| 【発明の名称】 |
アルツハイマー病モデル動物 |
| 【発明者】 |
【氏名】井原 康夫
【氏名】小山 文隆
【氏名】伊藤 守
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| 【要約】 |
【課題】新規なＡＤモデル動物として、ヒトＰＳ２遺伝子を保有するトランスジェニック動物とこの動物から単離した細胞、並びにをこれらを用いた各種試験方法を提供する。
【解決手段】ヒト・プレセニリン２遺伝子またはその変異遺伝子を導入した全能性細胞を個体発生して得られる哺乳動物およびその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記導入遺伝子を保有することを特徴とするアルツハイマー病モデル動物と、このモデル動物から単離された細胞、並びにこれらのモデル動物または細胞を用いてアルツハイマー病原因物質または治療薬を特定する試験方法。 |
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ヒト・プレセニリン２遺伝子またはその変異遺伝子を導入した全能性細胞を個体発生して得られる哺乳動物およびその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記導入遺伝子を保有することを特徴とするアルツハイマー病モデル動物。
【請求項２】 哺乳動物が、マウスである請求項１のアルツハイマー病モデル動物。
【請求項３】 ヒト・プレセニリン２遺伝子が、当該ゲノム遺伝子のＲＮＡより調製したｃＤＮＡである請求項１または２のアルツハイマー病モデル動物。
【請求項４】 ヒト・プレセニリン２の変異遺伝子が、当該ゲノム遺伝子のＲＮＡより調製したｃＤＮＡにおける第１４１番目アスパラギン残基がイソロイシン残基に置換した変異ｃＤＮＡである請求項１または２のアルツハイマー病モデル動物。
【請求項５】 ヒト・プレセニリン２の変異遺伝子が、当該ゲノム遺伝子のＲＮＡより調製したｃＤＮＡにおける第２３９番目メチオニン残基がバリン残基に置換した変異ｃＤＮＡである請求項１または２のアルツハイマー病モデル動物。
【請求項６】 請求項１から５のいずれかの動物から単離された細胞。
【請求項７】 請求項１から５のいずれかの動物に、アルツハイマー病の原因となる疑いのある物質を投与し、動物細胞におけるアミロイドβタンパク質の生産量を指標としてアルツハイマー病原因物質を特定する試験方法。
【請求項８】 請求項６の細胞を、アルツハイマー病の原因となる疑いのある物質を含有した培地で培養し、細胞のアミロイドβタンパク質生産量を指標としてアルツハイマー病原因物質を特定する試験方法。
【請求項９】 請求項１から５のいずれかの動物、またはアルツハイマー病原因物質を投与したこの動物に、アルツハイマー病の候補治療薬を投与し、動物細胞におけるアミロイドβタンパク質の生産量を指標としてアルツハイマー病治療薬を特定する試験方法。
【請求項１０】 請求項６の細胞の培養培地中、またはアルツハイマー病原因物質を含有した培地で培養したこの細胞の培地中に、アルツハイマー病の候補治療薬を添加して細胞を培養し、細胞のアミロイドβタンパク質生産量を指標としてアルツハイマー病治療薬を特定する試験方法。
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【発明の詳細な説明】【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、アルツハイマー病モデル動物に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、アルツハイマー病の原因遺伝子の一つであるヒト・プレセリン２遺伝子（以下、ＰＳ２と記載することがある）を体細胞染色体中に保有するトランスジェニック動物であって、アルツハイマー病の原因解明およびその診断法並びに治療法の開発に有用なモデル動物、この動物の細胞培養、およびこれらを用いた各種試験方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】アルツハイマー病（Alzheimer's Disease : ＡＤ）は、中年以降に発病し、短期間の間に記銘力、記憶力の低下、人格障害などを生じる進行性の痴呆疾患であり、脳内における老人斑の存在と細胞内の神経原線維変化を大きな特徴としている。脳血管性痴呆と並んで老年期痴呆の中核ともいえる重要疾患であり、我が国では痴呆患者の約３分の１、米国では４０〜６０％がＡＤと言われている。
【０００３】また、ＡＤの約１割は常染色体優性遺伝を示す家族性ＡＤであり、その原因遺伝子の一つとして、１９９１年にアミロイドβタンパク前駆体（βＡＰＰ）遺伝子の変異が同定されている（Nature, 349: 704-706, 1991）。このβＡＰＰ遺伝子の変異は、第２１番染色体に連鎖する家系のＡＤ発症に関与しており、その後、第１４番染色体に連鎖する家系ではプレセニリン１（ＰＳ１）の遺伝子変異（Nature375: 754-760, 1995）が、第１番染色体に連鎖する家系ではプレセニリン２（ＰＳ２）の遺伝子変異（Science 269: 973-977, 1995）が同定されている。
