伝子配列を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得することができる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化遺伝子配列を有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代することができる。このようにして得られた該不活化遺伝子配列を有する動物の子孫も本発明のＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物に含まれる。このようにＢＴＣ遺伝子が不活性化された非ヒト動物ＥＳ細胞は、ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物を作出する上で、非常に有用である。また、ＢＴＣ遺伝子発現不全非動物は、ＢＴＣを欠損に起因する疾病、例えば、ＢＴＣにより誘導され得る種々の生物活性の欠失に基づく、ＢＴＣの生物活性の不活性化に起因する疾病（例えば、インシュリン依存性糖尿病、動脈硬化症、糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、糖尿病性膵臓機能障害、老人性膵臓機能低下症、未分化型膵臓癌など）のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。すなわち、本発明のＢＴＣ遺伝子発現不全非動物は、該疾病の予防・治療薬のスクリーニングに用いることができる。
【００１５】本発明のスクリーニング方法において用いられるＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物としては、前記と同様のものが挙げられる。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。具体的には、本発明のＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状等の変化を指標として試験化合物の予防・治療効果を試験することができる。試験動物（ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物）を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。例えば、糖尿病や糖尿病関連疾病の予防・治療薬をスクリーニングする場合、本発明のＢＴＣ遺伝子発現不全非動物に糖負荷処置を行い、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の血糖値および体重変化などを経時的に測定することによりスクリーニングすることができる。
【００１６】本発明のスクリーニング方法を用いて得られる予防・治療薬は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、ＢＴＣ欠損によって引き起こされる疾患の予防・治療効果を有するので、ＢＴＣの欠損によって引き起こされる疾病に対する安全で低毒性な治療・予防薬などの医薬として有用である。また、該化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などの薬学的に許容し得る塩などがあげられる。無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
【００１７】本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を上述の治療・予防薬として使用する場合、常套手段に従って実施することができ、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を薬学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントゴム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００１８】注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の糖尿病患者においては、一日につき約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常成人（６０ｋｇとして）の糖尿病患者においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００１９】さらに、本発明は、本発明のＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とするベータセルリンプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法において用いられるＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物としては、前記した本発明のＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物の中でも、レポーター遺伝子を導入することにより不活性化されたＢＴＣ遺伝子配列を有し、該レポーター遺伝子がＢＴＣプロモーター（ＢＴＣ遺伝子のプロモーター領域）の制御下で発現し得るものが用いられる。試験化合物としては、前記と同様のものが挙げられる。レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）が好ましく用いられる。ＢＴＣの構造遺伝子をレポーター遺伝子で置換されたＢＴＣ発現不全非ヒト動物では、レポーター遺伝子がＢＴＣプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、ＢＴＣプロモーターの活性を検出することができる。
【００２０】例えば、ＢＴＣをコードする遺伝子領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、ＢＴＣの発現する組織で、ＢＴＣの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便にＢＴＣの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、ＢＴＣ欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、ダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。このように、本発明のＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物は、ＢＴＣプロモーターを促進または阻害不活化する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、ＢＴＣ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
【００２１】上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、ＢＴＣプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。ＢＴＣプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、ＢＴＣの発現を促進することができるので、例えば、創傷や糖尿病などの各種疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。一方、ＢＴＣプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、ＢＴＣの発現を阻害することができるので、例えば、アテローム性動脈硬化症のような平滑筋細胞増殖に起因する疾病あるいは糖尿病性網膜症などの各種疾病に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として有用である。上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を上述の治療・予防剤として使用する場合、前記と同様に実施することができる。
