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【発明の名称】 ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その製造法および用途
【発明者】 【氏名】音田 治夫

【氏名】大儀 和宏

【氏名】日沼 州司

【氏名】増尾 好則

【目的】
【構成】 ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNA、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の製造法、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞もしくはその細胞膜画分、ヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニスト/アンタゴニストのスクリーニング方法ならびにスクリーニング用キット、該スクリーニング方法によって得られるヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニスト、および該アゴニストまたはアンタゴニストを含有する医薬組成物。
【特許請求の範囲】
【請求項1】配列番号:1で表わされるアミノ酸配列を含有することを特徴とするヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質またはその塩。
【請求項2】請求項1記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項3】請求項1記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAを含有するDNA。
【請求項4】配列番号:2で表わされる塩基配列を有する請求項3記載のDNA。
【請求項5】請求項3記載のDNAを含有するベクター。
【請求項6】請求項5記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項7】請求項6記載の形質転換体を、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAの発現が可能な条件下で培養することを特徴とする請求項1記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の製造法。
【請求項8】請求項1記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分。
【請求項9】請求項1記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、請求項2記載の部分ペプチドもしくはその塩、または請求項8記載の細胞もしくはその細胞膜画分を用いることを特徴とするヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項10】請求項1記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、請求項2記載の部分ペプチドもしくはその塩、または請求項8記載の細胞もしくはその細胞膜画分を含有することを特徴とするヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット。
【請求項11】請求項9記載のスクリーニング方法または請求項10記載のスクリーニング用キットを用いて得られるヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニスト。
【請求項12】請求項9記載のスクリーニング方法または請求項10記載のスクリーニング用キットを用いて得られるヒト・ニューロテンシンレセプターアンタゴニスト。
【請求項13】請求項11記載のヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストを含有することを特徴とするパーキンソン病、鬱病、痴呆症、多動児性症候群もしくは意識障害の予防・治療剤または拒食性誘発剤。
【請求項14】請求項12記載のヒト・ニューロテンシンレセプターアンタゴニストを含有することを特徴とする逆行性食道炎、腸炎、すい炎、潰瘍、胃癌、腸癌、精神病、ハンチントン病もしくは躁病の予防・治療剤、抗不安剤または催眠鎮静剤。
【請求項15】請求項1記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩または請求項2記載の部分ペプチドもしくはその塩に対する抗体。
【発明の詳細な説明】【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチド、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNA、該DNAを保持するベクター、該ベクター保持する形質転換体、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の製造法、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を用いるヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニスト/アンタゴニストのスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法で得られるアゴニストまたはアンタゴニスト、および該アゴニストまたはアンタゴニストを含有する医薬組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】ニューロテンシンは、最初、ウシ視床下部から単離されたアミノ酸13個からなるペプチドで〔Caraway, R. and Leeman, S.E. ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.) 248, 6854-6861 (1973)〕、当初はその強力な血圧降下作用と腸管作用とからホルモンとしての側面が強調された〔Berelowlts, M. et al. ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー(J. Neurochem.) 31, 751-753 (1978), Carraway, R. and Leeman, S.E. ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.) 250, 1907-1911 (1975)〕。しかし、中枢神経系におけるニューロテンシンの局在が明らかにされ〔Kobayashi, R.M. et al. ブレイン・リサーチ(Brain Res.) 122, 578-581 (1977)〕、さらに、単一ニューロンに対する興奮性〔Miletic, V. and Randic, M. ブレイン・リサーチ(Brain Res.) 169, 600-604 (1979)〕あるいは抑制性〔MaCarthy, P.S. et al. ゼネラル・ファルマコロジー(Gen. Pharmacol.) 10, 331-333 (1979)〕の作用があることが知られるに至り、神経伝達物質としての可能性が示唆されてきている。また、黒質や腹側被蓋野(A9,A10)に存在するドーパミン作動性神経にはニューロテンシンが共存することが知られており〔Hokfelt,T. et al. ジャーナル・オブ・コンパラティブ・ニューロロジー(J. Comparative Neurology) 222, 543-559 (1984)〕、ニューロテンシンによるドーパミンニューロンの制御という点で注目される。
【0003】最近、ニューロテンシンはNGFなどの成長因子と同様に、そのレセプターを介して細胞内に取り込まれ神経軸索内を逆行性に神経細胞体に向けて輸送されることが示された〔Castel, M.N. et al. ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー(J. Neurochem.)56, 1816-1818 (1991),Castel, M.N. et al. ニューロサイエンス(Neuroscience) 36, 425-430 (1990)〕。また、ニューロテンシンは神経栄養因子または維持因子として機能するという報告がなされ、注目されている。その一方、ニューロテンシンレセプター蛋白質は、放射性リガンドを用いたバインディングオートラジオグラフィー等により、中枢神経系では、中脳黒質や腹側被蓋野、対角帯核に存在することがわかっている〔Moyse, E. et al. ニューロサイエンス(Neuroscience)22, 525-536 (1987)〕。特に、黒質-線条体系に存在するドーパミン作動性神経にはニューロテンシン結合部位が存在し〔Masuo,Y. et al. ブレイン・リサーチ(Brain Res.) 510, 203-210 (1990)〕、これらのレセプターを介して、ニューロテンシンによるドーパミン作動性神経の賦活作用が惹起されるものと考えられている。また、末梢では十二指腸、小腸、結腸などの腸管に存在しており、水分、電解質の分泌に関与しているとされている。最近、種々のヒト大腸癌由来の細胞で非常に多くのニューロテンシンレセプター蛋白質が発現していることが判明し〔Maoret, J.-J. et al. バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commun.) 203, 465-471 (1994)〕、それとともに、ニューロテンシンがある種の大腸癌の生育を促進することも報告された〔Yoshinaga, K. et al.サージェイン・オンコロジー(Surg. Oncol.) 1, 127-134 (1992)〕。これらのことより、ニューロテンシンの作用を増強あるいは遮断する薬剤の開発は様々な疾病に有効であると考えられる。
【0004】一般に、ある生理活性物質のアゴニストやアンタゴニストを開発する場合、該生理活性物質が特異的に結合するレセプターと親和性の高い化合物の探索が行われている。ニューロテンシンレセプター蛋白質としては、現在、ウシあるいはラットの全脳膜画分が用いられているが、動物種が異なるために、その膜画分に対して高親和性であった化合物が、ヒトのニューロテンシンレセプターに対しても高親和性であるという保証は得られない。また、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質として、ヒト colon adenocarcinoma HT-29細胞の膜画分が用いられているが、この細胞はニューロテンシンレセプターの発現量が少ない上に、その他VIPレセプターなど多くのレセプターを発現しているために、純粋な形でのヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質ではなく、アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングには不適切である。ラット・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAは既にクローニングされており、COS細胞での発現が報告されているが〔Tanaka K. et al. ニューロン(Neuron)4巻, 847-854頁 (1990)〕、ラット・ニューロテンシンレセプター蛋白質を用いてスクリーニングされたアゴニスト/アンタゴニストが、ヒトに対しても効果があるという保証はない。
【0005】ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAも既にクローニングされており、COS-7細胞での発現も報告されているが〔Vita, N. et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317巻, 139-142頁 (1993)〕、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の発現量が低く、また一過性の発現であるために、スクリーニングには不適切であると考えられる。このように、従来の方法で製造されたヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質は、スクリーニングに用いるためのレセプター標品としては不十分であった。したがって、より実用的な・ニューロテンシンレセプター蛋白質の製造方法の確立が望まれていた。ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を使用してヒト・ニューロテンシンレセプターのアゴニスト/アンタゴニストをスクリーニングすることができれば、実験動物を用いることの欠点(例えば、種が異なることにより、ヒトに対して効果を発揮できない化合物が得られる可能性があることなど)を克服することができ、ヒトに対して有効な医薬の開発が効率よく行えるようになると期待される。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチド、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNA、該DNAを保持するベクター、該ベクターを保持する形質転換体、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の製造法、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を用いるヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニスト/アンタゴニストのスクリーニング方法、該スクリーニング用キット、該スクリーニング方法で得られるアゴニストまたはアンタゴニスト、および該アゴニストまたはアンタゴニストを含有する医薬組成物を提供することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課題に鑑み、鋭意研究した結果、公知のラット・ニューロテンシンレセプター蛋白質のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するが、公知のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質とは異なるアミノ酸配列を有する新規なヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAをクローニングすることに成功した。公知のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質のアミノ酸配列の第200番目のアミノ酸がThrであるのに対して、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質のアミノ酸配列(配列番号:1および図1)の第200番目のアミノ酸はAlaである。また、公知のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAの塩基配列のうち、該ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の第63番目および第200番目のアミノ酸をコードする塩基配列がそれぞれ63Lys(AAA)および200Thr(ACG)であるのに対して、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAの塩基配列のうち、該ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の第63番目および第200番目のアミノ酸をコードする塩基配列がそれぞれ63Lys(AAG)および200Ala(GCG)である。