【０００４】そして、βＡＰＰについては、この変異タンパク質を発現するトランスジェニックマウスの作成が試みられ、１９９５年には、Games らによりＡＤの病態変化を再現したβトランスジェニックマウスが報告され（Nature 373:523-527, 1995）、このようなモデル動物を用いたＡＤの病態の解析や治療薬剤の開発が期待されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ＡＤは上記のとおりの複数の遺伝子異常によって引き起こされる多因子疾患であること考えられることから、βＡＰＰに関係するトランスジェニックマウスだけでは、ＡＤの病因、病態の解析および治療薬剤の開発のために十分とは言えない。
【０００６】特に、老人斑の主要成分であるアミロイドβタンパク質（Ａβ）は、Ｃ末端の長さにによってＡβ４２とＡβ４０の２種類に分けられるが、このうち、Ａβ４２が老人斑の形成に重要な役割を果たしていることが知られている（例えば、Neuron 13:45-53, 1994; Ann.Neurol. 37: 294-299, 1995; Biochemistry 32: 4693-4697, 1993; Science 264: 1336-1340, 1994; Neurology 48: 741-745, 1997）。そして、このＡβ４２の生産には、ＰＳ１およびＰＳ２遺伝子の変異が等分に関与していることも知られている（Nature Med. 2: 864-870, 1996; Nature 383: 710-713, 1996; Neuron 17: 1005-1013, 1996; Nature Med. 3:67-72, 1996）。
【０００７】従って、ＡＤの病態解析および治療薬剤の開発等のためには、ＡＤの特徴である老人斑の形成に重要な役割を果たすＡβ４２の生産に関係する遺伝子ＰＳ１またはＰＳ２遺伝子を導入したトランスジェニック動物が不可欠である。この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、新規なＡＤモデル動物として、ヒトＰＳ２遺伝子またはその変異遺伝子を保有するトランスジェニック動物を提供することを目的としている。
【０００８】また、この出願の発明は、このモデル動物または動物から単離した細胞を用いた各種試験方法を提供することを目的としてもいる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、ヒト・プレセニリン２遺伝子またはその変異遺伝子を導入した全能性細胞を個体発生して得られる哺乳動物およびその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記導入遺伝子を保有することを特徴とするアルツハイマー病モデル動物を提供する。
【００１０】この発明のモデル動物においては、上記哺乳動物が、マウスであることを好ましい態様の一つとしている。また、ヒト・プレセニリン２遺伝子が、当該ゲノム遺伝子のＲＮＡより調製したｃＤＮＡであること、ヒト・プレセニリン２の変異遺伝子が、当該ゲノム遺伝子のＲＮＡより調製したｃＤＮＡにおける第１４１番目アスパラギン残基がイソロイシン残基に置換した変異ｃＤＮＡまたは第２３９番目メチオニン残基がバリン残基に置換した変異ｃＤＮＡであることを別の好ましい態様としてもいる。
【００１１】この出願の発明は、また、上記のモデル動物から単離された細胞を提供する。さらにまた、この出願の発明は、上記モデル動物または細胞を用いて、アルツハイマー病原因物質または治療薬を特定する試験方法を提供する。以下、上記の各発明について実施の形態を詳しく説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】この発明のＡＤモデル動物は、ヒトＰＳ２遺伝子またはその変異遺伝子を導入した全能性細胞を個体発生して得られる哺乳動物およびその子孫動物であって、体細胞染色体中に上記導入遺伝子を保有することを特徴とするトランスジェニック動物である。
【００１３】導入遺伝子の一つであるヒトＰＳ２遺伝子（野生型ＰＳ２）は、例えば、ヒトの脳から抽出したＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成し、公知のＰＳ２配列（Nature 376:775-778, 1995; Science 269:970-977, 1995 ）に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いてライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。また、公知のＰＳ２配列の両端に相当する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によっても目的とするｃＤＮＡを得ることができる。