【００２２】〔ベータセルリン遺伝子導入動物〕本発明の外来性ＢＴＣ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡを有するトランスジェニック非ヒト動物（以下、ＢＴＣ遺伝子導入動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む生殖細胞などに対して、好ましくは、非ヒト動物の発生における胚形成初期の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階で、かつ一般に８細胞期以前）に、自体公知の方法（例えば、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法など）により目的とするＢＴＣ遺伝子を導入することによって作出することができる。また、該ＢＴＣ遺伝子導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＢＴＣ遺伝子を導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の生殖細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＢＴＣ遺伝子導入動物を作出することもできる。
【００２３】非ヒト動物としては、前記と同様のものが用いられる。外来性ＢＴＣ遺伝子とは、非ヒト動物の体内に存在しているＢＴＣ遺伝子ではなく、いったん動物から単離・抽出されたＢＴＣ遺伝子、あるいは、遺伝子工学的手法を用いてクローニングされたＢＴＣｃＤＮＡなどが用いられる。具体的には、前記した配列番号：３または配列番号：４で表わされる塩基配列を有する遺伝子などが用いられる。ＢＴＣ遺伝子の変異遺伝子（以下、変異ＢＴＣ遺伝子と略記する）としては、元のＢＴＣ遺伝子の塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＢＴＣ遺伝子などが用いられ、また、ＢＴＣ遺伝子の変異遺伝子（以下、変異ＢＴＣ遺伝子と略記する）も含まれる。該変異ＢＴＣ遺伝子としては、変異したＢＴＣを発現させるＢＴＣ遺伝子を意味し、例えば、正常なＢＴＣの機能を抑制するＢＴＣを発現させるＢＴＣ遺伝子などが用いられる。外来性ＢＴＣ遺伝子は、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの動物由来のものであってもよいがヒト由来ＢＴＣ遺伝子が好ましい。外来性ＢＴＣ遺伝子またはその変異遺伝子を組み込んだＤＮＡとしては、外来性ＢＴＣ遺伝子またはその変異遺伝子を含有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。ＢＴＣ遺伝子を対象動物に導入させるにあたっては、該ＢＴＣ遺伝子を動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、ヒトＢＴＣ遺伝子を導入させる場合、これと相同性が高いＢＴＣ遺伝子を有する各種非ヒト動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＢＴＣ遺伝子を発現させうる各種プロモーターの下流に、ヒトＢＴＣ遺伝子を結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによってＢＴＣ遺伝子を高発現するＢＴＣ遺伝子導入動物を作出することができる。
【００２４】ＢＴＣ発現用ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３など）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＢ５，ｐＣ１９４など）、酵母由来のプラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５など）、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスベクター、バキュロウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス群からのウイルス、またはエプスタイン・バー・ウイルスなどの動物ウイルスなどまたはその誘導体など）などが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。上記のＢＴＣ遺伝子発現に用いられるプロモーターとしては、例えば、ウィルス（例、シミアンウィルス、サイトメガロウィルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルス、ポリオウィルスなど）に由来するプロモーター、各種動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）由来のものとしては、アルブミン、インシュリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質ク、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、好ましくは、各種動物由来のインシュリンＩＩプロモーターなどが用いられる。
【００２５】上記ベクターは、ＢＴＣ遺伝子導入動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来、各種哺乳動物および鳥類由来の各ＢＴＣ遺伝子の配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。その他、目的ＢＴＣ遺伝子をさらに高発現させる目的で遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核細胞の遺伝子のイントロンの一部などをプロモーター領域の５'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３'下流に連結することも目的により可能である。正常なＢＴＣの翻訳領域は、各種動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、ヒトなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムライブラリーよりゲノム遺伝子の全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＢＴＣ遺伝子を原料として取得することが出来る。また、外来性変異ＢＴＣ遺伝子は、上記の細胞または組織より得られた正常ＢＴＣの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異させることにより作製することができる。該翻訳領域は導入動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の遺伝子工学的手法により作製することができる。受精卵細胞段階におけるＢＴＣ遺伝子の導入は、対象動物の生殖細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＢＴＣ遺伝子導入後の作出動物の生殖細胞において、ＢＴＣ遺伝子が存在することは、作出動物の後代がすべて、その生殖細胞および体細胞のすべてにＢＴＣ遺伝子を保持することを意味する。ＢＴＣ遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその生殖細胞および体細胞のすべてにＢＴＣ遺伝子を有する。