【0008】さらに、本発明者らは、公知のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を発現しているCOS-7細胞(Vita, N. et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317巻, 139-142頁 (1993))に比べて、本発明ののヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をはるかに大量に発現する細胞株を製造することに成功した。そして、該細胞株または本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドを用いることにより効率よく確実にヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニスト/アンタゴニストをスクリーニングできることを見いだした。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【0009】すなわち、本発明は、(1)配列番号:1で表わされるアミノ酸配列を含有することを特徴とするヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質またはその塩、(2)第(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、(3)第(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAを含有するDNA、(4)配列番号:2で表わされる塩基配列を有する第(3)項記載のDNA、(5)第(3)項記載のDNAを含有するベクター、(6)第(5)項記載のベクターを保持する形質転換体、(7)第(6)項記載の形質転換体を、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAの発現が可能な条件下で培養することを特徴とする第(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の製造法、(8)第(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分、(9)第(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、第(2)項記載の部分ペプチドもしくはその塩、または第(8)項記載の細胞もしくはその細胞膜画分を用いることを特徴とするヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、【0010】(10)第(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、第(2)項記載の部分ペプチドもしくはその塩、または第(8)項記載の細胞もしくはその細胞膜画分を含有することを特徴とするヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング用キット、(11)第(9)項記載のスクリーニング方法または第(10)項記載のスクリーニング用キットを用いて得られるヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニスト、(12)第(9)項記載のスクリーニング方法または第(10)項記載のスクリーニング用キットを用いて得られるヒト・ニューロテンシンレセプターアンタゴニスト、(13)第(11)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストを含有することを特徴とするパーキンソン病、鬱病、痴呆症、多動児性症候群もしくは意識障害の予防・治療剤または拒食性誘発剤、(14)第(12)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプターアンタゴニストを含有することを特徴とする逆行性食道炎、腸炎、すい炎、潰瘍、胃癌、腸癌、精神病、ハンチントン病もしくは躁病の予防・治療剤、抗不安剤または催眠鎮静剤、(15)第(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩または請求項2記載の部分ペプチドもしくはその塩に対する抗体を提供する。
【0011】より具体的には、本発明は、(16)部分ペプチドが、第(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質分子のうち細胞膜の外に露出している部分ペプチドである第(2)項記載の部分ペプチド、(17)ベクターがpTS861で標示されるヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の発現ベクターである第(5)項記載のベクター、(18)形質転換体がCHO細胞である第(6)項記載の形質転換体、(19)CHO細胞がCHO/pTS861-1-2E6またはCHO/pTS861-24-2C5で標示されるCHO細胞である第(16)項記載のCHO細胞、(20)細胞がCHO/pTS861-1-2E6またはCHO/pTS861-24-2C5で標示されるCHO細胞である第(8)項記載の細胞またはその細胞膜画分、【0012】(21)(i)第(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、または第(2)項記載の部分ペプチドもしくはその塩に、ニューロテンシンを接触させた場合と(ii)第(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、または第(2)項記載の部分ペプチドもしくはその塩に、ニューロテンシンおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする第(9)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、(22)(i)標識したニューロテンシンを第(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、または第(2)項記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合と、(ii)標識したニューロテンシンおよび試験化合物を第(1)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、または第(2)項記載の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、標識したニューロテンシンの該ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする第(9)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、(23)(i)標識したニューロテンシンを、第(8)項記載の細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、(ii)標識したニューロテンシンおよび試験化合物を第(8)項記載の細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする第(9)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、【0013】(24)(i)標識したニューロテンシンを、第(8)項記載の細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、(ii)標識したニューロテンシンおよび試験化合物を第(8)項記載の細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、標識したニューロテンシンの該細胞またはその細胞膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする第(9)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、(25)(i)ニューロテンシンを、第(8)項記載の細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、(ii)ニューロテンシンおよび試験化合物を第(8)項記載の細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、組換え型ヒト・ニューロテンシンレセプターを介した細胞刺激活性(例えば、ドーパミンの遊離、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+濃度の変動、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下、細胞遊走活性などを促進する活性または抑制する活性など)を測定し、比較することを特徴とする第(9)項記載のヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、(26)第(3)項記載のDNAを含有することを特徴とするニューロテンシンレセプター蛋白質欠損症の予防・治療剤、および(27)ニューロテンシンレセプター蛋白質欠損症がパーキンソン病である第(24)項記載の予防・治療剤を提供する。
【0014】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質としては、ヒトのあらゆる組織(例えば、胃、下垂体、膵臓、脳(全脳、中脳黒質など)、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管、血管、心臓など)または細胞などに由来するヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質であって、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものであれば何なるものであってもよい。すなわち、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質としては、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質などの他に、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列と約90〜99.9%の相同性を有するアミノ酸配列を含有し、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが挙げられる。実質的に同質の活性としては、例えばリガンド結合活性、シグナル情報伝達などが挙げられる。実質的に同質とは、リガンド結合活性などが性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性の強さなどの強弱、レセプター蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【0015】より具体的には、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質としては、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列を含有することを特徴とするヒト由来のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質などが挙げられる。また、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質としては、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列中の1または2個以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列に1または2個以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列中の1または2個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども挙げられる。さらに、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質には、N末端のMetが保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アシル基など)で保護されているもの、GluのN端側が生体内で切断され、該Gluがピログルタミン化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アシル基など)で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【0016】ただし、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列の第200番目のAlaがThrに置換されたアミノ酸配列を有するヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質〔Vita, N. et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317, 139-142 (1993)〕は本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の範囲から除かれる。本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)との塩などが用いられる。本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質またはその塩は、温血動物の組織または細胞から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することもできるし、後述するヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