【００１４】ヒトＰＳ２変異遺伝子（変異型ＰＳ２）は、上記のとおりの方法によって得た野生型ＰＳ２のｃＤＮＡに、公知の方法で変異誘導することによって容易に作成することができる。すなわち、変異型ＰＳ２は、野生型ＰＳ２ｃＤＮＡの第１４１番目アスパラギン残基がイソロイシン残基に置換した変異（Ｎ１４１Ｉ）と、第２３９番目メチオニン残基がバリン残基に置換した変異（Ｍ２３９Ｖ）の２種類であり（Neuron 18: 687-690, 1997）、この発明ではいずれの変異型ＰＳ２をも対象とすることができる。
【００１５】また、これらの導入遺伝子には、その発現を制御するためのプロモーター配列やエンハンサー配列を連結する。これらの配列については特に制限はなく、通常用いられている配列を適宜に組み合わせて使用することができる。ただし、導入遺伝子を脳で特異的に発現させるためには、β−アクチンプロモーター等の使用が好ましい。
【００１６】トランスジェニック動物の作成は公知の方法（例えば、Pro.Natl.Acad.Sci.USA 77:7380-7384, 1980）に従って、上記導入遺伝子を哺乳動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって作成することができる。哺乳動物としては、技術的には全ての動物種を対象とすることが可能であるが、特に近交系が多数作出されており、しかも受精卵の培養、体外受精等の技術が整っているマウスが最適である。遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞のような培養細胞を対象とすることができる。また、このような培養細胞への遺伝子導入法としては、公知の静電パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等も利用できるが、トランスジェニック動物個体の産出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を勘案した場合、受精卵へのＤＮＡ溶液の物理的注入（マイクロインジェクション）法が好ましい。
【００１７】遺伝子を注した全能性細胞は、次に仮親の卵管に移植し、個体まで発生し、出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（例えば尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザンブロット分析やＰＣＲアッセイ等により導入遺伝子の存在を確認する。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代（Founder ）とすれば、導入遺伝子はその子孫の５０％に伝達され、野生型ＰＳ２または変異型ＰＳ２を染色体の一部に安定的に組み込んだ動物を効率よく作出することができる。
【００１８】このようにして作出されたトランスジェニック動物は、例えば変異型ＰＳ２を保有する動物の場合には、後記する実施例にも示したようにＡβ４２を過剰生産するため、その生産抑制作用または分解作用によってＡＤ治療効果が期待される薬剤のスクリーニングに最適のモデル動物となる。また、野生型ＰＳ２を保有するトランスジェニック動物は、ＡＤの病因または自然発症過程を調べるためのモデル動物として有用である。すなわち、野生型ＰＳ２動物は、変異型ＰＳ２動物に比べてＡβ４２の生産量は少ないため、例えばＡＤの原因となる疑いのある物質を投与し、その生産量の増加の程度を見ることによって、ＡＤ原因物質を特定することができる。あるいは、ＡＤ原因物質で予め処理し、ついでＡＤ治療薬剤のスクリーニングに用いることもできる。
【００１９】さらにまた、この発明によって提供されるトランスジェニック動物は、全ての体細胞に導入遺伝子を保有するため、この動物個体から単離した細胞もそれぞれにヒトＡβ４２を生産する。このため、これらの細胞の培養系を用いて、上記動物個体の場合と同様にＡＤ原因物質や治療薬剤のスクリーニングを行うことができる。特に、このような細胞培養系は、動物実験代替として、原因物質や薬剤の１次スクリーニングに有用である。
【００２０】以下、実施例を示してこの発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
【００２１】
【実施例】
（１）トランスジェニックマウスの作成公知の方法（Anal.Biochem. 162: 120-129, 1987）に従って健常老人の脳から全ＲＮＡを抽出し、公知の方法（J.Neurochem. 67: 1235-1244, 1996）により逆転写してｃＤＮＡを作成した。次いで、これらのｃＤＮＡから、ＰＣＲ増幅により野生型ＰＳ２のｃＤＮＡ（481-bp）を調製した。ＰＣＲプライマーとしては、配列番号１の合成オリゴヌクレオチド（フォワードプライマー）および配列番号２の合成オリゴヌクレオチド（リバースプライマー）を用いた。また、ＰＣＲ条件は、（94℃で１分間：55℃で３分間：72℃で４分間）×３５サイクルとした。
【００２２】変異型ＰＳ２のｃＤＮＡとしては、ＰＣＲ変異誘導法により第１４１番目のアルギニン残基をイソロイシン残基に置換したＮ１４１Ｉを作成した。これらのｃＤＮＡは、次いで発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（Gene 108: 192-200,1991 ）に挿入し、ＤＮＡシークエンサーにより塩基配列を解析して、それぞれ野生型ＰＳ２ｃＤＮＡおよび変異型ＰＳ２ｃＤＮＡ（Ｎ１４１Ｉ）であることを確認した。