【００２６】外来性正常ＢＴＣ遺伝子を導入させた非ヒト動物は、交配によりＢＴＣ遺伝子を安定に保持することを確認して、該ＢＴＣ遺伝子保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。受精卵細胞段階におけるＢＴＣ遺伝子の導入は、対象動物の生殖細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＢＴＣ遺伝子導入後の作出動物の生殖細胞においてＢＴＣ遺伝子が過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその生殖細胞および体細胞の全てにＢＴＣ遺伝子を過剰に有することを意味する。ＢＴＣ遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその生殖細胞および体細胞の全てにＢＴＣ遺伝子を過剰に有する。導入ＢＴＣ遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＢＴＣ遺伝子を過剰に有するように繁殖継代することができる。このようにして得られた子孫も本発明の動物に含まれる。正常ＢＴＣ遺伝子を有する非ヒト動物は、正常ＢＴＣ遺伝子が高発現させられており、内在性の正常ＢＴＣ遺伝子の機能を促進することにより最終的にＢＴＣ機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、正常ＢＴＣ遺伝子導入動物を用いて、高ＢＴＣ症や、ＢＴＣ関連疾患（例えば、創傷、潰瘍、血管奇形、インシュリン依存性糖尿病、動脈硬化症（例、アテローム性動脈硬化症など）、糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、糖尿病性膵臓機能障害、老人性膵臓機能低下症、未分化型膵臓癌など）の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。また、外来性正常ＢＴＣ遺伝子を導入させた動物は、遊離ＢＴＣの増加症状を有することから、上記ＢＴＣ関連疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
【００２７】一方、外来性変異ＢＴＣ遺伝子を有する非ヒト動物は、交配によりＢＴＣ遺伝子を安定に保持することを確認して該ＢＴＣ遺伝子保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的ＢＴＣ遺伝子を前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＢＴＣ遺伝子工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における変異ＢＴＣ遺伝子の導入は、対象動物の生殖細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＢＴＣ遺伝子導入後の作出動物の生殖細胞において変異ＢＴＣ遺伝子が存在することは、作出動物の子孫が全てその生殖細胞および体細胞の全てに本発明の変異ＢＴＣ遺伝子を有することを意味する。変異ＢＴＣ遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫は、その生殖細胞および体細胞の全てに変異ＢＴＣ遺伝子を有する。導入ＢＴＣ遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該変異ＢＴＣ遺伝子を有するように繁殖継代することができる。変異ＢＴＣ遺伝子を有する非ヒト動物は、変異ＢＴＣ遺伝子が高発現させられており、内在性の正常ＢＴＣ遺伝子の機能を阻害することにより最終的にＢＴＣ機能不全症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができ、例えば、変異ＢＴＣ遺伝子導入動物を用いて、ＢＴＣ機能不全症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。また、具体的な利用可能性としては、変異ＢＴＣ遺伝子高発現動物は、ＢＴＣ機能不全症における変異ＢＴＣによる低ＢＴＣ症を解明するモデルとなる。また、外来変異ＢＴＣ遺伝子を導入させた動物は、遊離ＢＴＣの増加症状を有することから、ＢＴＣ機能不全症（例えば、インシュリン依存性糖尿病、動脈硬化症（例、アテローム性動脈硬化症など）、糖尿病性合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、耐糖能異常、高コレステロール血症、高グリセリド血症、高脂血症、糖尿病性膵臓機能障害、老人性膵臓機能低下症、未分化型膵臓癌など）に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
【００２８】また、上記２種類のＢＴＣ遺伝子導入動物のその他の利用可能性として、例えば、■組織培養のための細胞源としての使用、■ＢＴＣ遺伝子導入動物の組織中のＢＴＣ遺伝子もしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＢＴＣ遺伝子高発現組織を分析することによる、ＢＴＣにより特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性についての解析、■ＢＴＣ遺伝子を有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、■上記■記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および■変異ＢＴＣの単離精製およびその抗体作製などが考えられる。さらに、ＢＴＣ遺伝子導入動物を用いて、ＢＴＣ機能不全症を含む、ＢＴＣ関連疾患の臨床症状を調べることができ、また、ＢＴＣ関連疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。また、ＢＴＣ遺伝子導入動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、ＢＴＣ遺伝子導入細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、ＢＴＣ産生細胞の特定化、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、ＢＴＣおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。さらに、ＢＴＣ遺伝子導入動物を用いて、ＢＴＣ機能不全症を含む、ＢＴＣ関連疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、ＢＴＣ遺伝子導入動物または外来性ＢＴＣ遺伝子発現ベクターを用いて、ＢＴＣ関連疾患のＢＴＣ遺伝子治療法を検討、開発することが可能である。遺伝子治療法を検討する際には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ヘルペスウイルスベクターなどのウイルスベクターあるいは、膜融合リポソーム法などが用いられる。上記の外来性ＢＴＣ遺伝子発現ベクターは医薬としてＢＴＣ機能不全症または欠損症患者の遺伝子治療に用いることができる。具体的には、上記の外来性ＢＴＣ遺伝子発現ベクターを（１）特表平９−５０１０４６記載の方法またはそれに準じた方法などにより、 ＢＴＣ機能不全症または欠損症患者の骨髄細胞に移植することによる方法、（２）特表平９−５０５０８４に記載またはそれに準じた方法などにより、ＢＴＣ機能不全症または欠損症患者の筋肉組織、血管系、腸、皮膚、眼、肺などに投与する方法、または（３）特表平９−５０５５６１に記載またはそれに準じた方法などにより、ＢＴＣ機能不全症または欠損症患者の脳脊髄液に投与する方法などを用いることによってＢＴＣ遺伝子を患者の体内で発現させることを可能たらしめる。また、 ＢＴＣ機能不全症または欠損症患者の卵細胞に上記の方法によりＢＴＣ遺伝子を導入することにより、患者の子孫におけるＢＴＣ機能不全症または欠損症を予防することも可能である。