【0017】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドとしては、例えば、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位などが用いられる。具体的には、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の疎水性プロット解析において細胞外領域(親水性(Hydrophilic)部位)であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性(Hydrophobic)部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでも良い。本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドの塩としては、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)との塩などが用いられる。
【0018】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドまたはその塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明の蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下の■〜■に記載された方法が挙げられる■M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)■SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)■泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験 丸善(株) (1975年)
■矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV 205、(1977年)■矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のタンパク質を精製単離することができる。上記方法で得られる蛋白質が遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【0019】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAとしては、本発明の配列番号:1のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質(ただし、配列番号:1で表わされるアミノ酸配列の第200番目のAlaがThrに置換されたアミノ酸配列を有するヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質〔Vita, N. et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317, 139-142 (1993)〕を除く)をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムDNA、組織・細胞由来のcDNA、合成DNAのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、組織・細胞よりmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(以下、RT-PCR法と略称する。)によって増幅することもできる。より具体的には、配列番号:1のアミノ酸配列を含有するヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAとしては、配列番号:2で表わされる塩基配列を有するDNAなどが用いられる。クローン化されたヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することもできる。
【0020】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAを含有するベクター(特に、発現プラスミド)は、例えば、(イ)本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、(ロ)該DNA断片を適当な発現プラスミド中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13)、枯草菌由来のプラスミド(例、pUB110,pTP5,pC194)、酵母由来プラスミド(例、pSH19,pSH15)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス,ワクシニアウイルス,バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌である場合は、trp プロモーター、lac プロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lpp プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
【0021】宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SRαプロモーターなどがそれぞれ利用できる。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的である。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質のN端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、アルカリフォスファターゼ・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
【0022】さらに、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAを含有するベクターのうち、発現プラスミドの好ましい構築方法を以下に示す。プラスミドとしては、pAKKO 1.11(pA1-11と表記する場合もある)、pRc/CMV、pRc/RSVなどが用いられ、なかでもpAKKO1.11(pA1-11)などが好ましい。プロモーターとしては、宿主となる細胞で効率よく機能するものであれば何でもよく、SV40初期プロモーター、CMVプロモーター、HSV-TKプロモーター、SRαプロモーター、RSVプロモーターなどが挙げられ、なかでもCMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましく、特にSRαプロモーターが好ましい。発現プラスミドには、以上の他にエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー等を含有しているものを用いるのが好ましい。選択マーカーとしては、ジヒドロ葉酸還元酵素(以下、dhfrと略称する場合がある)遺伝子、ネオマイシンリン酸転移酵素(以下、neo遺伝子と略称する場合がある)などが挙げらる。dhfr遺伝子はメソトレキセート(MTX)耐性を与え、neo遺伝子はG−418耐性を与える。特に、dhfr遺伝子が欠損しているCHO細胞を用いて、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
【0023】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAを保持する好ましい発現プラスミドとしては、具体的には、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAの上流に前記のプロモーター(特に、SRαプロモーターなど)を挿入し、好ましくはヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAの下流にSV初期遺伝子ポリA付加シグナルを挿入し、さらにそのポリA付加シグナルの下流にdhfr遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などを挿入したものなどが好ましい。より具体的には、例えばヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAの上流にSRαプロモーターを挿入し、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAの下流にSV初期遺伝子ポリA付加シグナルを挿入し、その下流にdhfr遺伝子を挿入し、さらにその下流にアンピシリン耐性遺伝子を挿入したpTS861で標示される発現プラスミド〔図4〕などが好適である。このようにして作製したヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAを含有する発現プラスミドを宿主細胞に導入することによって、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAを高発現できる細胞を作製することができる。
【0024】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAを含有するベクターを導入する宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌、バチルス属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),60巻,160(1968)〕,JM103〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ,(Nucleic Acids Research),9巻,309(1981)〕,JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal ofMolecular Biology)〕,120巻,517(1978)〕,HB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー,41巻,459(1969)〕,C600〔ジェネティックス(Genetics),39巻,440(1954)〕などが用いられる。バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチルス(Bacillus subtilis)MI114〔ジーン,24巻,255(1983)〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry),95巻,87(1984)〕などが用いられる。酵母としては、たとえばサッカロマイセス セレビシエ(Saccaromyces cerevisiae)AH22,AH22R-,NA87−11A,DKD−5D,20B−12などが用いられる。
【0025】昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー(Nature),315巻,592(1985)〕。動物細胞としては、たとえばサル細胞COS−7,Vero細胞,チャイニーズハムスター細胞CHO,dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHO(dhfr-CHO細胞),ヒトFL細胞,293細胞,L細胞,ミエローマ細胞,C127細胞,Balb/c3T3細胞,Sp−2/O細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),69巻,2110(1972)やジーン(Gene),17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なわれる。バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecular & General Genetics),168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行われる。酵母を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl.Acad. Sci. USA),75巻,1929(1978)に記載の方法に従って行なわれる。昆虫細胞を形質転換するには、たとえばバイオ/テクノロジー(Bio/Technology),6, 47-55(1988))などに記載の方法に従って行なわれる。動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー(Virology),52巻,456(1973)に記載の方法に従って行なわれる。
【0026】以上の宿主細胞の中でも、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAを含有する発現プラスミドの宿主細胞としては、特に、動物細胞などが好ましく、例えば293細胞、CHO細胞、L細胞、ミエローマ細胞、C127細胞、Balb/c3T3細胞、Sp-2/O細胞などが挙げられ、なかでもCHO細胞またはSp-2/O細胞などが好ましく、特にCHO細胞などが好適である。さらに、CHO細胞のなかでも、dhfr遺伝子が欠損しているCHO細胞(以下、CHO(dhfr-)細胞と略称する場合がある)、CHO K−1細胞などが好ましい。発現プラスミド中に選択マーカーとしてdhfr遺伝子が挿入されている場合は、CHO(dhfr-)細胞などが好適である。発現プラスミドと宿主細胞の組み合わせとしては、適宜好ましい組み合わせを選択することができるが、例えば、pTS861で標示される発現プラスミド〔図4〕の宿主細胞としては、例えばCHO(dhfr-)細胞などが好適である。この発現プラスミドの動物細胞への導入方法としては、公知の方法、例えばリン酸カルシウム法〔Graham, F. L. and van der Eb, A. J. ヴィロロジー(Virology) 52, 456-467 (1973)〕、電気穿孔法〔Neumann, E. et al. エンボ・ジャーナル(EMBO J.) 1, 841-845 (1982)〕等が用いられる。以上のようにして、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAを含有するベクターで形質転換された形質転換体が得られる。また、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAを含有する発現プラスミドで形質転換された形質転換体は、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を製造することができる。