【００２３】次に、組換えベクターｐＣＡＧＧＳのインサートに、ＣＭＶ−ＩＥエンハンサー配列、ニワトリβアクチン・プロモーターおよびウサギβグロビン・ポリアデニレーションシグナルを挿入結合し、導入遺伝子を構築した。この導入遺伝子をベクターから切り出し、ゲル電気泳動により精製したのち、マイクロインジェクション法によってマウス胚に注入した。マウス胚は、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）ＪまたはＤＢＦ１（雌）とＢ６Ｎ（雄）との交配によって得た。遺伝子導入胚は、定法に従って仮親の卵管に移植し、個体へと発生させ、出生させた。
【００２４】得られたマウス個体の尾部からＤＮＡを抽出し、導入遺伝子断片の両端配列に基づき合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲアッセイにより、初代トランスジェニックマウスを選別した。その結果、野生型ＰＳ２ｃＤＮＡを保有する初代トランスジェニックマウスと、変異型ＰＳ２ｃＤＮＡを保有する初代トランスジェニックマウスがそれぞれ１匹ずつ得られた。これらの初代トランスジェニックマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊと戻交配し、ヒト野生型ＰＳ２ｃＤＮＡを保有するトランスジェニックマウスの２系統（Ｗ１およびＷ２）と、ヒト変異型ＰＳ２ｃＤＮＡを保有する２系統（Ｍ１およびＭ２）を作成した。
（２）トランスジェニックマウスの遺伝子発現の検討トランスジェニックマウスの脳内における導入遺伝子の発現の程度を逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により８ヶ月齢の時点で調べた。その結果、野生型マウスの内在性マウスＰＳ２ｍＲＮＡの発現量は、検出可能ではあるが極わずかであるのに対し、トランスジェニックマウス４系統では、いずれも導入ＰＳ２ｍＲＮＡの発現量の増大が確認された。また、その発現量は、野生型マウスに比べて５倍（Ｍ２）から１５倍（Ｗ１）であった。また、Ｗ２およびＭ１系統は、導入ＰＳ２ｍＲＮＡの発現レベルがほぼ同一であった。なお、導入遺伝子の有無は内在性のマウスＰＳ１またはＰＳ２ｍＲＮＡのレベルには影響を及していなかった。
【００２５】以上の結果から、得られたトランスジェニックマウスは、ヒト野生型ＰＳ２および変異型ＰＳ２をそれぞれ脳内で過剰生産していることが確認された。
（３）トランスジェニックマウスの脳内でのＡβ４０およびＡβ４２のレベルの検討トランスジェニックマウスＷ２およびＭ１の２、５、および８ヶ月齢の時点での脳可溶性画分におけるＡβ４０およびＡβ４２レベルをイムノアッセイ（ＥＩＡ）法により調べた。結果は表１に示したとおりである。
【００２６】この表１の結果からも明らかなように、ヒト変異型ＰＳ２トランスジェニックマウス（Ｍ１）は、コントロール（野生型マウス：Non-Tg）およびヒト野生型ＰＳ２トランスジェニックマウス（Ｗ２）に比べて脳内Ａβ４２量が多いことが確認された。特に、Ｗ２におけるＡβ４２レベルは５ヶ月齢以降わずかに増加するのに対し、Ｍ１におけるＡβ４２レベルは加齢にしたがって顕著に増加した。これらのことから、ヒト変異型ＰＳ２トランスジェニックマウス脳では、加齢に伴ってＡβ４２量を増大させることが確認された。
【００２７】
【表１】
【００２８】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明によって、ヒトＰＳ２遺伝子またはその変異遺伝子を保有するトランスジェニック動物が提供される。これらの動物によって、ＡＤの病因および病態解析、並びにその治療薬剤等の開発が促進される。
【００２９】
【配列表】
配列番号：１配列の長さ：30配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列 CCCGCCGGAA TTCCAGAGGC AGGGCTATGC 30配列番号：２配列の長さ：30配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列 CCCGCCGAGA TTCAGATGTA GAGCTGATGG 30 |
| 【出願人】 |
【識別番号】３９６０２０８００
【氏名又は名称】科学技術振興事業団
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| 【出願日】 |
平成９年（１９９７）１１月１７日 |
| 【代理人】 |
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 利夫
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| 【公開番号】 |
特開平１１−１４６７４３ |
| 【公開日】 |
平成１１年（１９９９）６月２日 |
| 【出願番号】 |
特願平９−３１５３４６ |
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