【００２９】本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸Ａ ：アデニンＴ ：チミンＧ ：グアニンＣ ：シトシンＲＮＡ ：リボ核酸ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸Ｇｌｙ ：グリシンＡｌａ ：アラニンＶａｌ ：バリンＬｅｕ ：ロイシンＩｌｅ ：イソロイシンＳｅｒ ：セリンＴｈｒ ：スレオニンＣｙｓ ：システインＭｅｔ ：メチオニンＧｌｕ ：グルタミン酸Ａｓｐ ：アスパラギン酸Ｌｙｓ ：リジンＡｒｇ ：アルギニンＨｉｓ ：ヒスチジンＰｈｅ ：フェニルアラニンＴｙｒ ：チロシンＴｒｐ ：トリプトファンＰｒｏ ：プロリンＡｓｎ ：アスパラギンＧｌｎ ：グルタミン【００３０】本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕ヒト由来ＢＴＣのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕マウス由来ＢＴＣのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕ヒト由来ＢＴＣをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕マウス由来ＢＴＣをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕プライマーＲＩ−１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕プライマーＲＩ−３の塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕プライマーＲＩ−１Ｃｌａの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕プライマーＲＩ−３Ｘｈｏの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕プライマーＮｅｏ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕プライマーｍＢＴ４０の塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕プライマーＲＥＬ−１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕プライマーＲＥＬ−２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕プライマーＲＥＬ−１Ｃｌの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕プライマーＲＥＬ−２Ｘｈの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕プライマーＢＴ１０７ｈの塩基配列を示す。
【００３１】後述の実施例１で得られたＢＴＣ遺伝子欠損ＥＳ細胞ＢＢ１５Ｆ１１は、平成９年２月２６日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５８４２として寄託されている。
【００３２】
【実施例】以下に、本発明を参考例および実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３３】
【参考例１】ＥＳ細胞用フィーダー細胞の調製フィーダーとして用いるＳＴＯ細胞は１０％牛胎仔血清（ＦＢＳ：Flow）、０.１mＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ：ＧＩＢＣＯ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：日水製薬）（以下、ＳＴＯ細胞用培地と称する）で培養し、コンフルエントになる直前の約７０〜８０％コンフルエントまで培養した時点で培地に終濃度１０μg／mlになるようマイトマイシンＣ（協和発酵工業）を加え３７℃で２．５時間培養した後、１mＭ ＥＤＴＡ含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ(−)）で２回洗浄し、０．０２５％トリプシンを含む１mＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳ(−)処理によりシングルセルサスペンジョンとした後培地を加え２００×ｇ ５分間遠心して細胞を集めた。ＳＴＯ細胞用培地で細胞を２×１０5個／mlの濃度に懸濁し、予め０.１％ゼラチン溶液（シグマ社）でコーティングしておいた２４穴リンブロカルチャープレートあるいは３５mm、６０mm、１００mmのペトリディシュ（ファルコン社）にそれぞれ１ml、２ml、３ml、１０mlの細胞懸濁液を加えて単層のフィーダー細胞を調製した。
【００３４】
【参考例２】ＥＳ細胞株の樹立ＢＤＦ1の雌マウスに５ＩＵの妊馬血清セロトロピン（ＰＭＳ：帝国臓器製薬）を腹腔内に投与後、４６〜４８時間後にさらに５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ：帝国臓器製薬）を腹腔内投与することにより過排卵を誘起した。同系の雄マウスと交配後２．５日目に開腹し、子宮潅流により８細胞期の胚を採取した。該８細胞期の胚をＬＩＦ（Leukemia Inhibitory Factor：白血球増殖阻止因子）を含まないＥＳ細胞用培地（ＥＳＭ：２０％非働化ＦＢＳ（牛胎仔血清：Flow），０.１mＭ ＮＥＡＡ（NE amino acid），１.０mＭ ピルビン酸ナトリウム(Flow)，０.１mＭ ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ：シグマ社），０.１mＭ ヌクレオシド（シグマ社）およびリコンビナントマウスＬＩＦ（rmＬＩＦ）（１×１０3Ｕ/ml：ＡＭＲＡＤ）を含むＤＭＥＭ（日水製薬））中でゼラチン処理した２４穴リンブロカルチャープレートで一晩培養した。胚盤胞まで卵割した胚をガラスキャピラリーで吸引採取し、予め培地を通常用いる量の５倍量(５×１０3Ｕ／ml)のＬＩＦを含むＥＳＭに置き換えた参考例１記載のフィーダー細胞上に播種した。栄養外胚葉が破れて内部細胞塊が大きく成長してきた時に、ガラスキャピラリーで内部細胞塊を吸引採取し、０.０２５％トリプシン含有１mＭ ＥＤＴＡ−ＰＢＳ(−)のマイクロドロップ内でシングルセルサスペンジョンとした後フィーダー細胞上に再び播種した。細胞塊の細胞数が１００個程度まで増えた時点でＰＣＲ法を用いて、マウスのＹ染色体上の性決定領域（sex-determining region of the Y-chromosome：Sry）遺伝子を増幅し、これを検出することにより雄の核型を持つ細胞を選別した。選別した細胞を２〜３日毎にトリプシン−ＥＤＴＡ処理によりフィーダー細胞上への播種を行い、順次培養スケールを大きくして継代し、細胞数が約１０6個／mlまで増えた時点で、Ｇ−バンディング法により染色体数をカウントして、雄型で染色体数４０（正常値）のものを選択し、細胞の劣化を防ぐため１０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ（シグマ社）を含むＤＭＥＭを凍結用培地として早期に-８０℃で凍結保存した。このようにしてＥＳ細胞株ＢＤＭ−３およびＢＤＭ−５を取得した。
【００３５】
