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【発明の名称】 抗ウイルス剤と抗菌剤
【発明者】 【氏名】平井 圭一

【氏名】小山 淳子

【氏名】竹上 勉

【目的】
【構成】
【特許請求の範囲】
【請求項1】 次式【化1】

で表わされ、式中のRが、次の【化2】

(R′は、水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、またはアルコキシアルキル基を示す)のいずれかであるか、または隣接したものが酸素原子を介して異項炭素環を形成していてもよいフラノナフトキノン誘導体を有効活性成分として含有することを特徴とする抗ウイルス剤。
【請求項2】 次式【化3】

で表わされ、式中のRが、次の【化4】

(R′は、水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基またはアルコキシアルキル基を示す)のいずれかであるか、または隣接したものが酸素原子を介して異項炭素環を形成していてもよいフラノナフトキノン誘導体を有効活性成分として含有することを特徴とする抗菌剤。
【発明の詳細な説明】【0001】
【発明の属する技術分野】この発明は、抗ウイルス剤と抗菌剤に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、優れた活性を有するフラノナフトキノン誘導体を有効成分とする新規な抗ウイルス剤と抗菌剤に関するものである。
【0002】
【従来の技術とその課題】RNAウイルスの感染によって起こる疾患には、日本脳炎、デング熱、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、インフルエンザ、A型肝炎、C型肝炎、黄熱病、出血熱、髄膜炎、小児性下痢症、狂犬病、エボラ出血熱、ラッサ熱、ポリオ、セントルイス脳炎、成人T細胞白血病、エイズ等があり、さらにRNAウイルス感染が原因と推定されている難治性疾患としては、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、亜急性硬化性全脳炎、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎、クローン病、川崎病、糖尿病等があることが知られている。しかしながら、現状においては、RNAウイルス感染病に対して有効な化学治療薬はほとんど見出されていない。
【0003】実際にも、たとえば日本脳炎、インフルエンザ、麻疹、風疹、流行性耳下腺炎、ポリオ等の関連ウイルスが特定されているものについては、不活化ワクチンや生ワクチンを用いる予防治療がなされるのみであり(狂犬病は血清療法)、発症した場合の治療効果は低いのが実情である。また、非特異的な生体内抵抗物質であるインターフェロン(IFN)が現在最も有効な抗ウイルス剤として知られているが、このものは宿主細胞に対する毒性があり、発熱、全身倦怠感、頭痛、食欲不振、白血球血小板減少、中枢神経障害等の副作用が大きいという問題がある。
【0004】さらに、抗RNAウイルス化学療法剤としてはリバビリン、アマンタジンが知られているが、その効果は低く、細胞毒性に伴う不眠、神経過敏等の副作用が強い。このため、RNAウイルス感染病に対して優れた抗ウイルス活性を有し、しかも、細胞、生体組織に対する副作用の少ない有効な治療薬の出現が待たれている状況にある。
【0005】そして、さらには、RNAウイルス感染病だけでなく、細菌感染に対しての防御性、つまり抗菌活性をも有し、広い範囲の感染病に対して有効な化学治療剤の出現が待たれてもいた。
【0006】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記のとおりの課題を解決するものとして、次式【0007】
【化5】