【0027】ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を高発現できる細胞は、前述の発現プラスミドが染色体に組込まれた細胞をクローン選択によって選択することによって得ることができる。具体的には、まず、上記の選択マーカーを指標として形質転換体を選択する。さらに、このようにして選択マーカーを用いて得られた形質転換体に対して、繰り返しクローン選択を行うことにより、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の高発現能を安定に有する細胞株を得ることができる。また、dhfr遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、メソトレキセート(MTX)の濃度を漸次上げて培養して耐性細胞を選択することにより、導入遺伝子を細胞内で増幅することにより、さらに高発現の細胞株を得ることもできる。なお、宿主としてCHO(dhfr-)細胞を用いた場合であっても、例えばpTS861で標示される発現プラスミドにはdhfr遺伝子が導入されているので〔図4〕、pTS861で標示される発現プラスミドを含有するCHO(dhfr-)細胞は、結果として、dhfr遺伝子を有していることになる。本願明細書においては、dhfr遺伝子を含有する発現プラスミド(例えば、pTS861など)をCHO(dhfr-)細胞に含有せしめて得られるCHO細胞を「CHO(dhfr+)細胞」と表記する場合がある。
【0028】本発明において、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAを高発現できる形質転換体としては、例えば、後述する実施例2で得られるpTS861で標示される発現プラスミドをCHO(dhfr-)細胞に含有せしめて得られるCHO(dhfr+)細胞などが挙げられる。具体的には、CHO/pTS861-1-2E6で標示されるCHO(dhfr+)細胞、CHO/pTS861-24-2C5で標示されるCHO(dhfr+)細胞などが挙げられる。これらのCHO(dhfr+)細胞は、公知のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を発現するCOS-7細胞〔Vita, N. et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317, 139-142 (1993)〕に比べて、大量のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を発現することができ、さらには、天然のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する組織(例えば、ヒトadenocarcinomaHT−29細胞など)に比べて、約10〜100倍、好ましくは約100倍のレセプター活性(例えば、リガンド結合活性など)を有するものである。したがって、これらのCHO(dhfr+)細胞は、後述するヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニスト/アンタゴニストのスクリーニング方法に有効なものである。
【0029】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質および本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞は、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNAを含有するベクター(特に、発現プラスミド)を含有する形質転換体を、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAの発現が可能な条件下で培養することによっても製造することができる。宿主細胞がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experiments in Molecular Genetics),431−433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば3β−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【0030】宿主細胞がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で約3〜24時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主細胞がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主細胞が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostian, K. L. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),77巻,4505(1980)〕や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitter, G. A. ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地のpHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主細胞が昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium(Grace, T.C.C.,ネイチャー(Nature),195,788(1962))に非働化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【0031】宿主細胞が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約0.5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地〔サイエンス(Seience),122巻,501(1952)〕,DMEM培地〔ヴィロロジー(Virology),8巻,396(1959)〕,RPMI 1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(The Jounal of the American MedicalAssociation)199巻,519(1967)〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of the Society for the Biological Medicine),73巻,1(1950)〕,α-MEM培地などが用いられる。特に、CHO(dhfr-)細胞およびdhfr選択マーカー遺伝子を用いる場合、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むDMEM培地あるいはα-MEM培地を用いるのが好ましい。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、撹拌などを加える。このようにして、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAを含有するベクター(特に、発現プラスミド)を保持する形質転換体からヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞を製造することができる。上記した本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞の培養物からヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質またはその部分ペプチドを分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
【0031】まず、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤や、トリトンX−100(登録商標。以下、TMと省略することがある。)などの界面活性剤が含まれていてもよい。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的新和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。かくして得られるヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
【0032】なお、組換え体が産生するヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。かくして生成するヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の活性は標識したニューロテンシンなどとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。なお、上記の手法において、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAに代えて、公知のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNA〔Vita, N. et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317,139-142 (1993)〕を用いることによって、組換え型ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を高発現する細胞や組換え型ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を単離することができる。公知のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質はCOS-7で発現されているが〔Vita, N. et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317, 139-142 (1993)〕、一般にCOS-7での発現量は少ない。しかし、本発明の発現プラスミドの構築方法に従えば、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を高発現する細胞(特に、CHO細胞)だけでなく、公知のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を高発現する細胞(特に、CHO細胞)を製造することができる。
【0033】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞の細胞膜画分は、上記のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、例えば、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン(Kinematica社製)による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速(500rpm〜3000rpm)で短時間(通常、約1分〜10分)遠心し、上清をさらに高速(15000rpm〜30000rpm)で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞やその細胞膜画分中のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の量は、1細胞当たり103〜108分子であるのが好ましく、105〜107分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性(比活性)が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【0034】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドおよびヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAは、■抗体および抗血清の入手、■組換え型レセプター蛋白質の発現系の構築、■同発現系を用いたレセプター結合アッセイ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、■構造的に類似したリガンド・レセプターとの比較にもとづいたドラッグデザインの実施、■遺伝子診断におけるプローブ、PCRプライマーの作製、■遺伝子治療などに用いることができる。特に、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の発現系を用いたレセプター結合アッセイ系によって、ヒトに特異的なヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタゴニストをニューロテンシンに起因する各種疾病の予防・治療剤などとして使用することができる。本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質部分ペプチド、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNA用途について、以下により具体的に説明する。
【0035】(1)ヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩、または本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分は、ヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングに有用である。すなわち、本発明は、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩、または本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分を用いることを特徴とするヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。
【0036】より具体的には、本発明は、(I)(i)本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ニューロテンシンを接触させた場合と(ii)本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に、ニューロテンシンおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、および(II)(i)本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に、ニューロテンシンを接触させた場合と(ii)本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に、ニューロテンシンおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。