【参考例３】ターゲティングベクターｐＴＢ１８７５の構築既報のマウスＢＴＣ ｃＤＮＡ〔Science 第259巻, 1604頁 (1993年)〕をプローブとして、マウスゲノム遺伝子ライブラリー（ＢＡＬＢ／ｃマウス）をスクリーニングした。スクリーニングはプラークハイブリダイゼーション法にて行い、１５ｋｂ ＳａｌＩ断片のマウスゲノム遺伝子を得た。この１５ｋｂ ＳａｌＩ断片はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ+のＳａｌＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＴＢ１８３１とした。１５ｋｂ断片をＥｃｏＲＩまたはＨｉｎｄIIIで切断し、得られた３ｋｂおよび６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＴＢ１８３２およびｐＴＢ１８３３を、また６.５ｋｂおよび３.４ｋｂ ＨｉｎｄIII断片をｐＵＣ１１９のＨｉｎｄIII部位にクローニングしてｐＴＢ１８３５およびｐＴＢ１８３６を取得した。これらマウスＢＴＣゲノムＤＮＡをクローニングしたプラスミド（ｐＴＢ１８３１，ｐＴＢ１８３２，ｐＴＢ１８３３，ｐＴＢ１８３５，ｐＴＢ１８３６）を用いて、マウスＢＴＣゲノムＤＮＡ １５ｋｂ断片の主要な制限酵素地図を作製した後、マウスＢＴＣ ｃＤＮＡをプローブとしたサザンブロット解析、ｃＤＮＡ配列をもとに作製したプライマーを用いたＰＣＲ解析、および塩基配列解析により、１５ｋｂ ＢＴＣゲノム上のエクソンの位置を決定した。〔図１〕に示すように、この１５ｋｂ ＤＮＡ上には、第３，第４，第５および第６エクソンが存在することが判明した。さらにマウス細胞ＤＮＡを用いた解析から、第３エクソンの上流１１ｋｂに第２エクソン、そのさらに上流１５ｋｂに第１エクソンが存在することが判った。
【００３６】上記ｐＴＢ１８３６のマウスＢＴＣゲノムＤＮＡの第４エクソンを含む１.２ｋｂ ＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＶ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ+のマルチクローニング部位のＢａｍＨＩ，ＳｍａＩ，ＰｓｔＩ切断部位を欠失させたもののＨｉｎｄIIIとＥｃｏＲＶの間にＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により組み込み、プラスミドｐＴＢ１８６４を構築した。一方、プラスミドｐＫＪ２から切り出した、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む０.５ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片（Biochem. Genet., 28 (1990) 299-308）を、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ+に連結してｐＴＢ１８６３を得た。このｐＴＢ１８６３から０.５ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＰＧＫプロモーター）を単離し、プラスミドｐＭＫ〔Brinster, R.L.ら, Cell 第27巻, 223頁 (1981年)〕をＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩで切断して得られた３.０ｋｂ断片（ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含む）と共に、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩで切断したｐＵＣ１１８に連結してプラスミドｐＴＢ１８６６を構築した。このｐＴＢ１８６６をＥｃｏＲＩおよびＰｖｕIIで切断してＰＧＫプロモーターとＨＳＵ−ＴＫ遺伝子を含む２.２ｋｂ断片を単離し、先に構築したｐＴＢ１８６４のマウスＢＴＣ遺伝子下流に存在するＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶの間に挿入して、プラスミドｐＴＢ１８６７を得た〔図２〕。ｐＴＢ１８６７はＳａｌＩで切断し、プラスミドｐＭＣ１ｎｅｏｐｏｌｙＡ（STRATAGENE, VS-2132-01）から切り出した１.１５ｋｂ ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片（ネオマイシン耐性遺伝子発現ユニット）をこのＳａｌＩ部位に組み込んでプラスミドｐＴＢ１８７０を得た。この時、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIで切断して挿入断片の方向を確認し、ネオマイシン耐性遺伝子がマウスＢＴＣ遺伝子に対して逆向きに挿入されているものを選択した〔図３〕。
【００３７】プラスミドｐＣＨ１１０（ファルマシア 27-4508-01）をＥｃｏＲＩで切断して得られた１.２ｋｂ断片と、プラスミドｐＭＣ１８７１（ファルマシア 27-4945-01）をＥｃｏＲＩで部分消化して得られた６.６ｋｂ断片を連結してｐＬａｃＺｐｏｌｙＡを得た。これをＳｍａＩで切断し、ＮｃｏＩリンカーを連結することによりＮｃｏＩ切断部位を挿入したプラスミドｐＬａｃＺｐｏｌｙＡ／Ｎｅｏを得た。このプラスミドをＨｉｎｄIIIで切断後、ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ断片で切断末端を平滑化し、ＢｇｌIIリンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により連結したのちＮｃｏＩおよびＢｇｌIIで切断して、ｌａｃＺ遺伝子を含む４.２ｋｂ断片を単離した。次に、マウスＢＴＣゲノム１５ｋｂ断片を含むｐＴＢ１８３１を、ＳａｌＩおよびＮｃｏＩで切断し、第３エクソンに存在するＮｃｏＩから上流の７.３ｋｂ断片を単離した。この７.３ｋｂ ＳａｌＩ−ＮｃｏＩ断片（マウスＢＴＣゲノム）を前述の４.２ｋｂ ＮｃｏＩ−ＢｇｌII断片（ｌａｃＺ）と共に、先に構築したｐＴＢ１８７０のＳａｌＩとＢａｍＨＩの間に挿入連結して、ターゲティングベクターｐＴＢ１８７５を構築した〔図３〕。
【００３８】
【参考例４】ＢＴＣ遺伝子導入ベクターの構築ラット尾から常法に従ってゲノムＤＮＡを調製した。このＤＮＡをテンプレートとして、既報のラットインシュリンII遺伝子プロモーターの塩基配列（GenBank：Accession No. J00748）をもとに合成したプライマーＲＩ−１〔５'−ＡＧＡＧＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＣＣＡＣＴ−３'（配列番号：５）〕およびＲＩ−３〔５'−ＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴＴＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧ−３'（配列番号：６）〕を用いてＰＣＲ法によりインシュリンプロモーター領域０.７５ｋｂを増幅した。さらに、このＰＣＲ産物をテンプレートとしてプライマーＲＩ−１Ｃｌａ〔５'−ＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧＡＧＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＡ−３'（配列番号：７）〕およびＲＩ−３Ｘｈｏ〔５'−ＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴＴＡＧＧＧ−３'（配列番号：８）〕を用いてＰＣＲを行った。増幅された０.７５ｋｂ ＤＮＡ断片を単離し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Novagen 69820−1）に組み込んで得られたプラスミドｐＴＢ１８８１を用いてクローニングされた断片の塩基配列を決定し、ラットインシュリンプロモーターであることを確認した。プラスミドｐＴＢ１８８１をＸｈｏＩ−ＣｌａＩで切断してラットインシュリンプロモーターである０.７３ｋｂ ＤＮＡ断片を得た。ヒトＢＴＣ ｃＤＮＡ発現プラスミドｐＴＢ１５１５（特開平４−３５２８００）をＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIIIで切断して得られた１.１ｋｂ断片（ｈＢＴＣ ｃＤＮＡ，ＳＶ４０スプライシング部位およびＳＶ４０ポリＡ付加部位を含む）、およびＨｉｎｄIII−ＣｌａＩで切断して得られた２.３ｋｂ断片（ｐＢＲ３２２由来ｏｒｉおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む）を単離し、これらと前述のラットインシュリンプロモーター領域を含む０.７３ｋｂ ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応によって連結し、プラスミドｐＴＢ１８８４を得た〔図５〕。このプラスミドｐＴＢ１８８４をＣｌａＩで切断して得られる１.８ｋｂ断片をマウス受精卵にマイクロインジェクションすることによってＢＴＣ遺伝子が膵臓β細胞で高発現する導入動物を作出することができる。