【0008】で表わされ、式中のRが、次の【0009】
【化6】

【0010】(R′は、水素原子、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、またはアルコキシアルキル基を示す)のいずれかであるか、または隣接したものが酸素原子を介して異項炭素環を形成していてもよいフラノナフトキノン誘導体を有効活性成分として含有することを特徴とする抗ウイルス剤、そして抗菌剤を提供する。
【0011】
【発明の実施の形態】上記のとおりのフラノナフトキノン誘導体を有効活性成分とするこの発明の抗ウイルス剤および抗菌剤については、広範囲のフラノナフトキノン誘導体が用いられることになる。これらを例示すると、たとえば、2−メチルナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオン、2−アセチルナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオン、2−(1−ヒドロキシエチル)ナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオン、ナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオン、5(または8)−ヒドロキシ−2−(1−ヒドロキシエチル)ナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオン、5(または8)−ヒドロキシナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオン、2−メチル−5(または8)−ヒドロキシ−2−メチルナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオン、1,3−ジメチルイソフラノナフトキノン、2−(アセチルエチレンアセタール)ナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオン、8−ヒドロキシ−7−メトキシナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオン、3−アセチル−5,8−ジメトキシ−2−メチルナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオン等々が挙げられる。もちろん、これら例示に何ら限定されることなく、前記の式により表わされる様々な態様がこの発明には可能である。そして、前記式におけるアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシアルキル基については、活性を阻害しない限り、他の任意の置換基、たとえばアルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基、ハロゲン原子、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、チオール基、チオエーテル基、カルボキシル基、エステル基、アミド基、スルホニル基、ハロホルミル基、複素環基等々が結合されていてもよい。
【0012】これらの各種の化合物は、これまで公知の様々な化学的合成の手法、あるいは天然物としての樹皮等からのフラノナフトキノン類の抽出等によって製造することができる。そして、この発明の抗ウイルス剤は、たとえば、RNAウイルス全般を対象とすることができ、たとえば、適用し得る疾患としては、日本脳炎、デング熱、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、インフルエンザ、A型肝炎、C型肝炎、黄熱病、出血熱、髄膜炎、小児性下痢症、狂犬病、エボラ出血熱、ラッサ熱、ポリオ、セントルイス脳炎、成人T細胞白血病、エイズ等のRNAウイルスが原因となる疾患及びRNAウイルス感染が原因と推定されている慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、亜急性硬化性全脳炎、アルツハイマー病、潰瘍性大腸炎、クローン病、川崎病、糖尿病等の難治性疾患等が例示される。
【0013】また抗菌剤についても、広い対象を有し、真菌類、グラム陰性菌等々について優れた抗菌作用を示す。このようなこの発明の抗ウイルス剤、および抗菌剤は、液剤、固形剤等の様々な剤形において、経口、皮下、静脈、外用等の各種の方法によって処方することができる。当然、その際には、従来公知の配合成分を添加し、塩、エステル等の保護剤をはじめ各種の態様として薬剤組成を構成することができる。
【0014】そこで、以下、実施例を示し、この実施例に沿ってさらに詳しくこの発明について説明する。
【0015】
【実施例】
実施例1(2−(1−ヒドロキシエチル)ナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオンの製造)
sec−BuLiを用いたメタレーション反応により合成した。すなわち、N,N−ジエチルベンズアミドに、エーテル中(又はTHF中)、−78℃でsec−BuLi(1eq.)とTMEDA(1eq.)を1時間反応させる。次に−78℃で5−(1−ヒドロキシエチル)−3−フルアルデヒド誘導体(1eq.)を滴下し、さらにsec−BuLi(4eq.)を加え徐々に室温にもどし、1晩攪拌を続ける。水を加えクロロホルム抽出し、クロロホルム層を飽和NaCl水で洗った後、乾燥留去する。残渣をPTLC(クロロホルム:アセトン=100:1)により分離精製し、保護基を除去し、次式の化合物の黄色結晶を得た。
【0016】
【化7】

【0017】実施例2(2−メチルナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオンの製造)
2−ヒドロキシ−1,4−ナフトキノンとプロピオンアルデヒドから合成した2−ヒドロキシ−3−(2−プロペニル)−1,4−ナフトキノン(150mg)とDDQ(200mg)をベンゼン(20ml)中攪拌、還流する。2〜3時間後、冷却し、濾過して濾液を留去する。残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル30g、ベンゼン)にかけ、最初の黄色分画より目的の次式化合物を黄色結晶として得た(35%)。
【0018】
【化8】

【0019】
【表1】

【0020】実施例3(A)8−ヒドロキシナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオン、および(B)8−ヒドロキシ−2−メチルナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオンの製造)
塩化アルミニウム(2.5g)と無水3−ヒドロキシフタル酸(1g)をニトロベンゼン(5ml)に加え、アセチルフラン(0.7g)または2−アセチル−5−メチルフランを滴下し100℃で一晩加熱する。その後、クロロホルム抽出しニトロベンゼンを減圧留去した後カラムクロマトグラフィー(シリカゲル50g、ベンゼン)にかけ、精製し、次式化合物の黄色結晶を得た(〜5%)。
【0021】
【化9】

【0022】
【表2】

【0023】
【化10】

【0024】
【表3】

【0025】実施例4(5−ヒドロキシ−2−(1−ヒドロキシエチル)ナフト〔2,3−b〕フラン−4,9−ジオンの製造)
Tecomaipe 乾燥樹皮(ブラジル産)10kgを純メタノール10l宛で30分3回加温還流下に抽出し、溶媒を減圧留去した。抽出物(1.45kg)をクロロホルム4l宛で3回冷浸し、クロロホルム層を水洗後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去して抽出物10gを得た。これをトルエン・酢酸エチルエステル(4:1)を展開溶媒としてシリカゲル60F254 を用いて分離薄層クロマトグラフィーを反復して行い、Rf=0.24のスポットを抽出、クロロホルム−メタノール(9:1)で抽出し計8mgの次式化合物を得た(融点181℃)。
【0026】
【化11】