【0037】具体的には、本発明のスクリーニング方法(I)および(II)においては、(i)と(ii)の場合における、例えば該ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプチドもしくはそれらの塩、またはヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有するCHO細胞もしくはその細胞膜画分に対するニューロテンシンの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とするものである。より具体的には、本発明は、(Ia)(i)標識したニューロテンシンを、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に接触させた場合と、(ii)標識したヒト・ニューロテンシンおよび試験化合物を、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に接触させた場合における、標識したニューロテンシンの該レセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、【0038】(IIa)(i)標識したニューロテンシンを、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、(ii)標識したニューロテンシンおよび試験化合物を、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、標識したニューロテンシンの該細胞またはその細胞膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法、および(IIb)(i)ニューロテンシンを、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合と、(ii)ニューロテンシンおよび試験化合物を、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分に接触させた場合における、ヒト・ニューロテンシンレセプターを介した細胞刺激活性(例えば、ドーパミンの遊離、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+濃度の変動、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下、細胞の遊走活性などを促進する活性または抑制する活性など)を測定し、比較することを特徴とするヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を提供する。
【0039】上記の(Ia)または(IIa)のスクリーニング方法において、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質に結合して、ニューロテンシンとヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質との結合を阻害する化合物がヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストとして選択できる。さらに、上記(IIb)のスクリーニング方法において、ヒト・ニューロテンシンレセプターに結合し、該レセプターを介して細胞刺激活性(例えば、ドーパミンの遊離、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+濃度の変動、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下、細胞の遊走活性などを促進する活性または抑制する活性など)を有する化合物をヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストとして選択することができる。一方、上記の(Ia)または(IIa)のスクリーニング方法において、ニューロテンシンとヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質との結合を阻害する活性が認められた試験化合物の中で、該細胞刺激活性を有しない化合物をヒト・ニューロテンシンレセプターアンタゴニストとして選択することができる。
【0040】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞が得られる以前は、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を高発現できる細胞がなかったため、ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストを効率良くスクリーニングすることができなかった。本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。リガンドとして使用するニューロテンシンとしては、市販のものなどを用いることができる。また、ニューロテンシンの代わりに、公知のニューロテンシンレセプターアゴニストやアンタゴニストなどを使用することもできる。標識したニューロテンシンとしては、例えば、〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕などで標識したニューロテンシンなどを用いることができ、さらには、〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕などで標識した公知のニューロテンシンアゴニストやアンタゴニストなどを用いることもできる。例えば、〔125I〕で標識されたニューロテンシン(アマシャム社)などが好適である。試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【0041】具体的には、上記の(1a)または(2a)のスクリーニング方法を実施するには、まず、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分、あるいはヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質またはその部分ペプチドを、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、pH約4〜10(望ましくは、pH約6〜8)のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどの、ニューロテンシンとレセプターとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、CHAPS、Tween−80TM(花王−アトラス社)、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的で、PMSF、ロイペプチン、バシトラシン、アプロチニン、E−64(ペプチド研究所製)、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。そして、試験化合物を同バッファーに懸濁した10-4M〜10-10Mの試験化合物溶液を反応チューブに入れ、そして、0.01ml〜10mlの該レセプター溶液を添加する。
【0042】さらに、一定量(例えば、2000Ci/mmolの場合、約10000cpm〜1000000cpm)の標識したニューロテンシン(例えば、〔125I〕ニューロテンシン)を添加する。非特異的結合量(NSB)を知るために大過剰の未標識のニューロテンシンを加えた反応チューブも用意する。反応は0℃から50℃、望ましくは4℃から37℃で20分から24時間、望ましくは30分から3時間行なう。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性(例えば、〔125I〕の量)を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで測定する。濾過には、マニホールドやセルハーベスターを用いることができるが、セルハーベスターを用いることが効率を上げるために望ましい。拮抗する物質がない場合のカウント(B0)から非特異的結合量(NSB)を引いたカウント(B0−NSB)を100%とした時、特異的結合量(B−NSB)が、例えばカウント(B0−NSB)の50%以下になる試験化合物をアゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。
【0043】具体的には、次のような手順で操作を行なう。
(i)50mM Tris-HCl、5mM MgCl2、500μM オルトフェナントロリン、200μM バシトラシン、0.2% BSA、pH7.4の反応バッファーを作製する。
(ii)反応バッファーに試験化合物を懸濁した試験化合物溶液2μlを氷上で反応チューブに入れる。試験化合物の最終濃度を100μMに調製する。
(iii)−80℃で凍結乾燥してあるヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞膜画分を室温に戻し、軽くボルテックスした後、適当な濃度に希釈し、細胞膜画分溶液を調製する(例えば、1.5mgタンパク/ml(ウシ脳膜画分)、100μgタンパク/ml(ヒトadenocarcinomaHT−29細胞膜画分)など)。この細胞膜画分溶液をcell strainerに通した後、反応チューブに分注器で200μl分中する。
(iv)反応バッファーに希釈した〔125I〕ニューロテンシン(IM-163、アマシャム社)を2μlずつ氷上で反応チューブに入れる。
(v)25℃で90分間反応を行なう。
(vi)マニホールドを使用し、B/F分離を行なう。この時に使用するフィルター(GF/F、ワットマン社)はあらかじめPEI液(20mM Tris-HCl、0.3% ポリエチレンイミド)、pH7.4)に1時間以上浸しておく。
(vii)フィルターをγ−カウンターでカウントする。特異的結合を40〜50%以上阻害した化合物を±、50%以上阻害した化合物を+と評価する。
【0044】また、上記(2b)のスクリーニング方法を実施するためには、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を介する細胞刺激活性(例えば、ドーパミンの遊離、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+濃度の変動、細胞内cAMP生成、細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、c−fos活性化、pHの低下、細胞の遊走活性などを促進する活性または抑制する活性など)を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質(例えば、アラキドン酸など)の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、cAMP産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
【0045】本発明のスクリーニング用キットは、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩、または本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を含有するものである。本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
〔スクリーニング用試薬〕
■測定用緩衝液および洗浄用緩衝液0.01%のウシ血清アルブミン、1mM オルソフェナントロリン、20mMHEPESを加えたDMEM培地を水酸化ナトリウムでpH7.0に調製したもの。孔径0.22μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
■ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質標品ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞を、12穴プレートに5×105個/穴で継代し、37℃、5%CO2、95%airでコンフルエントになるまで培養したもの。
■標識ニューロテンシン市販の〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕などで標識したニューロテンシン溶液の状態のものを4℃あるいは−20℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて1μMに希釈する。
■ニューロテンシン標準液ニューロテンシンを滅菌水で10-4Mとなるように溶解し、−20℃で保存する。
【0046】〔測定法〕
■12穴組織培養用プレートにて培養したヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞を、測定用緩衝液1mlで1〜2回程度洗浄した後、4℃に冷やした測定用緩衝液1mlを加えて4℃で10分間保温した。
■測定用緩衝液を吸い出した後、4℃に冷やした10-3〜10-10Mの試験化合物溶液を5μl加えた後、500pM標識ニューロテンシンを含む測定用緩衝液を0.5ml加え、4℃で3時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物と共に1μMのニューロテンシンを加えておく。
■反応液を除去し、4℃に冷やした1mlの洗浄用緩衝液で3回洗浄する。細胞に結合した標識ニューロテンシンを0.5mlの0.2N NaOHではがした後、γ-カウンターで放射活性を測定し、Percent of Maximum Binding(PMB)を次の式〔数1〕で求める。
【数1】

PMB:Percent of Maximum BindingB :検体を加えた時の値NSB:Non-specific Binding(非特異的結合量)
0 :最大結合量【0047】なお、上記のスクリーニング方法およびスクリーニング用キットにおいては、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプチドおよび本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞もしくはその細胞膜画分の代わりに、公知のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質DNA〔Vita, N. et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317, 139-142 (1993)〕などのDNAから製造した組換え型ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプチドまたは組換え型ヒト。ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞もしくはその細胞膜画分を用いることもできる。