【参考例５】ＢＴＣ遺伝子導入ベクターｐＴＢ１９６９の構築ラット尾から調製したDNAをテンプレートとして，既報のラットエラスターゼＩ遺伝子プロモーターの塩基配列（GenBank:Accession No.J00730 ）をもとに合成したプライマーＲＥＬ−１［５’−ＴＣＣＡＧＡＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＴＣＣＡＴＡＡＣ−３’（配列番号：１１）］およびＲＥＬ−２［５’−ＧＡＧＴＡＧＡＣＣＡＣＴＧＣＣＣＣＴＴＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号：１２）］を用いてＰＣＲ法によりエラスターゼIプロモーター領域０．７５kbを増幅した。さらに、このＰＣＲ産物をテンプレートとしてプライマーＲＥＬ−１Ｃｌ ［５’−ＧＡＣＴＣＡＧＴＣＣＡＧＡＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＣＴＣＣ−３’（配列番号：１３）］およびＲＥＬ−２Ｘｈ ［５’−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＡＣＣＡＣＴＧＣＣＣＣＴＴＧ−３’（配列番号：１４）］を用いてＰＣＲを行った。 増幅された０．７５kb ＤＮＡ断片を単離し、ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Novagen 69820-1）に組み込んでプラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ／ＲＥＬＰ−２６を得た。組み込んだ断片の塩基配列を決定し、ラットエラスターゼIプロモーター であることを確認した。このプラスミドをプロモーター上流のクローニングベクター由来ＳｍａＩ部位で切断後ＢｇｌＩＩリンカーを付加し、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩで消化してラットエラスターゼＩプロモーター０．７５kb ＤＮＡ断片を単離した。プラスミドｐＴＢ１５６０（プラスミドｐＴＢ１４９９（特開平4-352800）からヒトＢＴＣ ｃＤＮＡを含む１．３kb ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片を切り出してプラスミドｐＵＣ１１９のＳａｌＩ部位にサブクローニングしたもの）をＳｍａＩで切断しＢａｍＨＩリンカーをライゲーションして、ヒトＢＴＣ ｃＤＮＡを含む１．０kb ＢａｍＨＩ断片を単離した。このＤＮＡ断片を，参考例４記載のプラスミドｐＴＢ１８８４をＢｇｌＩＩで切断してＢＴＣ ｃＤＮＡ部分を除いたＤＮＡ断片と結合させｐＴＢ１９６４を得た。ｐＴＢ１９６４ではｐＴＢ１８８４に比べてＢＴＣ ｃＤＮＡの３’非翻訳領域が０．３kb長くBTC遺伝子の本来のpoly A付加シグナルが含まれている。ｐＴＢ１９６４をＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られた１．４kb断片（ｈＢＴＣ ｃＤＮＡ， ＳＶ４０スプライシング部位およびＳＶ４０ポリＡ付加部位を含む）、およびＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで切断して得られた２．３kb断片（ｐＢＲ３２２由来oriおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む）を単離し、これらと前述のラットエラスターゼＩプロモーターを含む０．７５ｋｂ ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼ反応によって連結し，プラスミドｐＴＢ１９６９を得た[図１０]。
【００３９】
【実施例１】不活性化ＢＴＣ遺伝子導入とＢＴＣ遺伝子欠損ＥＳ細胞の選別ほぼコンフルエントまで増殖した参考例２で得られたＥＳ細胞ＢＤＭ−３（Cytotechnology 15, 1-5 (1996)）をトリプシン処理により解離し、ＥＳ細胞用培地（ＥＳＭ：ＤＭＥＭ、２０％ 非働化ＦＢＳ、０.１mＭ 非必須アミノ酸、１.０mＭ ピルビン酸ナトリウム、０.１mＭ ２−ＭＥ、１×１０3Ｕ／ml rmＬＩＦ）を加えて反応を止め遠心後、上清を除去し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩液（２１mＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.５、１３７mＭ ＮaＣl、５mＭ ＫＣl、０.７mＭ Ｎa2ＨＰＯ4、１ｇ／リットル グルコース）で再懸濁し、ＥＳ細胞懸濁液を調製した。参考例３で得られたプラスミドpＴＢ１８７５から制限酵素ＳalＩで切り出したターゲティングベクターをフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿を行って精製後、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩液に溶かした。５×１０7個になるよう調製したＥＳ細胞懸濁液（０.５ml）に終濃度１０μｇ／mlのターゲティングベクターを加え(ここで、より効率的な遺伝子導入細胞取得のためには終濃度１００μｇ／mlとなるように加える）、バイオラッド（Ｂio−Ｒad ）社のジーンパルサーを用い、２５０Ｖ ９６０μＦでＥＳ細胞にベクターをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後の細胞は直径１０cmのペトリディッシュには３×１０6個ずつ播種し、播種後４８時間はＥＳＭで培養し、その後培地にＧ４１８（２００μｇ／ml：ＧＩＢＣＯ）と１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ；０.２μＭ ネイチャー 第３４４巻、１７２頁（１９９０年）に準じて調製）を加えてＢＴＣ遺伝子欠損ＥＳ細胞の選択培養を開始した。２日ごとに培地を交換し９日から１１日目に増殖したコロニーを採取し、順次スケールアップして培養した。得られたＧ４１８耐性株のＢＴＣ遺伝子欠損の判定は採取した各細胞の一部よりＤＮＡを抽出し、制限酵素ＡpaＩで消化した後、マウスゲノムＤＮＡより調製した２.０ｋｂのＥcoＲＶ−ＳacＩ断片〔図１〕をプローブＡとして用いてサザンハイブリダイゼーション法により行った。ＢＴＣ遺伝子のノックアウト細胞株では６.５kbp及び５.２kbpの位置にバンドが検出できた〔図４〕。これに対して対照である野生株（ＢＤＭ−３）では６.５kbpのバンドのみが検出できた。サザンハイブリダイゼーションによる解析の結果、Ｇ４１８とＦＩＡＵ両方に耐性を示した６８６クローンのうち、１６クローンに変異が導入されている事が確認できた。ＢＴＣゲノムＤＮＡおよびプラスミドｐＴＢ１８７５を用いたターゲッティングコンストラクトを〔図１〕に示す。
【００４０】