【0027】実施例5(抗ウイルス剤)
<A>試験材料ウイルス:日本脳炎ウイルス(JEV)JaGAr−01株を用いた。
細胞:ウイルス感染用細胞として、サル腎臓細胞株Vero細胞を用い、5%牛胎仔血清を含むDMEM培地で37℃、5%CO2 存在下に培養した。
<B>試験方法ウイルス感染とフラノナフトキノン誘導体による阻害:単層培養のVero細胞にJEVを10m.o.j.のウイルス量で感染させ、培養した。フラノナフトキノン誘導体はウイルス感染直後に添加し、ウイルス増殖を示す培養液中への放出ウイルス量に対する影響を調べた。
【0028】ウイルス量の測定:増殖したウイルス力価はBHK細胞を用いたプラーク法にて測定し、プラーク形成単位(PFU)で表わした。
細胞変性効果:ウイルスに感染した細胞が特異な円形顆粒状を呈することを利用して、ウイルス感染性を示す細胞変性効果(CPE)を測定した。
<C>試験結果培養液中に放出されたJEVを感染24時間後に採取し、その力価を測定することによって、ウイルス増殖の阻害を調べた。前記実施例2の化合物による各種濃度での結果を示したものが表4である。
【0029】この表4のとおり、JEV増殖は濃度依存性に阻害され、50%増殖を阻害する濃度(IC50)は0.04μg/mlであった。3.3μg/mlでJEVの増殖は約90%阻害され、10μg/mlで98%阻害された。このような高い濃度でも宿主のVero細胞に対する細胞毒性は観察されず、また、ウイルス感染によって生じるCPEも認められなかった。
【0030】
【表4】

【0031】実施例1、2、および3の化合物を用いた場合の3.3μg/ml濃度付近での結果を示したものが表5である。75%〜94%のJEV増殖阻害効果を示した。さらに実施例1および2の化合物については薬剤による細胞毒性が観察されなかった。
【0032】
【表5】

【0033】なお、参考のためにインターフェロン(IFN)をポジティブコントロールとして用いた場合の結果を示したものが表6である。IFNは濃度依存性にJEVの増殖を阻害した。また、抗菌剤OFLXの抗ウイルス活性をJEV増殖系でネガティブコントロールとして調査したが、宿主細胞に対する細胞毒性が生じる高濃度(100μg/ml)においても、顕著なJEV増殖阻害活性は認められなかった。
【0034】
【表6】

【0035】JEVはフラビウイルス科に属するRNAウイルスであり、現在不活化ワクチンを用いた予防法のみがある。しかし近縁ウイルスだけに限ってみても、依然として猛威をふるっているデングウイルスには有効なワクチンはなく、C型肝炎ウイルスの場合はその世界的な広がりからみてさらに深刻である。このような状況において、たとえば実施例2の化合物をはじめとするこの発明のフラノナフトキノン誘導体は、以上の結果からも、宿主細胞に対する細胞毒性なしにJEVに強い抗ウイルス活性を示し、RNAウイルスに対する有効な抗ウイルス剤であることが確認された。
実施例6(抗菌剤)
<A>試験材料白癬菌のTrichophyton rubrum とカンジダ真菌Candida albicansを用いた。
<B>試験方法白癬菌の増殖阻止試験:サブローブドウ糖寒天培地に一定量の薬剤を加え、25℃で7日間培養したとき、寒天培地表面に生じる白癬菌コロニー数を計測し、50%成長阻止する薬剤濃度(LD50)を算定した。
【0036】カンジダ菌の増殖阻止試験:サブローブドウ糖ブイヨン培地に一定量の薬剤を加え、25℃で5日間培養したとき、増殖する菌量を濁度法にて計測し、50%成長阻止する薬剤濃度(LD50)を算定した。
<C>試験結果前記実施例3Bと実施例4の化合物を用いた場合の結果を示したものが表7および表8である。
【0037】この表7および表8に示したとおり、両化合物は、濃度依存性に白癬菌の増殖を阻止した。50%増殖を阻止するLD50値は、実施例4の化合物が0.070μg/ml、実施例3Bの化合物が0.81μg/mlと微量で有効であり、Candida 菌に対する実施例4の化合物のLD50値43μg/ml、実施例3Bの化合物の498μg/mlに比べ、約600倍白癬菌に対し強い抗菌作用を有している。
【0038】
【表7】