【0049】本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いることによって、ニューロテンシンと本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質との結合を阻害する性質を有する化合物、具体的には、ニューロテンシンレセプターを介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩(いわゆる、ヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニスト)、あるいは該細胞刺激活性を有しない化合物またはその塩(いわゆる、ヒト・ニューロテンシンレセプターアンタゴニスト)を見い出すことができる。ヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストは、ニューロテンシンが有する生理活性の全部または一部を有しているので、該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬組成物として有用である。一方、ヒト・ニューロテンシンレセプターアンタゴニストは、ニューロテンシンが有する生理活性の全部または一部を抑制することができるので、該生理活性を抑制する安全で低毒性な医薬組成物として有用である。具体的には、ヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストはパーキンソン病、鬱病、痴呆症、多動児性症候群もしくは意識障害の予防・治療剤、拒食性誘発剤などとして有用であり、ヒト・ニューロテンシンレセプターアンタゴニストは逆行性食道炎、腸炎、すい炎、潰瘍、胃癌、腸癌、精神病、ハンチントン病もしくは躁病の予防・治療剤、抗不安剤、催眠鎮静剤などとして有用である。
【0050】本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られるアゴニストまたはアンタゴニストを上述の医薬組成物として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
【0051】注射用の水溶液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリウムなど)などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール(たとえばエタノール)、ポリアルコール(たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤(たとえばポリソルベート80(TM)、HCO−50)などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血哺乳動物(例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど、特にヒト)に対して投与することができる。該アゴニストまたはアンタゴニストの投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人(60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では通常成人(60kgとして)においては、一日につき約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
【0052】(2)ニューロテンシンレセプター蛋白質欠乏症の予防・治療剤本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAは、ニューロテンシンレセプター蛋白質欠乏症の予防・治療剤として使用することができる。例えば、生体内において本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質が減少しているためにニューロテンシンの生理作用が期待できない患者がいる場合に、(イ)本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAを該患者に投与し、生体内で該ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質発現させることによって、あるいは(ロ)脳細胞などに本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAを挿入し、該ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を発現させた後に、該脳細胞を該患者に移植することなどによって、該患者の脳細胞におけるヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の量を増加させ、ニューロテンシンの作用を充分に発揮させることができる。したがって、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAは、安全で低毒性な本発明のニューロテンシンレセプター蛋白質欠乏症(例えば、パーキンソン病など)の予防・治療剤などとして用いることができる。
【0053】本発明のDNAを上記の予防・治療剤として使用する場合は、該DNAを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のDNAを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【0054】錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリウムなど)などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール(たとえばエタノール)、ポリアルコール(たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤(たとえばポリソルベート80(TM)、HCO−50)などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
【0055】また、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。調整された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血哺乳動物(例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ヒトなど、特にヒト)に対して投与することができる。該DNAの投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人(60kgとして)においては、一日につき約0.1mg〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では通常成人(60kgとして)においては、一日につき約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
【0056】(3)ニューロテンシンの定量法本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩、または本発明の部分ペプチドまたはその塩は、ニューロテンシンに対して結合性を有しているので、生体内におけるニューロテンシン濃度を感度良く定量することができる。すなわち、本発明は、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩または本発明の部分ペプチドまたはその塩と、被検体とを接触させることを特徴とする被検体中のニューロテンシン濃度の定量法を提供する。本発明の定量法は、例えば競合法と組み合わせることによって用いることができる。具体的には、例えば、以下の■または■などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いることができる。
■入江寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和49年発行)
■入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和54年発行)
さらに、本発明のニューロテンシンの定量法は、ニューロテンシン濃度の増減に起因する疾病(例えば、パーキンソン病、鬱病、痴呆症、多動児性症候群、意識障害、拒食症、逆行性食道炎、腸炎、すい炎、潰瘍、胃癌、腸癌、精神病、ハンチントン病、躁病、不安など)の診断方法としても使用できる。
【0057】(4)本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩または本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に対する抗体または抗血清の製造本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩または本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩に対する抗体(例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体)または抗血清は、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩または本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。例えば、モノクローナル抗体は、後述の方法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
(a)モノクロナール抗体産生細胞の作製本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質もしくはその塩または本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質の部分ペプチドもしくはその塩(以下、ヒト・ニューロテンシンレセプターと略称する場合がある)は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常2〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、たとえばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
【0058】モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば後記の標識化ヒト・ニューロテンシンレセプターと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー(Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコール(PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。骨髄腫細胞としてはたとえばNS−1、P3U1、SP2/0、AP−1などがあげられるが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞(脾臓細胞)数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程度であり、PEG(好ましくはPEG1000〜PEG6000)が10〜80%程度の濃度で添加され、20〜40℃、好ましくは30〜37℃で1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【0059】抗ヒト・ニューロテンシンレセプター抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、たとえばヒト・ニューロテンシンレセプター抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相(例、マイクロプレート)にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体(細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる)またはプロテインAを加え、固相に結合した抗ヒト・ニューロテンシンレセプターモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインAを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したヒト・ニューロテンシンレセプターを加え、固相に結合した抗ヒト・ニューロテンシンレセプターモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。抗ヒト・ニューロテンシンレセプターモノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加した動物細胞用培地で行なわれる。選別および育種用培地としては、ハイビリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、1〜20%、好ましくは10〜20%の牛胎児血清を含むRPMI 1640培地、1〜10%の牛胎児血清を含むGIT培地(和光純薬工業(株))あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地(SFM−101、日水製薬(株))などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常5日〜3週間、好ましくは1週間〜2週間である。培養は、通常5%炭酸ガス下で行なわれる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗ヒト・ニューロテンシンレセプター抗体価の測定と同様にして測定できる。
【0060】(b)モノクロナール抗体の精製抗ヒト・ニューロテンシンレセプターモノクローナル抗体の分離精製は通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体(例、DEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインAあるいはプロテインGなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われる。以上の(1)および(2)の方法に従って製造させる本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター抗体は、ヒト・ニューロテンシンレセプターを特異的に認識することができるので、被検液中のヒト・ニューロテンシンレセプターの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、(i)本発明のヒト・ニューロテンシンレセプターに反応する抗体と、被検液および標識化ヒト・ニューロテンシンレセプターとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化ヒト・ニューロテンシンレセプターの割合を測定することを特徴とする被検液中のヒト・ニューロテンシンレセプターの定量法、(2)被検液と担体上に不溶化した抗体および標識化された抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中のヒト・ニューロテンシンレセプターの定量法において、一方の抗体がヒト・ニューロテンシンレセプターのN端部を認識する抗体で、他方の抗体がヒト・ニューロテンシンレセプターのC端部に反応する抗体であることを特徴とする被検液中のヒト・ニューロテンシンレセプターの定量法を提供する。