【実施例２】ＢＴＣ欠損マウスの作出実施例１で得られたＢＴＣ遺伝子がノックアウトされた１６クローンのＥＳ細胞株のうち３クローンについてそれぞれ、田川らの集合キメラ法〔細胞工学第14巻，946頁（1995年）〕を行った。すなわち、参考例２に記載の方法でホルモン剤を投与して過排卵を誘起し、ＩＣＲ雄マウスと交配後２.５日目に子宮潅流により採卵したＩＣＲマウス８細胞期胚を、酸性タイロード液（０.８ｇ ＮａＣｌ，０.０２ｇ ＫＣｌ，０.０２４ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ，０.０１ｇ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ，０.１ｇ グルコース，０.４ｇ ポリビニルピロリドン：１００ｍｌ，塩酸でｐＨを２.５に調整）のドロップに移して透明帯を溶解させたのちＢＷＷ−Ｈｅｐｅｓ培地〔細胞工学 第13巻，1138頁（1994年）〕で洗浄した。予め直径６ｃｍペトリディッシュに作った針穴にミネラルオイルでおおったＢＷＷ（Biggers, Whitten & Whittingham）培地小ドロップ中にＥＳ細胞塊（１０〜１５個の細胞）を入れ、ここに２.５日胚を２個ずつ入れて細胞塊と接着させてＣＯ2インキュベーターで一晩培養した。この集合キメラ法によりできた胚盤胞（もしくは桑実胚）を精管結紮した雄との交配により作製した偽妊娠２.５日目のＩＣＲマウスを仮親として左右の子宮角へそれぞれ約１０個の胚を移植した。その結果、ＢＤＭ−３細胞の寄与率がほぼ１００％および７０％のキメラマウス（雄）が得られた。
【実施例３】ＢＴＣ欠損マウスの作出−２実施例２で得られたキメラマウス（雄）をＩＣＲマウス（白色，雌）にバックク ロスし，その産仔のコートカラーの判定によりＥＳ細胞の生殖系列への分化能を調べた。ＢＤＭ−３細胞の寄与率がほぼ１００％のキメラマウス（Ｑ２）から得られた７５匹の子マウスはすべて黒色〜野生色を示し、産仔は全てＥＳ細胞由来であった。７０ ％のキメラマウス（Ｑ１）から得られた１２０匹の子マウスでは、８０匹がES細胞に 由来する黒色〜野生色を示した。ＥＳ細胞由来の子マウスの尾から定法に従ってＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを 鋳型としてプライマーNｅｏ２［５’−ＡＣＣＴＧＣＧＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣ−３’（配列番号：９）］およびプライマーｍＢＴ４０［５’−ＴＡＣＡＣＣＴＧＣＣＴＴＣＡＧＧＧＣＴＡＡＡＴＧ−３’（配列番号：１０）］を用いてＰＣＲを行い産物をアガロースゲルにて解析した。Ｑ２由来子マウス７５匹のうち３７匹、Ｑ１由来子マウスのうち、ＥＳ細胞に由来する黒色〜野生色を示す８０匹のうち３２匹で、１．５ｋｂｐのバンドの増幅が認められ図６、ＢＴＣ遺伝子に変異（欠損）が導入されたヘテロ接合体マウスであると考えられた。これらのマウスＤＮＡについて，制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したのち，実施例１と同様にプローブＡ（２．０ｋｂのＥＣｃｏＲＩ−ＳａｃＩ断片図１）を用いてサザンハイブリダイゼーションにて解析した。実施例１で得られたＢＴＣ遺伝子欠損ＥＳ細胞株ＢＢ１５Ｆ１１と同様に６．１ｋｂｐおよび４．０ｋｂｐの位置にバンドが検出され（図６、図７）、ヘテロ接合体マウスであることが確認された。
【実施例４】ＢＴＣ欠損マウスの性質実施例３で得られたＢＴＣヘテロ欠損マウスの雌雄を交配することにより、ほぼ４分の１の確率でＢＴＣホモ欠損マウスが得られた。図８に実施例３と同様のサザンハイブリダイゼーション法による解析結果を示した。ＴＣホモ欠損マウスでは４．０ｋｂｐのバンドのみが検出された。さらに，マウス腎臓からｍＲＮＡを調製し、ＢＴＣのＯＲＦ領域をプローブとしてノーザンブロット解析を行った結果を図９に示した。 野生型マウス（ＢＴＣ＋／＋）では本来のＢＴＣ遺伝子に由来する３ｋｂのバンドが見られ、ヘテロマウス（ＢＴＣ＋／−）では３ｋｂのバンドおよびＢＴＣとｌａｃＺの融合遺伝子に相当する４．５ｋｂのバンドが、またホモマウス（ＢＴＣ−／−）ではＢＴＣ／ｌａｃＺ融合遺伝子の４．５ｋｂのバンドのみが検出された。すなわちＢＴＣホモ欠損マウスではＢＴＣ遺伝子が破壊されＢＴＣとｌａｃＺの融合遺伝子が発現していることがｍＲＮＡレベルで確認された。ＢＴＣホモ欠損マウスは外見上特に異常は認められず、出生後の体重の増加もホモ、ヘテロ、野生型群の間に明らかな差は認められなかった。４週令、６週令、８週令の各群を用いて絶食後グルコース投与（２ｇ／ｋｇ，ｉｐ）を行い、前後の血糖値を測定したが３群間に有意の耐糖能の差を認めなかった。４週令および６週令のホモ欠損マウスを用いて免疫組織化学および電顕による形態学的検討を行った結果、膵島の成熟障害を示唆する知見が得られた。（１）生後４週において神経組織に接した膵島が高頻度に認められた。（２）生後６週において，膵導管に取り囲まれた膵島や，導管を囲む膵島が多数認められ、電顕において膵島細胞と膵外分泌細胞や導管細胞との間に細胞間接着装置が観察された。
【実施例５】ＢＴＣ遺伝子導入動物の作出参考例５記載のプラスミドｐＴＢ１９６９を制限酵素ＣｌａＩで切断し、２．２ｋｂ ＤＮＡ断片（ラットエラスターゼＩプロモーターによるｈＢＴＣ発現ユニット）を単離した。このＤＮＡ溶液（１０μg/ml,５ｍM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．１mMＥＤＴＡ）をＢＤＦ1マウスの受精卵にマイクロインジェクション法により注入したのち、偽妊娠０．５日目のＩＣＲマウスの卵管に移植した（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、第78巻、第5016 頁、1981年）。生まれた子マウス１２１匹の尾からゲノムＤＮＡを調製し、プライマーＲＥＬ−１（参考例５に記載）およびプライマーＢＴ１０７ｈ［５’−ＡＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号：１５）］を用いてＰＣＲ法により導入遺伝子の検定を行った。ＰＣＲの結果、期待される１．０kbのバンドが増幅された１４匹のマウスについて、そのＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ消化したのち、ヒトＢＴＣｃＤＮＡをプローブとしてサザンハイブリダイゼーション法による解析を行った。結果を図１１に示した。１コピーから１０コピーの導入遺伝子が組み込まれたヒトＢＴＣ遺伝子導入マウスが得られた。これらのマウスでは膵臓ａｃｉｎａｒ細胞でのＢＴＣの特異的発現が期待される（Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ．３１３，６００−６０２，１９８５）。
【００４１】
【発明の効果】本発明のＢＴＣ遺伝子が不活性化された非ヒト動物胚幹細胞は、ＢＴＣ遺伝子発現不全非ヒト動物を作出する上で、非常に有用である。本発明のＢＴＣ発現不全非ヒト動物は、ＢＴＣにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、ＢＴＣの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、ＢＴＣ欠損に起因する各種疾病の予防・治療薬にスクリーニングや、ＢＴＣ関連疾患の原因究明および治療法の検討に有用である。さらに、ＢＴＣプロモーター活性の促進または阻害活性を有する化合物またはその塩のスクリーニングに有用である。本発明のＢＴＣ遺伝子導入非ヒト動物は、高ＢＴＣ症、ＢＴＣ機能不全症などのＢＴＣ関連疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことができる。また、上記ＢＴＣ関連疾患に対する治療薬のスクリーニングに使用することができる。さらに、外来性ＢＴＣ遺伝子またはその変異遺伝子を含有し、動物において発現し得るベクターを含有してなる遺伝子治療用医薬はＢＴＣ関連疾患の遺伝子治療薬として有用である。本発明のスクリーニング方法は、ＢＴＣ欠損に起因する各種疾病の予防・治療薬、またはＢＴＣプロモーター活性の促進または阻害活性を有する化合物またはその塩を効率良くスクリーニングすることができる。
【００４２】
【配列表】
【配列番号：１】