【0039】
【表8】

【0040】以上のとおり、この発明のフラノナフトキノン誘導体は真菌に対し抗菌作用を示した。特に、この発明の化合物は、皮膚糸状真菌である白癬菌に対する抗菌作用に優れており、皮膚痒癬症に対する治療薬として有用であることがわかる。
実施例7(抗菌剤)
<A>試験材料病原菌として、ヘリコバクター・ピロリ Helicobacter pylori NCTC11637(ヒト)
ヘリコバクター・フィリス Helicobacter feris(ネコ)
カンピロバクター・ジェジュニ Campylobacter jejuni白癬菌T.メンタグロフィテス Trichophyton mentagrophytes白癬菌T.ルブルム Trichophyton rubrumを用いた。
【0041】コントロールの常在菌として、大腸菌 Escherichia coli表層ブドウ球菌 Staphylococcus epidermisカンジダ真菌 Candida albicansを用いた。
<B>試験方法馬血清5%を含むBrucella寒天培地に一定量の薬剤を加え、24ウエルプレートに固めた後、1ウエル当たり約105 菌を接種した。ガスパック法で37℃、2日間培養後、550nmの吸光度によりコントロールに対する培殖率を測定し、菌の増殖を100%抑制する薬剤の最小濃度MIC(minimum inhibitory concentration)を算定した。
【0042】実施例2、実施例4、そして実施例3A、3Bの化合物を用いた結果を示したものが表9である。この表9に示したとおり、実施例2および実施例3A、3Bの化合物は、極低濃度(0.035〜0.07μg/ml)でヘリコバクターの増殖を完全に抑制し、0.63〜1.25μg/mlでカンピロバクターの増殖を完全に抑制した。また、実施例2および実施例3A、3Bの化合物は、6.25μg/mlで白癬菌の増殖を完全に抑制し、実施例4の化合物は0.5μg/mlで増殖を完全に抑制した。
【0043】コントロールの大腸菌、表層ブドウ球菌の増殖を完全に抑制するには実施例2および実施例3Bの化合物とも25〜100μg/mlを要した。以上の結果から、この発明のフラノナフトキノン誘導体はヘリコバクター、カンピロバクター、白癬菌に対し強い選択的抗菌作用を有すること明らかになった。
【0044】
【表9】

【0045】カンピロバクターは腸炎の原因菌であり、ヘリコバクターは最近胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌の原因菌としての可能性が指摘されており、白癬菌は水虫の原因菌でありこれら疾患の予防治療の両面からフラノナフトキノン誘導体の抗菌作用は重要である。胃液には数mMの尿素が含まれており胃や十二指腸内の生理的環境の保全に役立っているが、ヘリコバクターが胃に感染すると、この菌がもつ強いウレアーゼ活性が尿素を分解しアンモニアを生成することで菌周囲の胃酸を中和し、そこに定着する。その結果、定着したヘリコバクターが生成するアンモニアが胃や十二指腸粘膜を障害して潰瘍や胃癌の発生原因を作るとともに、血中アンモニア濃度が高まり、肝障害患者においてはその障害を助長する。現在プロトンポンプ阻害剤オメプラゾール、ランソプラゾールなどがヘリコバクター感染の胃炎、胃潰瘍、カンピロバクター腸炎の除菌治療薬として用いられているが、それらのMICは数μg/mlと高く、副作用(じんま疹、肝障害、下痢、便秘、悪心、嘔吐、頭痛、胎児毒性等)があるが、この発明の場合にはこのような心配は顕著に軽減される。
【0046】実際、この発明のフラノナフトキノン誘導体の培養ヒト正常細胞の増殖を完全に抑制する濃度は20〜50μg/mlであって、ヘリコバクター、カンピロバクター、白癬菌に比べ約20分の1〜100分の1と低い。このため、細胞毒性の低いフラノナフトキノン誘導体の有用性が期待される。
【0047】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明により、抗ウイルス活性、抗菌活性に優れ、しかも副作用の少ないフラノナフトキノン誘導体からなる抗ウイルス剤並びに抗菌剤が提供される。
【出願人】 【識別番号】396020800
【氏名又は名称】科学技術振興事業団
【出願日】 平成8年(1996)3月18日
【代理人】 【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 利夫
【公開番号】 特開平9−249560
【公開日】 平成9年(1997)9月22日
【出願番号】 特願平8−60681