【0061】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプターを認識するモノクローナル抗体(以下、抗ヒト・ニューロテンシンレセプター抗体と称する場合がある)を用いてヒト・ニューロテンシンレセプターの測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab')2 、Fab'、あるいはFab画分を用いてもよい。本発明の抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量(例えばヒト・ニューロテンシンレセプター量)に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが、上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が、蛍光物質としては、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物質としては、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【0062】抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては不溶化した抗ヒト・ニューロテンシンレセプター抗体に被検液を反応させ(1次反応)、さらに標識化抗ヒト・ニューロテンシンレセプター抗体を反応させ(2次反応)たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中のヒト・ニューロテンシンレセプター量を定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。本発明のサンドイッチ法によるヒト・ニューロテンシンレセプターの測定法においては、1次反応と2次反応に用いられる抗ヒト・ニューロテンシンレセプター抗体はヒト・ニューロテンシンレセプターの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、1次反応および2次反応に用いられる抗体は、例えば、2次反応で用いられる抗体が、ヒト・ニューロテンシンレセプターのC端部を認識する場合、1次反応で用いられる抗体は、好ましくはC端部以外、例えばN端部を認識する抗体が用いられる。
【0063】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(F)と抗体と結合した標識抗原(B)とを分離し(B/F分離)、B,Fいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第2抗体などを用いる液相法、および、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第1抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【0064】これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてヒト・ニューロテンシンレセプターの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ〕(講談社、昭和49年発行)、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ〕(講談社、昭和54年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(医学書院、昭和53年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)(医学書院、昭和62年発行)、「Methods in ENZYMOLOGY Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。以上のように、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター抗体を用いることによって、ヒト・ニューロテンシンレセプターを感度良く定量することができる。
【0065】本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。
DNA :デオキシリボ核酸cDNA :相補的デオキシリボ核酸A :アデニンT :チミンG :グアニンC :シトシンRNA :リボ核酸mRNA :メッセンジャーリボ核酸dATP :デオキシアデノシン三リン酸dTTP :デオキシチミジン三リン酸dGTP :デオキシグアノシン三リン酸dCTP :デオキシシチジン三リン酸【0066】
ATP :アデノシン三リン酸EDTA :エチレンジアミン四酢酸SDS :ドデシル硫酸ナトリウムEIA :エンザイムイムノアッセイGly :グリシンAla :アラニンVal :バリンLeu :ロイシンIle :イソロイシンSer :セリンThr :スレオニンCys :システインMet :メチオニンGlu :グルタミン酸Asp :アスパラギン酸【0067】
Lys :リジンArg :アルギニンHis :ヒスチジンPhe :フェニルアラニンTyr :チロシンTrp :トリプトファンPro :プロリンAsn :アスパラギンGln :グルタミンpGlu :ピログルタミン酸Me :メチル基Et :エチル基Bu :ブチル基Ph :フェニル基TC :チアゾリジン−4(R)−カルボキサミド基【0068】本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号:1〕本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:2〕本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:3〕本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするcDNAのスクリーニングに使用した合成DNA〔配列番号:4〕本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質をコードするcDNAのスクリーニングに使用した合成DNA【0069】後述の実施例2で得られたプラスミドpTS861を保持する形質転換体エシェリヒア コリ(Escherichia coli) DH10B/pTS861は、平成6年11月24日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(NIBH)に寄託番号FERM BP− 4898として寄託されている。また、後述の実施例3で得られたプラスミドpTS861を保持する形質転換体CHO/pTS861-1-2E6は、平成6年11月24日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所(NIBH)に寄託番号FERM BP− 4899として寄託されている。
【0070】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明がそれに限定されるものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、成書(Maniatisら、モレキュラー・クローニング〔Molecular Cloning〕、Cold Spring Harbor Laboratory、1989年)に記載されている方法に従った。
【0071】
【実施例1】ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAのクローニングヒト colon adenocarcinoma HT-29細胞を10%ウシ胎児血清を含む高グルコースDMEM培地を用いて37℃、95% air/5%CO2条件下で培養し、ほぼコンフルエントになったところで、グアニジン-イソチオシアネート法によって全RNAを調製した。ここで得られた全RNAからオリゴ(dT)セルロースカラムによってポリA+RNA画分を調製した。このポリA+RNA10μgをランダムヘキサマーと逆転写酵素を用いて first strand DNAを合成した後、E. coli DNA polymerase I、RNase Hを用いて second strand DNAを合成し、ポリA+RNAから二本鎖cDNAを得た。この二本鎖DNAをT4 DNA polymerase で処理し末端を平滑化した後、EcoRIアダプターを付加した。この両末端にEcoRIアダプターが付加された二本鎖DNAをゲル濾過によって、約400bp以下のcDNAを除去した後、T4 polynucleotide kinase を用いてEcoRIアダプターにリン酸基を導入した。次に、このcDNAをλgt11 EcoRIアームに組み込んだ後、in vitro パッケージングを行ない、全体で約3×106pfuのHT-29細胞のcDNAライブラリーを作製した。このcDNAライブラリーのλファージを大腸菌Y1090株に感染させた後、軟寒天プレート上に約1×104プラークずつまき、42℃で一晩インキュベートしてプラークを形成させた。プラークをニトロセルロースフィルター上に移した後、変性溶液〔0.5N 水酸化ナトリウム,1.5M 塩化ナトリウム〕、中和溶液〔0.5M トリス-塩酸(pH 7.0), 1.5M 塩化ナトリウム〕、3×SSC〔20×SSC=3M 塩化ナトリウム, 0.3M クエン酸ナトリウム〕で順次処理し、風乾後80℃で3時間焼き付けを行ない、ファージDNAをニトロセルロースフィルター上に固定した。
【0072】一方、プローブとして用いるために公知のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNA〔Vita, N. et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317, 139-142 (1993)〕の塩基配列に基づき合成オリゴヌクレオチド■および■を合成した。■は5'−CGGACAGAGCCGCGGGACTCCAGCGCCCACCATGCGCCTCA−3'(配列番号:3)であり、−30〜+10(翻訳開始部位を+1とする。)センス配列を含む合成オリゴヌクレオチドである。■は5'−TCCTCCTGGACACGTTCCGGGGCGCACAGC−3'(配列番号:4)であり+1258〜+1287のアンチセンス配列を含む合成オリゴヌクレオチドである。これら■および■の合成オリゴヌクレオチドを、〔γ-32P〕ATPとT4 polynucleotide kinase を用いることによって標識した。ファージDNAを固定したフィルターを■,■両方の合成オリゴヌクレオチド標識プローブを含むハイブリダイゼーション用緩衝液〔2×SSC, 10× Denhardt's液, 150μg/ml熱変性サケ精子DNA, 670μg/ml酵母RNA〕中58℃でハイブリダイゼーションを行なった。フィルターは最終的に2×SSC,0.1% SDS液中55℃で洗浄後、オートラジオグラムをとってプローブとハイブリダイゼーションするプラークを検索した。
【0073】この方法により得られたファージクローンλhNTR84からファージDNAを抽出した後、制限酵素EcoRIで消化してcDNA断片を切り出し、pUC118プラスミドのEcoRI部位に挿入してphNTR84-14を得た。挿入されているcDNA断片の塩基配列を〔α-32P〕dCTPを用いて通常の方法で決定したところ、このcDNA断片は配列番号:2で表わされる塩基配列を有する2141bpから成ることがわかった。報告されているヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAの塩基配列〔Vita, N. et al. フェブス・レター(FEBS Lett.) 317, 139-142 (1993)〕と比較すると3カ所の塩基置換が見られた。1カ所は〔図2〕の第360番目の塩基T→A、2カ所目は〔図2〕の第920番目のA→G、3カ所目は〔図2〕の第1329番目の塩基A→Gであった。このうち、2カ所目と3カ所目の塩基置換は翻訳領域の中にあり、2カ所目の置換はサイレントな変異63Lys(AAA)→63Lys(AAG)であったが、3カ所目の変異はアミノ酸置換を伴うもの200Thr(ACG)→200Ala(GCG)であった〔配列番号:1および図1〕。以上のようにして、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNA断片を含むプラスミドphNTR84-14を得た。
【0074】
【実施例2】ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAの発現プラスミドの構築実施例1で得たヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNA断片を含むプラスミドphNTR84-14から、〔図3〕のようにしてヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNA発現プラスミドを作製した。まず、phNTR84-14を制限酵素SacIIで消化し、得られた約440bpのDNA断片をT4 DNA polymerase 処理を行って平滑末端化した後、EcoRIリンカーを付加した。次に、このDNA断片をEcoRIで消化した後、pUC119プラスミドのEcoRI部位に導入し、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAの翻訳領域のN末端部分をサブクローニングした。次に、DNAメチラーゼ欠損株の大腸菌SCS110(dam-,dcm-)から取得したヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNA断片を含むプラスミドphNTR84-14を制限酵素StuIで消化した後、XbaIリンカーを付加し、次に、XbaI、MluIの二重消化を行ない、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAの翻訳領域のC末端部分を含む約1.4kbp DNA断片を得た。
【0075】このヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAの翻訳領域のC末端部分を含む約1.4kbp XbaI、MluI断片を、上記で得たヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAの翻訳領域のN末端部分をサブクローニングしたプラスミドのXbaI、MluI部位に導入し、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAのほぼ翻訳領域のみをサブクローニングしたプラスミドpTS858を得た。さらに、翻訳領域のN末端部分にSalI部位を導入するために、pTS858をEcoRI、HindIIIの二重消化したDNA断片をpGEM9Zf(-)のEcoRI、HindIII部位に導入したプラスミドpTS859を得た。