配列の長さ：８０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ １ ５ １０ １５Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ ２０ ２５ ３０Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ ３５ ４０ ４５Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ ５０ ５５ ６０Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ ６５ ７０ ７５ ８０【００４３】
【配列番号：２】
配列の長さ：８０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ １ ５ １０ １５Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ ２０ ２５ ３０Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｈｉｓ ３５ ４０ ４５Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ ５０ ５５ ６０Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ ６５ ７０ ７５ ８０【００４４】
【配列番号：３】
配列の長さ：２４０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列ＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴ ＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧ ＴＣＣＴＧＡＡＡＣＴ ＡＡＴＧＧＣＣＴＣＣ ＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡ ＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡ ６０ＡＡＣＴＧＴＧＣＡＧ ＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣ ＡＣＡＡＴＣＡＡＡＧ ＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣ ＡＣＴＴＣＴＣＴＡＧ ＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧ １２０ＣＡＡＴＡＣＡＡＧＣ ＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴ ＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡ ＴＧＣＣＧＣＴＴＣＧ ＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡ ＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣ １８０ＴＣＣＴＧＴＧＴＣＴ ＧＴＧＡＴＧＡＡＧＧ ＣＴＡＣＡＴＴＧＧＡ ＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧ ＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡ ＣＴＴＧＴＴＴＴＡＣ ２４０【００４５】
【配列番号：４】
配列の長さ：２４０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列ＧＡＴＧＧＧＡＡＣＡ ＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣ ＡＣＣＡＧＡＡＡＣＣ ＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣ ＴＴＴＧＴＧＧＡＧＣ ＴＣＣＴＧＧＧＧＡＡ ６０ＡＡＣＴＧＣＡＣＡＧ ＧＴＡＣＣＡＣＣＣＣ ＴＡＧＡＣＡＧＡＡＡ ＧＴＧＡＡＡＡＣＣＣ ＡＣＴＴＣＴＣＴＣＧ ＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧ １２０ＣＡＧＴＡＣＡＡＧＣ ＡＴＴＡＣＴＧＣＡＴ ＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡ ＴＧＣＣＧＣＴＴＣＧ ＴＧＧＴＧＧＡＣＧＡ ＧＣＡＡＡＣＴＣＣＣ １８０ＴＣＣＴＧＣＡＴＣＴ ＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧ ＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧ ＧＣＴＣＧＧＴＧＴＧ ＡＧＣＧＡＧＴＧＧＡ ＣＣＴＧＴＴＴＴＡＣ ２４０【００４６】
【配列番号：５】
配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列AGAGTCAAGG ATCCCCCAAC CACT 24【００４７】
【配列番号：６】
配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列AGCTGGTCAC TTAGGGCTGG GG 22【００４８】
【配列番号：７】
配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列GAATCGATAG AGTCAAGGAT CCCCCA 26【００４９】
【配列番号：８】
配列の長さ：２２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列GACTCGAGCT GGTCACTTAG GG 22【００５０】
【配列番号：９】
配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列ACCTGCGTGC AATCCATCTT GTTC ２４【００５１】
【配列番号：１０】
配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列ＴＡＣＡＣＣＴＧＣＣ ＴＴＣＡＧＧＧＣＴＡ ＡＡＴＧ 24【００５２】
【配列番号：１１】
配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列TCCAGACCTG TTTGCTCTCC ATAAC 25【００５３】
【配列番号：１２】
配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列GAGTAGACCA CTGCCCCTTG CCATG ２５【００５４】
【配列番号：１３】
配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列ＧＡＣＴＣＡＧＴＣＣ ＡＧＡＣＣＴＧＴＴＴ ＧＣＴＣＴＣＣ 27【００５５】
【配列番号：１４】
配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列GACTCGAGTA GACCACTGCC CCTTG 25【００５６】
【配列番号：１５】
配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列AGCAGTGGCA GGGAGCTGGC ２０【００５７】
【出願人】 【識別番号】０００００２９３４
【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社
【出願日】 平成１０年（１９９８）３月１６日
【代理人】 【弁理士】
【氏名又は名称】朝日奈 忠夫 （外１名）
【公開番号】 特開平１１−２８５３３２
【公開日】 平成１１年（１９９９）１０月１９日
【出願番号】 特願平１０−６５８５２