【0076】発現ベクターとしてはpAKKO 1.11(図3ではpA1-11と表記されている)を用いた。pAKKO 1.11は次のようにして構築した。特開平5−076385公報に記載のpTB1417からHindIIIおよびClaI処理によってSRαプロモーターおよびpolyA付加シグナルを含む1.4kbのDNA断片を得た。また、pTB348(Naruo, K. et al. バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commun.)128, 256-264(1985))からClaIおよびSalI処理によりジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を含む4.5kbのDNA断片を得た。これらのDNA断片をT4ポリメラーゼ処理により末端を平滑末端にした後、T4ライゲースにより連結し、pAKKO 1.11プラスミドを構築した。プラスミドpTS859をSalI消化して得られた約1.4kbpのヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAの翻訳領域を含むSalI DNA断片をpAKKO 1.11のSalI部位に順方向に導入し、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNA発現プラスミドpTS861を得た。この発現プラスミドpTS861を大腸菌に形質転換し、形質転換体 エシェリヒア コリ(Escherichia coli)DH10B/pTS861を得た。
【0077】
【実施例3】ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNAのCHO(dhfr-)細胞での発現CHO(dhfr-)細胞5×104〜1×106細胞を段階的に細胞数を変えて直径10cmのシャーレに4枚まき、10%ウシ胎児血清を含むハムF12培地で24時間培養した。この細胞に、実施例1で得たヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質cDNA発現プラスミドpTS861 1.5μgをリン酸カルシウム法を用いてトランスフェクションを行なった。トランスフェクション後24時間後に10%透析ウシ胎児血清を含むDMEM培地に培地を交換してプラスミドが染色体に組み込まれた細胞を選択した。選択された細胞のコロニーをクローニングした後、さらに、限界希釈法によって単一細胞からクローニングし、ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を安定に高発現する細胞株CHO/pTS861-1-2E6、CHO/pTS861-24-2C5の2クローンを得た。
【0078】
【実施例4】ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質活性の測定ヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質発現細胞を12穴プレートにまき、10%透析ウシ胎児血清を含むDMEM培地を用いて37℃、95% air/5%CO2条件下でコンフルエントになるまで培養し、結合実験を行う前日に培地交換を行なった。〔125I〕ニューロテンシンに対する結合実験は以下のようにして行った。まず、細胞を37℃に暖めた結合測定用緩衝液(0.1% BSA,1mM オルソフェナントロリン,20mM HEPESを含むDMEM培地を水酸化ナトリウムを用いてpH7.4にあわせたもの)1mlで1回洗浄した後、4℃に冷やした結合測定用緩衝液1mlを加えて4℃で10分保温した。この結合測定用緩衝液を吸い出した後、4℃に冷やした500pM〔125I〕ニューロテンシンを含む結合測定用緩衝液0.5mlを加え、4℃で3時間結合反応を行なった。反応終了後、結合測定用緩衝液を除き、4℃に冷やした1mlのPBS緩衝液で3回洗浄した。細胞に結合した〔125I〕ニューロテンシンの量は、0.2N 水酸化ナトリウムで細胞をはがした後、γ-カウンターで測定し、これを総結合量とした。また、結合反応時に1μMの非標識ニューロテンシンを加えて同様の操作を行い、細胞に結合した〔125I〕ニューロテンシンの量を非特異的結合量とした。結果を、〔表1〕に示す。
【0079】
【表1】

〔表1〕から、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を安定に高発現する細胞株CHO/pTS861-1-2E6およびCHO/pTS861-24-2C5が、リガンドであるニューロテンシンと特異的に結合できることが確認された。
【0080】
【発明の効果】本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質は、公知のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する新規な蛋白質である。また、本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する発現ベクターを保持する細胞(特に、CHO細胞)は、公知のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有するCOS-7細胞に比べて、はるかに大量のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を発現することができる。本発明のヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質、その部分ペプチドまたはヒト・ニューロテンシンレセプター蛋白質を含有する細胞もしくはその細胞膜画分は、ヒト・ニューロテンシンレセプターアゴニストまたはアンタゴニストを効率良くスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法によれば、アゴニストまたはアンタゴニストを有利に選択することができるので、例えば、パーキンソン病、鬱病、痴呆症、多動児性症候群もしくは意識障害の予防・治療剤、拒食性誘発剤、抗不安剤、催眠鎮静剤、または逆行性食道炎、腸炎、すい炎、潰瘍、胃癌、腸癌、精神病、ハンチントン病もしくは躁病の予防・治療剤などの医薬品を早期に開発することができる。
【0081】
【配列表】
【配列番号:1】
配列の長さ:418配列の型:アミノ酸トポロジー:直鎖状配列の種類:ペプチド配列Met Arg Leu Asn Ser Ser Ala Pro Gly Thr Pro Gly Thr Pro Ala Ala 1 5 10 15 Asp Pro Phe Gln Arg Ala Gln Ala Gly Leu Glu Glu Ala Leu Leu Ala 20 25 30 Pro Gly Phe Gly Asn Ala Ser Gly Asn Ala Ser Glu Arg Val Leu Ala 35 40 45 Ala Pro Ser Ser Glu Leu Asp Val Asn Thr Asp Ile Tyr Ser Lys Val 50 55 60 Leu Val Thr Ala Val Tyr Leu Ala Leu Phe Val Val Gly Thr Val Gly 65 70 75 80 Asn Thr Val Thr Ala Phe Thr Leu Ala Arg Lys Lys Ser Leu Gln Ser 85 90 95 Leu Gln Ser Thr Val His Tyr His Leu Gly Ser Leu Ala Leu Ser Asp 100 105 110 Leu Leu Thr Leu Leu Leu Ala Met Pro Val Glu Leu Tyr Asn Phe Ile 115 120 125 Trp Val His His Pro Trp Ala Phe Gly Asp Ala Gly Cys Arg Gly Tyr 130 135 140 Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Cys Thr Tyr Ala Thr Ala Leu Asn Val Ala 145 150 155 160 Ser Leu Ser Val Glu Arg Tyr Leu Ala Ile Cys His Pro Phe Lys Ala 165 170 175 Lys Thr Leu Met Ser Arg Ser Arg Thr Lys Lys Phe Ile Ser Ala Ile 180 185 190 Trp Leu Ala Ser Ala Leu Leu Ala Val Pro Met Leu Phe Thr Met Gly 195 200 205 Glu Gln Asn Arg Ser Ala Asp Gly Gln His Ala Gly Gly Leu Val Cys 210 215 220 Thr Pro Thr Ile His Thr Ala Thr Val Lys Val Val Ile Gln Val Asn 225 230 235 240 Thr Phe Met Ser Phe Ile Phe Pro Met Val Val Ile Ser Val Leu Asn 245 250 255 Thr Ile Ile Ala Asn Lys Leu Thr Val Met Val Arg Gln Ala Ala Glu 260 265 270 Gln Gly Gln Val Cys Thr Val Gly Gly Glu His Ser Thr Phe Ser Met 275 280 285 Ala Ile Glu Pro Gly Arg Val Gln Ala Leu Arg His Gly Val Arg Val 290 295 300 Leu Arg Ala Val Val Ile Ala Phe Val Val Cys Trp Leu Pro Tyr His 305 310 315 320 Val Arg Arg Leu Met Phe Cys Tyr Ile Ser Asp Glu Gln Trp Thr Pro 325 330 335 Phe Leu Tyr Asp Phe Tyr His Tyr Phe Tyr Met Val Thr Asn Ala Leu 340 345 350 Phe Tyr Val Ser Ser Thr Ile Asn Pro Ile Leu Tyr Asn Leu Val Ser 355 360 365 Ala Asn Phe Arg His Ile Phe Leu Ala Thr Leu Ala Cys Leu Cys Pro 370 375 380 Val Trp Arg Arg Arg Arg Lys Arg Pro Ala Phe Ser Arg Lys Ala Asp 385 390 395 400 Ser Val Ser Ser Asn His Thr Leu Ser Ser Asn Ala Thr Arg Glu Thr 405 410 415 Leu Tyr 【0082】
【配列番号:2】
配列の長さ:1254配列の型:核酸鎖の数:二本鎖トポロジー:直鎖状配列の種類:cDNA特徴を決定した方法:S配列ATGCGCCTCA ACAGCTCCGC GCCGGGAACC CCGGGCACGC CGGCCGCCGA CCCCTTCCAG 60CGGGCGCAGG CCGGACTGGA GGAGGCGCTG CTGGCCCCGG GCTTCGGCAA CGCTTCGGGC 120AACGCGTCGG AGCGCGTCCT GGCGGCACCC AGCAGCGAGC TGGACGTGAA CACCGACATC 180TACTCCAAGG TGCTGGTGAC CGCCGTGTAC CTGGCGCTCT TCGTGGTGGG CACGGTGGGC 240AACACGGTGA CGGCGTTCAC GCTGGCGCGG AAGAAGTCGC TGCAGAGCCT GCAGAGCACG 300GTGCATTACC ACCTGGGCAG CCTGGCGCTG TCCGACCTGC TCACCCTGCT GCTGGCCATG 360CCCGTGGAGC TGTACAACTT CATCTGGGTG CACCACCCCT GGGCCTTCGG CGACGCCGGC 420TGCCGCGGCT ACTACTTCCT GCGCGACGCC TGCACCTACG CCACGGCCCT CAACGTGGCC 480AGCCTGAGTG TGGAGCGCTA CCTGGCCATC TGCCACCCCT TCAAGGCCAA GACCCTCATG 540TCCCGAAGCC GCACCAAGAA GTTCATCAGC GCCATCTGGC TCGCCTCGGC CCTGCTGGCG 600GTGCCTATGC TGTTCACCAT GGGCGAGCAG AACCGCAGCG CCGACGGCCA GCACGCCGGC 660GGCCTGGTGT GCACCCCCAC CATCCACACT GCCACCGTCA AGGTCGTCAT ACAGGTCAAC 720ACCTTCATGT CCTTCATATT CCCCATGGTG GTCATCTCGG TCCTGAACAC CATCATCGCC 780AACAAGCTGA CCGTCATGGT ACGCCAGGCG GCCGAGCAGG GCCAAGTGTG CACGGTCGGG 840GGCGAGCACA GCACATTCAG CATGGCCATC GAGCCTGGCA GGGTCCAGGC CCTGCGGCAC 900GGCGTGCGCG TCCTACGTGC AGTGGTCATC GCCTTTGTGG TCTGCTGGCT GCCCTACCAC 960GTGCGGCGCC TCATGTTCTG CTACATCTCG GATGAGCAGT GGACTCCGTT CCTCTATGAC 1020TTCTACCACT ACTTCTACAT GGTGACCAAC GCACTCTTCT ACGTCAGCTC CACCATCAAC 1080CCCATCCTGT ACAACCTCGT CTCTGCCAAC TTCCGCCACA TCTTCCTGGC CACACTGGCC 1140TGCCTCTGCC CGGTGTGGCG GCGCAGGAGG AAGAGGCCAG CCTTCTCGAG GAAGGCCGAC 1200AGCGTGTCCA GCAACCACAC CCTCTCCAGC AATGCCACCC GCGAGACGCT GTAC 1254【0083】
【配列番号:3】
配列の長さ:41配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列の種類:合成DNA配列CGGACAGAGC CGCGGGACTC CAGCGCCCAC CATGCGCCTC A 41【0084】
【配列番号:4】
配列の長さ:31配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列の種類:合成DNA配列TCCTCCTGGA CACGTTCCG GGGCGCACAG C 31【0085】
【出願人】 【識別番号】000002934
【氏名又は名称】武田薬品工業株式会社
【出願日】 平成6年(1994)11月24日
【代理人】 【弁理士】
【氏名又は名称】朝日奈 忠夫 (外2名)
【公開番号】 特開平8−143597
【公開日】 平成8年(1996)6月4日
【出願番号】 特願平6−289882